化验技术协会第六期培训资料

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化验技术协会第六期培训资料
（微生物检定工）
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抗生素微生物比浊法
1 仪器与用具
1.1 操作室要求同管碟法。

1.2 分光光度计应有数字显示功能和自动记录装置，数显精度应在小数点后三位。

1.3 玻璃大试管 20.5mm×
2.5mm或适宜的试管，应大小一致，厚薄均匀，玻璃质地相同，使用同一品牌和批号。

使用过的试管经灭菌后，将培养基倾出，用水清洗，沥干，再用硫酸-重铬酸钾洗液浸泡，清水冲洗干净后，晾干，在160℃干烤2～3小时灭菌，保持洁净，备用。

注意避免污染毛点、纤维等，以免干扰测定结果。

1.4 移液管 lOml或20ml刻度容量，管口需磨粗(大)，以便快速分装培养基。

1.5 恒温水浴箱工作体积600mm×300mm×l50mm(长×宽×高)，电热恒温水浴。

1.6 电动搅拌器将二台电动搅拌器的浆叶置于恒温水浴的大试管随机区组培养方列的两侧，于水中搅动，以使水温均匀。

本身带有搅拌或循环水系统的恒温水浴箱，可不再配备电动搅拌器。

1.7 分光光度计用吸收池方形玻璃吸收池或石英吸收池，透光面lcm，用硝酸-硫酸混合液(取浓硫酸95ml，加浓硝酸3～5ml，混匀)浸泡1～48小时(浸泡时间视是否能去除附着污物而定)，先后用水、去离子水(蒸馏水)冲洗干净，晾干，备用。

如仍不能除去附着污物，可用1％～2％硝酸钠的浓硫酸溶液浸泡后，再经水洗涤。

1.8 其他分析天平、称量瓶、量瓶、25ml及50ml滴定管、秒表、滤纸及镜头纸等。

2 试液除同管碟法的要求外，比浊法用的缓冲液应澄清无色。

缓冲液配制后用垂熔玻璃漏斗滤过，除去沉淀等不溶物，使溶液澄清。

使用前灭菌。

3 培养基除同管碟法的要求外，比浊法使用的培养基应澄明，颜色以尽量浅为佳，培养后培养基本身不得出现浑浊。

培养基经灭菌后不得发生沉淀。

根据这一原则，通过对培养基原材料的预试，挑选合适品牌厂家的产品使用。

目前，已有一些种类的市售干燥培养基，如营养琼脂培养基、改良马丁培养基等，使用方便。

4 试验用菌液
4.1金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)悬液取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面培养基上，在35～37℃培养20～22小时。

临用时，
用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

4.2大肠杆菌(Escherichia coli)悬液取大肠杆菌[CMCC(B)44 103]的营养琼脂斜面培养物，接种于。

营养琼脂斜面培养基上，在35～37℃培养20～22小时。

临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。

4.3白色念珠菌(Candida albicans)悬液取白色念珠菌[CMCC(F)98 001]的改良马丁琼脂斜面的新鲜培养物，接种于10ml培养基IX(中国药典2005年版二部附录XI A抗生素微生物检定法)中，在35～37℃培养8小时，再用培养基IX稀释至适宜浓度，备用。

5 操作方法
5.1 称量要求同管碟法。

5.2 稀释标准品与供试品溶液的稀释应使用经标定的量瓶，每步稀释的量取量以不少于2ml为宜，稀释步骤一般不超过3步。

5.3 标准曲线法
5.3.1 标准品溶液按中国药典该品种含量测定项下的要求，制成一定浓度的标准品贮备液。

在该品种项下规定的剂量反应线性范围内，以线性浓度范围的中间值作为中间浓度，标准品溶液选择5个剂量，剂量间的比例应适宜(通常为1:1.25或更小)。

5.3.2 供试品溶液根据估计效价或标示量，取供试品按标准品溶液的制备方法，选择中间浓度，不少于3个试管。

5.3.3 含试验菌液体培养基的制备临用前，取规定的试验菌悬液适量(35～37℃培养3～4小时后测定的吸光度在0.3～0.7之间)，加入到各液体培养基管中，混合均匀，使在试验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度(吸光度)。

含试验菌液体培养基在配制后应立即使用，必要时可适当冷却，以防止试验菌在培养前生长。

5.3.4 线性试验取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各个试管内分别精密加入各个浓度的标准品和供试品溶液各1.0ml，再精密加入含试验菌的液体培养基9.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各个试验管放置于恒温水浴内，在规定的条件下培养(通常约4小时)至适宜测量的浊度值(吸光度值)。

各浓度不少于4个试管。

5.4 平行线测定法(二剂量(2.2)和三剂量(3.3)法)
5.4.1 标准品溶液按中国药典该品种含量测定项下的要求，制成一定浓度的标准品贮备液。

在该品种项下规定的剂量反应线性范围内，选择2个或3个剂量，剂量间的比例应适宜(二剂量通常为2:1或4:1，三剂量通常为1:0.8)。

5.4.2 供试品溶液根据估计效价或标示量，取供试品按标准品溶液的制备方法，选择2个或3个剂量。

5.4.3 含试验菌液体培养基的制备同8.3.3配制方法。

5.4.4 标准品及样品测定取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各个试管内分别精密加
入2个或3个浓度的标准品和供试品溶液各1.0ml，再精密加入含试验菌的液体培养基9.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值(通常约为4小时)。

各浓度不少于4个试管。

5.5 空白试验另取2支试管各加入药品稀释剂1.0ml，再分别加入含试验菌的液体培养基9.0ml，其中在一支试管中立即加入12％甲醛溶液0.5ml，混匀，作为空白对照，另一支试管同法培养作为试验菌生长对照。

5.6 吸光度的测量在线测定各试管的吸光度，或取出试管立即加入12％甲醛溶液0.5m1以终止微生物的生长，在530nm或580nm波长处测定各管的吸光度。

6 记录与计算
6.1 试验记录要求与管碟法相同。

6.2 标准曲线法
6.2.1 效价计算按下式计算的标准曲线的斜率b和截距a，从而得到相应的标准曲线线性方程。

∑(x-－
ｘ)∑(y-－
ｙ
)
斜率（b）=-------------------
∑(x-－
ｘ
)2
截距(a)＝－
ｙ- b－
ｘ
标准曲线线性方程 Y＝bX+a
式中 x为抗生素标准品溶液的浓度或浓度的数学转换值；
－
ｘ
为抗生素标准品溶液的浓度或浓度的数学转换值的平均值；
y为各标准品溶液的吸光度；
－
ｙ
为标准品溶液吸光度的平均值。

计算各浓度试管供试品溶液吸光度的平均值，自标准曲线上或按标准曲线的线性方程，求得抗生素的量，再乘以供试品溶液的稀释度，即得供试品中抗生素的效价含量。

6.2.2 回归系数的显著性检查判断回归得到的方程是否成立，即X、Y是否存在着回归关系，可采用t检验。

X、Y应具有直线回归关系。

6.2.3 可信限率考核试验的精密度，除药典各论另有规定外，本法的可信限率不得超
过5％。

上述各项规定都能符合者，试验结果成立。

6.3 平行线测定法
6.3.1 效价计算
6.3.1.1 二剂量(2.2)法效价计算公式
T
2+T
1
-S
2
-S
1
P=log-1[-----------×I] ×100%
T
2+S
2
-T
1
-S
1
式中 P为供试品效价(相当于标示量或估计效价的百分数)；
S
2
为标准品高浓度溶液所致吸光度的总和；
S
l
为标准品低浓度溶液所致吸光度的总和；
T
2
为供试品高浓度溶液所致吸光度的总和；
T
1
为供试品低浓度溶液所致吸光度的总和；
I为高、低浓度剂量之比的对数值，2:1时，I=0.301；4:1时，I=0.602。

6.3.1.2 三剂量(3.3)法效价计算公式
0.1292(T
3+T
2
+T
1
-S
3
-S
2
-S
1
)
P=log-1[-----------------------] ×100%
S
3+T
3
-S
1
-T
1
式中 S
3
为标准品高浓度溶液所致吸光度的总和；
S
2
为标准品中间浓度溶液所致吸光度的总和；
S
1
为标准品低浓度溶液所致吸光度的总和；
T
3
为供试品高浓度溶液所致吸光度的总和；
T
2
为供试品中间浓度溶液所致吸光度的总和；
T
1
为供试品低浓度溶液所致吸光度的总和；
I为高、低浓度剂量之比的对数值，1：0.8时，I＝0.0969。

6.3.2 可靠性测验计算方法及要求同管碟法二剂量(2.2)和三剂量(3.3)法。

即(2.2)法，回归、剂间P<O.01，偏离平行P>O.05。

(3.3)法，除符合(2.2)法的要求外，二次曲线、反向二次曲线P>O.05。

6.3.3 可信限率其可信限率除另有规定外，应不大于5％。

上述各项规定都能符合者，试验结果成立。

6.4 实验计算所得效价低于估计效价的90％或高于估计效价的110％，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。

6.5 原料药效价测定一般需做双份样品平行试验，以便核对。

对于检验结果不符合规定的样品，应有可靠性测验及可信限率均符合规定，且测定结果在估计效价(原料药)或标示量(制剂)±10％范围内的至少2个效价测定结果，必要时应请其他检验人员复核，才能发出检验报告。

6.6 效价测定结果的有效数字按药典规定及数字修约的原则取舍。