麦冬有效部位对支原体感染小鼠肺组织黏蛋白MUC5ac表达的影响

麦冬有效部位对支原体感染小鼠肺组织
黏蛋白MUC5ac表达的影响
孙妍J王静I,侯詰I,武天元-王伟明I
('黑龙江省中医药科学院•黑龙江哈尔滨150036；2黑龙江中医药大学•黑龙江哈尔滨150040)
摘要目的：通过实验研究麦冬有效部位对肺炎支原体(MP)感染小鼠的肺组织黏蛋白5ac(MUC5ac)表达及分泌的影响。

方法:将100只BALB/c小鼠，分为正常对照组,模型组，阿奇霉素组，养阴清肺组，麦冬多糖高、中、低剂量组，麦冬皂昔高、中、低剂量组，每组10只。

除正常组外，其余各组采用MP滴鼻法造模，连续造模3d后，各组开始灌胃给药，每天1次，阿奇霉素组连续给药5d,其他组连续给药6d 后，收集肺泡灌洗液(BALF),ELISA检测BALF中MUC5ac的蛋白含量；采集小鼠肺组织，PCR法测定肺组织中MUC5ac mRNA的表达。

结果：1)肺组织MUC5ac mRNA的表达：与正常组相比，模型组肺组织MUC5ac mRNA的表达极显著上升(P<0.01)；与模型组对比，阿奇霉素的表达量降低,具有极显著性(P
<0.01)；麦冬多糖高、中、低剂量组，养阴清肺组及麦冬皂昔高剂量组的表达量降低，具有显著性差异(P
<0.05)。

2)BALF MUC5ac的含量:与正常组对比模型组含量显著增加(P<0.01),与模型组对比，阿奇
霉素组、麦冬皂昔高剂量组含量显著减少(P<0.01),麦冬皂昔中剂量组和麦冬多糖高、中剂量组含量减少，具有显著性差异(P<0.05)。

结论:麦冬有效部位可下调MUC5ac蛋白的表达及分泌。

关键词麦冬皂昔；麦冬多糖;肺炎支原体;黏蛋白5ac；小鼠
Effect of Effective Fraction of Maidong(Ophiopogon Japonicus)on MUC5ac
Expression in Lung Tissue of Mice Infected with Mycoplasma
SUN Yan1,WANG Jing,HOU Zhe1,WU Tianyuan2,WANG Weiming1
(1Heilongjiang Academy of Chinese Medicine Sciences,Harbin,Heilongjiang150036；
2Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang150040) ABSTRACT Objective:To study the effect of Radix Ophiopogonis on the expression and secretion of MUC5ac in lung tissue o£mice infected with Mycoplasma pneumoniae(MP).Methods:100BALB/c mice were divided into normal control group,model group,Azithromycin group,Yangyin Qingfei group,Ophiopogon japonicus pol­ysaccharide high,medium and low dose groups,Ophiopogon japonicus saponin high,medium and low dose groups,with10mice in each group.Except the normal group,the other groups were nasal dropped with MP for 3days,once a day,then each group was given the corresponding medicine or saline continuously,Azithromycin for5days,the other groups for6days.The alveolar lavage fluid(BALF)was collected and the protein content of MUC5ac in BALF was detected by ELISA.The expression of MUC5ac mRNA in lung tissue was detected by PCR.Results:1)The expression o£MUC5ac mRNA in lung tissue:Compared with the normal group,the ex­pression of MUC5ac mRNA in the lung tissue of the model group was significantly increased(P<0.01),com­pared with the model group,the expression of Azithromycin was significantly decreased(P<0.01),the expres­sion of MUC5ac mRNA in the high,medium and low-dose groups of Ophiopogon japonicus polysaccharide, Yangyin Qingfei group and Ophiopogonin saponin high-dose group was decreased with significant difference(P
<0.05).2)MUC5ac in BALF:Compared with the model group,the content of MUC5ac in BALF of mice was
significantly increased(P<0.01),compared with the model group,the content o£MUC5ac in the Azithromycin group and Ophiopogon saponin high-dose group was significantly decreased(P<0.01),and the content o£Ophiopogon saponin medium dose group,Ophiopogon japonicus polysaccharide high-dose group and middle dose group was significantly decreased(P<0.05).Conclusion:The effective fraction of Ophiopogon japonicus -------------------------------------------------------could down regulate the expression and secretion o£基金项目：黑龙江省中医药科研项目(ZHY18-052)MUC5ac protein.
通讯作者:王伟明,E-mail：zyyjy@ Key words Ophiopogon japonicus saponin；Ophiopogon
japonicus polysaccharide；Mycoplasma pneumoniae；MUC5ac；mouse
肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneu­monia,MPP)是肺炎支原体(Mycoplasma pneumoni-ae,MP)引起的呼吸系统感染性疾病，其主要临床特征为反复高热、顽固性干咳、少痰或痰黏难咯等，中医认为属外感风热燥毒所致“肺燥咳嗽”，属于燥邪犯肺的范畴⑴。

目前对于肺炎支原体肺炎的治疗,主要包括抗肺炎支原体和调节机体免疫功能两个方面；但肺炎支原体感染后肺组织的津液代谢在该病转归过程中占有重要地位；因此临床上提出了从燥论治小儿支原体肺炎，以“养阴清肺，润肺止咳”为其主要治则，且取得了较好疗效研究表明某些病因刺激呼吸道时，气道黏液分泌明显增多，通过咳嗽和纤毛运动将其排出，持续的黏液分泌增多可导致气道阻塞、气流不畅、肺功能进行性降低。

气道黏液分泌量的增加与上调MUC5ac基因表达、刺激黏蛋白颗粒胞吐作用两个机制有关⑸。

MUC5ac(黏蛋白)位于呼吸道表面的上皮细胞内，是气道黏液的主要成分。

本课题组前期研究发现麦冬水提物可促进MP感染小鼠腺体分泌,使痰液黏度下降而易于咳出，改善气管浆液腺上皮黏液腺化生等肺燥的病理状态(另文待发表)，本实验观察麦冬有效部位(多糖、皂昔)对MP感染小鼠肺组织MUC5ac表达及分泌的影响,现报道如下。

1材料
1.1实验动物100只BALB/c小鼠,SPF级，体质量18~22g,雌雄各半,北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2012-0001。

1.2菌株肺炎支原体国际标准株(ATCCFH15531)：美国菌株保藏中心。

1.3药物及试剂麦冬饮片:河北安国振宇药业有限公司，批号=130109,经鉴定麦冬为四川麦冬Radix Ophiopogonis(Thunb.)Ker-Gawl.的干燥块根；阿奇霉素分散片(哈药集团制药六厂，批号: 30130502)；养阴清肺糖浆:北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号=3150021。

TRIzol试剂:美国Invitrogen；One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit: TaKaRa公司；MUC5ac引物、0-actin引物：哈尔滨博仕生物技术有限公司；小鼠黏蛋白5ac(MUC5ac)检测试剂盒:USCN Life Science Inc.；PPLO培养基：Becton,Dickinson and Company,USA o试药均在给药前研磨成粉,溶解,涡旋混匀。

1.4主要仪器DL-CJ-1W生物净化工作台:北京东连哈尔仪器制造有限公司；MDF-382E-80°C 低温冰箱：日本三洋公司;Milli-Q Reference system 自动双重纯水蒸谓器:MILLI-Q公司；Sorva H ST16低温离心机:Thermo公司；2、20、200(ji L微量加样器:Eppendoff公司；9600荧光定量PCR仪:杭州博日有限公司;Infinite M200Pro酶标仪:Tecan公司。

2方法
2.1肺炎支原体培养将MP菌株按1:9加入到PPLO完全培养基中，置37£生化培养箱进行培养,每天观察颜色变化，培养液由红色变为黄色并澄清透明时即为支原体生长。

将处于对数生长期的MP 进行CCU定量，常规冻存备用。

2.2动物分组100只BALB/c小鼠，随机分为10组，每组10只。

分别为正常对照组，模型对照组，阿奇霉素组，养阴清肺组，麦冬多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组和麦冬皂昔高剂量组、中剂量组、低剂量组。

2.3造模、给药及标本采集除正常对照组外，其余各组用乙醞麻醉，然后用无菌注射器吸取106 CCU/mLMP,滴鼻复制MP感染模型,20|jl L,连续感染3d；之后各组小鼠开始灌胃给药,正常组和模型组灌胃等容积生理盐水，阿奇霉素组给药5d(第1天给65mg/kg,第2~5天给32.5mg/kg)、养阴清肺组(5mL/kg)、麦冬多糖高剂量组(81.2mg/kg)、麦冬多糖中剂量组(40.6mg/kg)、麦冬多糖低剂量组(20.3mg/kg)、麦冬皂昔高剂量组(66.8mg/ kg)、麦冬皂昔中剂量组(3
3.4mg/kg)、麦冬皂昔低剂量组(16.7mg/kg),连续给药6d。

颈椎脱臼处死小鼠，肺门处结扎右主支气管后向左侧肺内注入生理盐水ImL,反复抽洗2次，合并灌洗液,3000r/ min,4七离心10min,收取上清液，-80T冻存备用;剪取右肺组织中叶，-80七保存备用。

2.4观察指标及测定
2.4.1Real-time PCR方法检测MUC5ac mRNA 的表达取100mg组织置于离心管中，加入适量去离子水，用匀浆机打匀，加入1mLtrizol(预冷)提取RNA；以DEPC比0做空白调零，混匀样品在260、280nm波长下读数,OD260/OD280的比值用于估算核酸纯度,计算总RNA浓度，调整样品体积。

以B肌动蛋白(p-actin)为内参照,MUC5AC正向引物：5，-ACCACTTrCTCCTTCTCCACAC-3，,反向引物：5,-AACAGGGCTCTTCACAGACAATA-3,；0-actin正向引物：5'-GACGGCCAGGTCATCACTATTG -3',反向弓|物：5'-AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC
-3Z O PCR 扩增仪进行循环扩增：42弋5 min,
95 兀 10 sec , 1 cycle ； 95 兀 5 sec , 60 °C 20 sec ,
40 cycle ；95 兀 0 sec ,65 °C 15 sec ,95 兀 0 sec o 采用
比较阈值法分析基因表达的量，直接得到各组小鼠 肺组织MUC5ac mRNA 对空白组相对表达的量。

采 用2 公式,相对定量的方法进行计算,得出的相
对表达量。

2. 4. 2 ELISA 检测BALF 中MUC5ac 蛋白的含量
按试剂盒说明书操作。

2.5统计学方法 采用SPSS17. 0软件进行统计 学分析。

所有数据用均数土标准差G 土 s)表示，两
组间均数比较采用独立样本t 检验，显著性水准P
< 0. 05 o
3结果
3. 1 麦冬有效部位对MP 感染小鼠肺组织MUC5ac
蛋白表达的影响见表1。

表1各组小鼠肺组织MUC5ACmRNA 表的比较G±s)
组别动物数(只)
MUC5ac
正常对照组
101模型对照组10 2. 44 土 0. 46
阿奇霉素组
10 1. 17 土 0. 12**养阴清肺组
10 1. 17 ±0. 89*麦冬皂昔低剂量组10 2. 43 ±0. 29麦冬皂昔中剂量组
10 2. 19 土 0. 43
麦冬皂昔高剂量组10 1.55 土 0. 29*麦冬多糖低剂量组10 1.50±0. 55*
麦冬多糖中剂量组10 1.59 土 0. 40*
麦冬多糖高剂量组
10
1.63 土 0. 22*
注:与正常组比较,AP<0. 05,AAP<0.01；与模型组比较，
<0. 05, * * P <0. 01
3.2 麦冬有效部位对MP 感染小鼠BALF 中
MUC5ac 蛋白含量的影响见表2。

表2各组小鼠BALF 中MUC5ac 蛋白含量比较G±s ,jj ^L)
注:与正常组比较,AP<0. 05,AAP<0.01；与模型组比较，
< 0. 05, * * P <0. 01
组别动物数(只)
MUC5ac
正常对照组101305. 23 ±235. 89模型对照组102954. 43 ±238. 12AA
阿奇霉素组
101907. 93 ±45.67 **养阴清肺组102667. 28 ±57.66麦冬皂昔低剂量组102751. 19 ±57. 86麦冬皂昔中剂量组102489. 81 ±55.24*
麦冬皂昔高剂量组102037.78 ±58.21 **麦冬多糖低剂量组102691. 27 ±61.26麦冬多糖中剂量组102417. 98 ±47.92*麦冬多糖高剂量组
10
232& 13 ±51.27*
4讨论
正常情况下，气道黏膜腺体和杯状细胞为保持 呼吸道黏膜的湿润时只分泌少量黏液，当某些病因
刺激呼吸道时，气道黏液分泌量明显增多，并通过
咳嗽和纤毛运动将其排出，但持续的黏液分泌增多 可导致气道阻滞、气流不畅、肺功能进行性降低。

气道中的黏液是由不同分泌物混合而成，黏蛋白
(muc)是气道黏液中的重要组成部分，其数量和性
质决定气道黏液的黏度。

在已有的21种黏蛋白中，
杯状细胞分泌的MUC5ac 为气道中主要的分泌性黏
蛋白，MUC5ac 的过度表达是气道黏液分泌量及黏 液黏度增加的主要原因同。

肺炎支原体肺炎是由肺炎支原体引起的呼吸 道和肺部急性炎症。

2 -3d 后出现明显呼吸道症
状，阵发性刺激性咳嗽为突出表现，咳少量黏液或 黏液脓性痰。

由肺炎支原体还可引起支气管扩 张切，并与支气管哮喘⑷有较强的关联性。

本实验在对肺组织中MUC5ac 基因表达情况及
BALF 中MUC5ac 含量进行检测时,结果显示,小鼠
在正常情况下MUC5ac 表达量极少,MP 小鼠模型组 与正常组相比MUC5ac 表达含量明显上升，提示
MPP 可致肺部MUC5ac 生成增加，气道黏液分泌量
增多。

麦冬多糖组与麦冬皂昔组可明显降低MP 所
致小鼠肺组织MUC5ac 的表达，提示麦冬有效部位
可通过调节MUC5ac 的表达，减少肺组织黏蛋白的 分泌,降低气道黏液分泌量及黏液的粘度,起到祛
痰止咳作用。

但麦冬有效部位的剂量与MUC5ac 的
表达没有明确的量效关系，需通过后续实验进行 阐明。

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(修回日期：2021 -02-18)。