一种制备利那洛肽的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710162507.0
(22)申请日 2017.03.18
(71)申请人 南京工业大学
地址 210009 江苏省南京市鼓楼区新模范
马路5号南京工业大学
(72)发明人 苏贤斌　李裴竹　卞亚楠　杨洋　
(74)专利代理机构 南京禹为知识产权代理事务
所(特殊普通合伙) 32272
代理人 王晓东　郭红燕
(51)Int.Cl.
C07K 7/08(2006.01)
(54)发明名称
一种制备利那洛肽的方法
(57)摘要
本发明公开了一种制备利那洛肽的方法，包
括，对含有两对二硫键的利那洛肽中间体进行氧
化反应，得到利那洛肽；其中，所述含有两对二硫
键的利那洛肽中间体，其为存在第2、10位Cys的
二硫键和第5、13位Cys的二硫键。

本发明反应路
线短，原料廉价易得，反应条件温和，减少了能
耗，降低了生产成本。

相比于前人发表的路线，本
路线的反应选择性与转化率均更高，减少了原料
的浪费，有较强的经济性。

本发明提供的制备方
法，最佳反应时间为30min，所得产物纯度可达
85％。

减少了三废的排放，
绿色安全。

权利要求书1页 说明书13页 附图4页CN 106831950 A 2017.06.13
C N 106831950
A
1.一种制备利那洛肽的方法，其特征在于：包括，
对含有两对二硫键的利那洛肽中间体进行氧化反应，得到利那洛肽；
其中，所述含有两对二硫键的利那洛肽中间体，其为存在第2、10位Cys的二硫键和第5、13位Cys的二硫键。

2.如权利要求1所述制备利那洛肽的方法，其特征在于：所述含有两对二硫键的利那洛肽中间体，其为在第1、6位Cys上有保护基团。

3.如权利要求1或2所述制备利那洛肽的方法，其特征在于：所述含有两对二硫键的利那洛肽中间体，其为对利那洛肽线性粗肽进行第2、10位Cys和第5、13位Cys进行氧化成环制得。

4.如权利要求3所述制备利那洛肽的方法，其特征在于：所述利那洛肽线性粗肽，其为在第1、6位Cys上有保护基团。

5.如权利要求4所述制备利那洛肽的方法，其特征在于：所述利那洛肽线性粗肽，其为利那洛肽树脂裂解制得；其中，所述利那洛肽树脂，其为1、6位Cys有共同的保护基团，2、10位和5、13位Cys上有Trt。

6.如权利要求5所述制备利那洛肽的方法，其特征在于：所述氧化成环，pH为6.5～9.5，时间为10～14h。

7.如权利要求2、4、5或6中任一项所述制备利那洛肽的方法，其特征在于：所述保护基团，其为tBu，Meb，Mob中的一种。

8.如权利要求7所述制备利那洛肽的方法，其特征在于：所述保护基团，其为tBu。

9.如权利要求8所述制备利那洛肽的方法，其特征在于：所述氧化反应，包括，其针对tBu，具体为以TFA或5％-20％DMSO中一种或多种为溶剂，温度为15～30℃，时间为25～40min；其针对Meb，具体为以TFA或5％-20％DMSO中一种或多种为溶剂，温度为40～60℃，时间为3～4h；其针对Mob，具体为以体积比为94:5:1的TFA、DMSO、苯甲醚混合剂为溶剂，温度为55～65℃，时间为30min～90min。

10.如权利要求5、6、8或9中任一项所述制备利那洛肽的方法，其特征在于：所述裂解，其为以TFA、EDT、苯甲醚、苯甲硫醚和水为裂解液，其体积比为90:2.5:2.5:2.5:2.5；其利那洛肽树脂同裂解液的体积比为1:8。

权　利　要　求　书1/1页CN 106831950 A
一种制备利那洛肽的方法
技术领域
[0001]本发明属于医药合成技术领域，具体涉及一种制备利那洛肽的方法。

背景技术
[0002]利那洛肽(Linaclotide)是一种口服的选择性鸟苷酸环化酶C受体激动剂，主要作用于肠道，可诱导肠液分泌，用于治疗以便秘为主的肠应激综合症及长期便秘。

其商品名为Linzess，由美国Ironwood Pharma公司研发，2012年8月获美国FDA批准上市。

利那洛肽是鸟苷酸环化酶C(GC-C)激动剂的胶囊制剂，每日口服一次。

血浆浓度检测不到的利那洛肽与肠道GC-C结合后，导致细胞内和细胞外环鸟苷酸(cGMP)浓度升高。

细胞内cGMP升高可以刺激肠液分泌，加快胃肠道移行，从而增加排便频率。

细胞外cGMP浓度升高可以降低痛觉神经的灵敏度，而根据动物模型研究显示，这可减低肠道疼痛。

利那洛肽是首个具有此种作用机制的便秘治疗药物。

[0003]利那洛肽是一个14-氨基酸多肽，含有三个二硫键，其序列结构如下：
[0004]结构式(氨基酸序列)
[0005]
[0006]利那洛肽中三个二硫键的成环反应是本产品合成的难点。

[0007]现有文献报道的合成路线主要有三种：
[0008]方法一：随机氧化(random oxidation)法
[0009]通过常规固相多肽合成方法在树脂上合成线性肽，酸解脱除保护基和树脂载体得到利那洛肽线性粗肽，然后在液相缓冲溶液中，采用随机氧化(random oxidation)的方法一步形成三对二硫键(见反应示意图)。

如专利CN201310556661.8、CN201510314459.3、CN201610739783.4、CN201610644791.0、CN201610328263.4、CN201210375246.8、CN201310223243.7、WO2014188011A2、WO2016038497A1等。

[0010]固相偶联-随机氧化反应示意图如图5所示。

[0011]方法一中,合成只使用了一种Cys的保护基团，最后只需一步随机氧化成环得到目标产物，操作简单。

但是，对于需要定位形成三对二硫键的肽来说，随机氧化会得到许多二硫键错配的异构体，尽管可以通过一些缓冲溶液体系来使得氧化过程中尽可能大的转变为目标分子，但是始终无法避免其他错配异构体的产生。

这种操作容易使得目标肽粗肽纯化困难，不利于产品质量的控制。

同时，采用该方法进行氧化，需要在高度稀释的溶液中，对外界条件比如温度等的依赖性也非常高，在不同的环境下，自然氧化所得到的产品收率相差也非常大，很难进行大规模生产。

[0012]方法二：分步氧化法(Step Oxidation)
[0013]使用三对带有不同侧链保护基的Cys，通过固相合成在树脂上合成线性肽，然后采用分步脱除氧化的方法形成三对二硫键。

如专利CN201510391880.4，采用了Trt、Acm、tBu三
对不同的保护基。

[0014]固相偶联-分步氧化反应示意图如图6所示。

[0015]专利CN201310617050.X采用了Trt、Acm、Hmq三对不同的保护基。

[0016]分步氧化法，半胱氨酸采用三对不同的保护基，合成成本高；碘为强氧化剂，会破坏前面形成的两对二硫键，形成错配产物；使用不同侧链保护基的半胱氨酸，生产成本高；分步氧化操作繁复，收率极低。

[0017]方法三：通过固液结合、片段缩合，合成线性肽，然后通过随机氧化或分步氧化合成利那洛肽。

如专利CN201510467488.3、CN201410357720.3、WO2015022575A2、WO2012118972A2。

[0018]这种方法操作繁复，效率低，成本高。

[0019]综上，随机氧化法错配几率高，杂质多且不易控制，氧化须在稀溶液中，尽量采用温和的氧化体系，环化时间长，生产效率低；分步氧化法，半胱氨酸需要三对不同的保护基，合成操作步骤繁复，产率低，成本高。

随机氧化的氧化产物粗品纯度一般在30～40％左右。

分步氧化法制备，若每一步都用纯品做，最后所得产物纯度也仅可达到50～60％，同时其步骤繁琐。

[0020]因而需要寻找一条更为简单、高效的合成路线，本发明方法较好地解决了这一问题，适合工业化生产。

发明内容
[0021]本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。

在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

[0022]鉴于上述和/或现有的技术空白，提出了本发明。

[0023]为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，对含有两对二硫键的利那洛肽中间体进行氧化反应，得到利那洛肽；其中，所述含有两对二硫键的利那洛肽中间体，其为存在第2、10位Cys的二硫键和第5、13位Cys的二硫键。

[0024]作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述含有两对二硫键的利那洛肽中间体，其为在第1、6位Cys上有保护基团。

[0025]作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述含有两对二硫键的利那洛肽中间体，其为对利那洛肽线性粗肽进行第2、10位Cys和第5、13位Cys进行氧化成环制得。

[0026]作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述利那洛肽线性粗肽，其为在第1、6位Cys上有保护基团。

[0027]作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述利那洛肽线性粗肽，其为利那洛肽树脂裂解制得；其中，所述利那洛肽树脂，其为1、6位Cys有共同的保护基团，2、10位和5、13位Cys上有Trt。

[0028]作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述氧化成环，pH为6.5～7.5，时间为10～14h。

[0029]作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述保护基团，其为tBu，Meb，Mob中的一种。

[0030]作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述保护基团，其为tBu。

[0031]作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述氧化反应，包括，其针对tBu，具体为以TFA或5～20％DMSO中一种或多种为溶剂，温度为15～30℃，时间为25～40min；其针对Meb，具体为以TFA或5～20％DMSO中一种或多种为溶剂，温度为40～60℃，时间为3～4h；其针对Mob，具体为以体积比为94:5:1的TFA、DMSO、苯甲醚混合剂为溶剂，温度为55～65℃，时间为30min～90min。

[0032]作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述裂解，其为以TFA、EDT、苯甲醚、苯甲硫醚和水为裂解液，其体积比为90:2.5:2.5:2.5:2.5；其利那洛肽树脂同裂解液的体积比为1:8。

[0033]本发明的有益效果：
[0034](1)该工艺反应路线短，原料廉价易得，反应条件温和，减少了能耗，降低了生产成本。

[0035](2)相比于前人发表的路线，本路线的反应选择性与转化率均更高，减少了原料的浪费，有较强的经济性。

本发明提供的制备方法，最佳反应时间为30min，所得产物纯度可达85％。

[0036](3)减少了三废的排放，绿色安全。

附图说明
[0037]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

其中：
[0038]图1为所制备得的利那洛肽MS图。

[0039]图2为所制备得的利那洛肽HPLC图。

[0040]图3为所制备得的含有两对二硫键的利那洛肽中间体的MS图。

[0041]图4为所制备得的含有两对二硫键的利那洛肽中间体的HPLC图。

[0042]图5为固相偶联-随机氧化反应示意图。

[0043]图6为固相偶联-分步氧化反应示意图。

具体实施方式
[0044]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

[0045]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

[0046]其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。

在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

[0047]实施例1：
[0048]利那洛肽树脂的制备
[0049]H-Cys(tBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(tBu)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)—Resin的制备
[0050]称取10g替代度为1.14mmol/g的Wang树脂于固相反应器中，用DCM溶胀Wang树脂20分钟，抽干。

[0051]向固相反应器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室温反应15分钟。

[0052]将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂，测得树脂替代度为0.426mmol/ g。

向树脂中加入封闭试剂70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反应10h，封闭剩余的氨基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0053]加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，得H-Tyr(tBu)-Wang树脂；继续加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(7.48g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室温反应2h。

[0054]偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，用20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc 保护基5+15min，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0055]以此方法，依照目标产物对应所须氨基酸序列，依次偶联剩余的氨基酸，得到侧链全保护多肽树脂。

[0056]将此侧链全保护多肽树脂用20％PIP/DMF溶液5mL反应5min，DMF洗涤一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反应15min，抽干，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，抽干，称重得22.95g肽树脂。

[0057]利那洛肽线性粗肽的制备
[0058]H-Cys(tBu)-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys(tBu)-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH制备
[0059]配置裂解液，其各组分体积比为TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5: 2.5:2.5；将裂解液加入固相反应器中，与上述5g肽树脂(V肽树脂:V切割液＝1:8)在室温下震荡反应2h后，将反应液注入乙醚(V反应液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，离心后收集白色固体沉淀，真空干燥，即得Cys(tBu)的线性粗肽0.82g。

[0060]两对二硫键中间体的制备
[0061]
[0062]取50mg粗肽，加入2M盐酸胍(50ml),0.1M磷酸三钠调节PH至7，室温反应12h,得到含两对二硫键中间体(IV)。

[0063]使用依利特半制备型HPLC对上述反应液进行纯化。

使用C18(20mm*250mm)制备柱；流速:9ml/min；流动相：A相为水(1‰TFA)，B相为乙腈；分析条件：乙腈：5-20-30-95％，时间：0-5-45-50min。

收集制备液，冷冻干燥，得到15mg两对二硫键中间体(IV)。

[0064]利那洛肽(I)的制备
[0065]
[0066]取10mg上述两对二硫键中间体(IV)纯品，加入TFA(3ml)，5％DMSO，在15℃下反应30分钟，得到利那洛肽(I)，进行质谱分析，同时与标准品比对，结果正确。

其HPLC纯度为85％。

[0067]实施例2：
[0068]利那洛肽树脂的制备
[0069]H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(tBu)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(tBu)-Tyr(tBu)—Resin的制备
[0070]称取10g替代度为1.14mmol/g的Wang树脂于固相反应器中，用DCM溶胀Wang树脂20分钟，抽干。

[0071]向固相反应器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室温反应15分钟。

[0072]将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂，测得树脂替代度为0.426mmol/ g。

向树脂中加入封闭试剂70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反应10h，封闭剩余的氨基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0073]加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，得H-Tyr(tBu)-Wang树脂；继续加入Fmoc-Cys(tBu)- OH(5.10g, 12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室温反应2h。

[0074]偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，用20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc 保护基5+15min，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0075]以此方法，依照目标产物对应所须氨基酸序列，依次偶联剩余的氨基酸，得到侧链全保护多肽树脂。

[0076]将此侧链全保护多肽树脂用20％PIP/DMF溶液5mL反应5min，DMF洗涤一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反应15min，抽干，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，抽干，称重得21.12g肽树脂。

[0077]利那洛肽线性粗肽的制备
[0078]H-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys(tBu)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(tBu)-Tyr-OH制备
[0079]配置裂解液，其各组分体积比为TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5: 2.5:2.5；将裂解液加入固相反应器中，与上述5g肽树脂(V肽树脂:V切割液＝1:8)在室温下震荡反应2h后，将反应液注入乙醚(V反应液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，离心后收集白色固体沉淀，真空干燥，即得Cys(tBu)的线性粗肽0.78g。

[0080]两对二硫键中间体的制备
[0081]
[0082]取50mg粗肽，加入2M盐酸胍(50ml),0.1M磷酸三钠调节PH至7，室温反应12h,得到含两对二硫键中间体(IV)。

[0083]使用依利特半制备型HPLC对上述反应液进行纯化。

使用C18(20mm*250mm)制备柱；流速：9ml/min；流动相：A相为水(1‰TFA)，B相为乙腈；分析条件：乙腈：5-20-30-95％，时间：0-5-45-50min。

收集制备液，冷冻干燥，得到14mg两对二硫键中间体(IV)。

[0084]利那洛肽(I)的制备
[0085]
[0086]取10mg上述两对二硫键中间体(IV)纯品，加入TFA(3ml)，15％DMSO，在30℃下反应25分钟，得到利那洛肽(I)，进行质谱分析，同时与标准品比对，结果正确。

其HPLC纯度为48％。

[0087]实施例3：
[0088]利那洛肽树脂的制备
[0089]H-Cys(Trt)-Cys(tBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)—Resin的制备
[0090]称取10g替代度为1.14mmol/g的Wang树脂于固相反应器中，用DCM溶胀Wang树脂20分钟，抽干。

[0091]向固相反应器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室温反应15分钟。

[0092]将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂，测得树脂替代度为0.426mmol/ g。

向树脂中加入封闭试剂70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反应10h，封闭剩余的氨基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0093]加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，得H-Tyr(tBu)-Wang树脂；继续加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(7.48g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室温反应2h。

[0094]偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，用20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc 保护基5+15min，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0095]以此方法，依照目标产物对应所须氨基酸序列，依次偶联剩余的氨基酸，得到侧链全保护多肽树脂。

[0096]将此侧链全保护多肽树脂用20％PIP/DMF溶液5mL反应5min，DMF洗涤一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反应15min，抽干，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，抽干，称重得23.12g肽树脂。

[0097]利那洛肽线性粗肽的制备
[0098]H-Cys-Cys(tBu)-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys(tBu)-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH制备
[0099]配置裂解液，其各组分体积比为TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5:
2.5:2.5；将裂解液加入固相反应器中，与上述5g肽树脂(V肽树脂:V 切割液＝1:8)在室温下震荡反应2h后，将反应液注入乙醚(V反应液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，离心后收集白色固体沉淀，真空干燥，即得Cys(tBu)的线性粗肽0.84g。

[0100]两对二硫键中间体的制备
[0101]
[0102]取50mg粗肽，加入2M盐酸胍(50ml),0.1M磷酸三钠调节PH至7，室温反应12h,得到含两对二硫键中间体(IV)。

[0103]使用依利特半制备型HPLC对上述反应液进行纯化。

使用C18(20mm*250mm)制备柱；流速：9ml/min；流动相：A相为水(1‰TFA)，B相为乙腈；分析条件：乙腈：5-20-30-95％，时间：0-5-45-50min。

收集制备液，冷冻干燥，得到15mg两对二硫键中间体(IV)。

[0104]利那洛肽(I)的制备
[0105]
[0106]取10mg上述两对二硫键中间体(IV)纯品，加入TFA(3ml)，20％DMSO，在25℃下反应40分钟，得到利那洛肽(I)，进行质谱分析，同时与标准品比对，结果正确。

其HPLC纯度为34％。

[0107]实施例4：
[0108]利那洛肽树脂的制备
[0109]H-Cys(Meb)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Meb)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)—Resin的制备
[0110]称取10g替代度为1.14mmol/g的Wang树脂于固相反应器中，用DCM溶胀Wang树脂20分钟，抽干。

[0111]向固相反应器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室温反应15分钟。

[0112]将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂，测得树脂替代度为0.426mmol/ g。

向树脂中加入封闭试剂70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反应10h，封闭剩余的氨基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0113]加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，得H-Tyr(tBu)-Wang树脂；继续加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(7.48g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室温反应2h。

[0114]偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，用20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc 保护基5+15min，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0115]以此方法，依照目标产物对应所须氨基酸序列，依次偶联剩余的氨基酸，得到侧链全保护多肽树脂。

[0116]将此侧链全保护多肽树脂用20％PIP/DMF溶液5mL反应5min，DMF洗涤一次，再加入
20％PIP/DMF溶液5mL反应15min，抽干，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，抽干，称重得24.65g肽树脂。

[0117]利那洛肽线性粗肽的制备
[0118]H-Cys(Meb)-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys(Meb)-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH制备
[0119]配置裂解液，其各组分体积比为TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5: 2.5:2.5；将裂解液加入固相反应器中，与上述5g肽树脂(V肽树脂:V切割液＝1:8)在室温下震荡反应2h后，将反应液注入乙醚(V反应液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，离心后收集白色固体沉淀，真空干燥，即得Cys(Meb)的线性粗肽0.96g。

[0120]两对二硫键中间体的制备
[0121]
[0122]取50mg粗肽，加入2M盐酸胍(50ml),0.1M磷酸三钠调节PH至7，室温反应12h,得到含两对二硫键中间体(IV)。

[0123]使用依利特半制备型HPLC对上述反应液进行纯化。

使用C18(20mm*250mm)制备柱；流速：9ml/min；流动相：A相为水(1‰TFA)，B相为乙腈；分析条件：乙腈：5-20-30-95％，时间：0-5-45-50min。

收集制备液，冷冻干燥，得到16mg两对二硫键中间体(IV)。

[0124]利那洛肽(I)的制备
[0125]
[0126]取10mg上述两对二硫键中间体(IV)纯品，加入TFA(3ml)，5％DMSO，在40℃下，反应4h，得到利那洛肽(I)，进行质谱分析，同时与标准品比对，结果正确。

其HPLC纯度为68％。

[0127]实施例5：
[0128]利那洛肽树脂的制备
[0129]H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Meb)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)Thr(tBu)-Gly-Cys(Meb)-Tyr(tBu)—Resin的制备
[0130]称取10g替代度为1.14mmol/g的Wang树脂于固相反应器中，用DCM溶胀Wang树脂20分钟，抽干。

[0131]向固相反应器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室温反应15分钟。

[0132]将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂，测得树脂替代度为0.426mmol/ g。

向树脂中加入封闭试剂70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反应10h，封闭剩余的氨基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0133]加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，得H-Tyr(tBu)-Wang树脂；继续加入Fmoc-Cys(Meb)OH(5.71g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室温反应2h。

[0134]偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，用20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc 保护基5+15min，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0135]以此方法，依照目标产物对应所须氨基酸序列，依次偶联剩余的氨基酸，得到侧链全保护多肽树脂。

[0136]将此侧链全保护多肽树脂用20％PIP/DMF溶液5mL反应5min，DMF洗涤一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反应15min，抽干，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，抽干，称重得24.86g肽树脂。

[0137]利那洛肽线性粗肽的制备
[0138]H-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys(Meb)-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Meb)-Tyr-OH制备
[0139]配置裂解液，其各组分体积比为TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5: 2.5:2.5；将裂解液加入固相反应器中，与上述5g肽树脂(V肽树脂:V切割液＝1:8)在室温下震荡反应2h后，将反应液注入乙醚(V反应液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，离心后收集白色固体沉淀，真空干燥，即得Cys(Meb)的线性粗肽0.93g。

[0140]两对二硫键中间体的制备
[0141]
[0142]取50mg粗肽，加入2M盐酸胍(50ml),0.1M磷酸三钠调节PH至7，室温反应12h,得到含两对二硫键中间体(IV)。

[0143]使用依利特半制备型HPLC对上述反应液进行纯化。

使用C18(20mm*250mm)制备柱；流速：9ml/min；流动相：A相为水(1‰TFA)，B相为乙腈；分析条件：乙腈：5-20-30-95％，时间：0-5-45-50min。

收集制备液，冷冻干燥，得到15mg两对二硫键中间体(IV)。

[0144]利那洛肽(I)的制备
[0145]
[0146]取10mg上述两对二硫键中间体(IV)纯品，加入TFA(3ml)，15％DMSO，在60℃下，反应3h，得到利那洛肽(I)，进行质谱分析，同时与标准品比对，结果正确。

其HPLC纯度为42％。

[0147]实施例6：
[0148]利那洛肽树脂的制备
[0149]H-Cys(Trt)-Cys(Meb)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Meb)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)—Resin的制备
[0150]称取10g替代度为1.14mmol/g的Wang树脂于固相反应器中，用DCM溶胀Wang树脂20分钟，抽干。

[0151]向固相反应器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室温反应15分钟。

[0152]将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂，测得树脂替代度为0.426mmol/
g。

向树脂中加入封闭试剂70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反应10h，封闭剩余的氨基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0153]加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，得H-Tyr(tBu)-Wang树脂；继续加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(7.48g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室温反应2h。

[0154]偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，用20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc 保护基5+15min，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0155]以此方法，依照目标产物对应所须氨基酸序列，依次偶联剩余的氨基酸，得到侧链全保护多肽树脂。

[0156]将此侧链全保护多肽树脂用20％PIP/DMF溶液5mL反应5min，DMF洗涤一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反应15min，抽干，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，抽干，称重得25.24g肽树脂。

[0157]利那洛肽线性粗肽的制备
[0158]H-Cys-Cys(Meb)-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys(Meb)-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH制备
[0159]配置裂解液，其各组分体积比为TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5: 2.5:2.5；将裂解液加入固相反应器中，与上述5g肽树脂(V肽树脂:V切割液＝1:8)在室温下震荡反应2h后，将反应液注入乙醚(V反应液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，离心后收集白色固体沉淀，真空干燥，即得Cys(Meb)的线性粗肽0.98g。

[0160]两对二硫键中间体的制备
[0161]
[0162]取50mg粗肽，加入2M盐酸胍(50ml),0.1M磷酸三钠调节PH至7，室温反应12h,得到含两对二硫键中间体(IV)。

[0163]使用依利特半制备型HPLC对上述反应液进行纯化。

使用C18(20mm*250mm)制备柱；流速：9ml/min；流动相：A相为水(1‰TFA)，B相为乙腈；分析条件：乙腈：5-20-30-95％，时间：0-5-45-50min。

收集制备液，冷冻干燥，得到15mg两对二硫键中间体(IV)。

[0164]利那洛肽(I)的制备
[0165]
[0166]取10mg上述两对二硫键中间体(IV)纯品，加入TFA(3ml)，20％DMSO，在50℃下，反应3.5h，得到利那洛肽(I)，进行质谱分析，同时与标准品比对，结果正确。

其HPLC纯度为19％。

[0167]实施例7：
[0168]利那洛肽树脂的制备
[0169]H-Cys(Mob)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Mob)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)—Resin的制备
[0170]称取10g替代度为1.14mmol/g的Wang树脂于固相反应器中，用DCM溶胀Wang树脂20分钟，抽干。

[0171]向固相反应器中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(15.7g，13.68mmol)、HOBt(5.55g，4.1mmol)、DIC(6.35mL，4.1mmol)、DMAP(0.5g，4.1mmol)溶于DMF(70ml)中，室温反应15分钟。

[0172]将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂，测得树脂替代度为0.426mmol/ g。

向树脂中加入封闭试剂70mL(醋酸酐(mmol):DIPEA(mmol)＝1:1)，反应10h，封闭剩余的氨基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0173]加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，得H-Tyr(tBu)-Wang树脂；继续加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(7.48g,12.78mmol)、HOBt(2.07g，15.34mmol)、DIC(2.37mL，15.34mmol)、DMF(70mL)，室温反应2h。

[0174]偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，用20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc 保护基5+15min，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。

[0175]以此方法，依照目标产物对应所须氨基酸序列，依次偶联剩余的氨基酸，得到侧链全保护多肽树脂。

[0176]将此侧链全保护多肽树脂用20％PIP/DMF溶液5mL反应5min，DMF洗涤一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反应15min，抽干，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，抽干，称重得25.34g肽树脂。

[0177]利那洛肽线性粗肽的制备
[0178]H-Cys(Mob)-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys(Mob)-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH制备
[0179]配置裂解液，其各组分体积比为TFA:EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水＝90:2.5:2.5: 2.5:2.5；将裂解液加入固相反应器中，与上述5g肽树脂(V肽树脂:V切割液＝1:8)在室温下震荡反应2h后，将反应液注入乙醚(V反应液:V乙醚＝1:6)中，沉淀，离心后收集白色固体沉淀，真空干燥，即得Cys(Mob)的线性粗肽1.02g。

[0180]两对二硫键中间体的制备
[0181]
[0182]取50mg粗肽，加入2M盐酸胍(50ml),0.1M磷酸三钠调节PH至7，室温反应12h,得到含两对二硫键中间体(IV)。

[0183]使用依利特半制备型HPLC对上述反应液进行纯化。

使用C18(20mm*250mm)制备柱；流速:9ml/min；流动相：A相为水(1‰TFA)，B相为乙腈；分析条件：乙腈：5-20-30-95％，时间：0-5-45-50min。

收集制备液，冷冻干燥，得到15mg两对二硫键中间体(IV)。

[0184]利那洛肽(I)的制备
[0185]
[0186]取10mg上述两对二硫键中间体(IV)纯品，以体积比为94:5:1的TFA、DMSO、苯甲醚。