基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复绵羊极限骨缺损

基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复绵羊极限骨缺
损
王小志;何惠宇;杨楠;杨泽辉;胡杨
【摘要】BACKGROUND:Many in vivo and in vitro experiments indicate that implantation of exogenous basic fibroblast growth factor can significantly promote the process of bone formation, but the in vivo degradation of exogenous basic fibroblast growth factor affects the therapeutic efficacy. <br> OBJECTIVE:To observe the effects of basic fibroblast growth factor-transfected mesenchymal stem cells which transfected using molecular biology techniques combined with al ogeneic bone in the repair of critical-size bone defects in sheep. <br> METHODS:Al ogeneic bone with basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells combined with al ogeneic bone material stents, al ograft bone material,β-tricalcium calcium material were respectively implanted into critical-size bone defects in sheep. After 4, 8 and 12 weeks, histological and immunohistochemical staining was performed. <br> RESULTS AND CONCLUSION:At 12 weeks after implantation of al ogeneic bone with basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cells as tissue engineering bone, there were many cartilage-like structures in the operative binding region and a large amount of osteoblast-like cells in the center of operative region, and there was more material degradation in the entire operative area as compared with other groups;there were fibrous
connective tissues ful of the pores, and osteoclast-like cells were commonly seen&nbsp;around the implant material;bone sialoprotein and col agen type Ⅰ expression were strongly positive. In the other three groups, although the cartilage-like structure appeared in the binding region, dead bone structure was found in the central area, and bone sialoprotein and type Ⅰ col agen expression was weak. These findings indicate that al ogeneic bone with basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cells can basical y repair critical-size bone defects in sheep.%背景：多项体内外实验表明外源性植入碱性成纤维细胞生长因子能明显促进骨形成过程，但外源性碱性成纤维细胞生长因子在体内易降解，影响疗效。

目的：利用分子生物学技术将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中，观察同种异体骨复合基因转染骨髓间充质干细胞修复绵羊极限骨缺损的效果。

方法：将同种异体骨复合碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞组织工程骨、骨髓间充质干细胞复合同种异体支架骨材料、同种异体支架骨材料、β-磷酸三钙材料分别植入羊髂骨极限缺损处，植入后4，8，12周行组织学、免疫组织化学染色观察。

结果与结论：同种异体骨复合碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞组织工程骨植入后12周，手术结合区成软骨样结构较多，术区中央可见大量成骨样细胞，整个术区的支架材料降解较其他组多，支架材料孔洞内爬满纤维结缔组织，材料周围常见破骨样细胞；骨涎蛋白与Ⅰ型胶原呈强阳性表达。

其他3组手术结合区虽有成软骨样结构及成骨样细胞出现，但中央区为死骨结构，且骨涎蛋白与Ⅰ型胶原呈弱表达。

表明碱性成纤维细胞生长因子转染的骨髓间充质干细胞复合同种异体骨可基本修复绵羊极限骨缺损。

【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2013(000)047
【总页数】8页(P8141-8148)
【关键词】生物材料;组织工程骨材料;同种异体骨;碱性成纤维细胞生长因子;羊骨髓间充质干细胞;极限骨缺损;组织工程;免疫组织化学;国家自然科学基金
【作者】王小志;何惠宇;杨楠;杨泽辉;胡杨
【作者单位】新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054;新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054;新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054;新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054;新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
【正文语种】中文
【中图分类】R318
0 引言 Introduction
骨组织自我修复能力有限，较大范围骨缺损是临床口腔科及骨科领域疑难的课题，具有挑战性。

传统的骨缺损治疗方法有自体骨移植、同种异体骨移植和人工骨移植等，这些方法虽然在实验和临床治疗起到了一定的成果，但均因各种因素使其在临床应用受到一定限制[1-3]：自体骨移植供体来源往往有限，而且手术时间长，并发症多；单纯同种异体骨植入后容易吸收，而且容易感染，排斥反应重；人工骨移植原材料孔隙率变异较大，成骨困难，而且来源有限。

组织工程学应用种子细胞、
生长因子和支架材料治疗骨缺损，不仅可避免供区损伤，也避免了供体骨吸收，同时还可降低免疫排斥反应，为骨缺损修复治疗开辟了一条崭新的道路[4]。

用于研
究的实验性骨缺损应大于实验动物自身自行愈合修复的范围，才能真实地反映修复材料或生长因子等对骨缺损的修复情况，这样的实验性骨缺损称为极限缺损，即在确定的研究时间内不可能自行愈合的最小缺损。

实验以转染碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)基
因的骨髓间充质干细胞作为种子细胞和激活因子，选取具有多孔特性、良好的生物相容性和可降解性，以及一定机械强度的煅烧同种异体绵羊脊椎骨作为支架材料，体外构建组织工程骨修复绵羊髂骨极限缺损，观察及探讨组织工程骨的成骨能力，为修复极限骨缺损提供一种新方法，同时为组织工程领域提供相关物种的实验依据。

1 材料和方法 Materials and methods
设计：观察性实验。

时间及地点：细胞培养实验于2012年4至6月在新疆医科大学第一附属医院医
学研究中心细胞生物学实验室完成，动物实验于2012年6至12月在新疆医科大学第一附属医院动物实验中心完成。

材料：
实验动物和骨源：6月龄雄性新疆阿勒泰大尾绵羊1只，体质量11 kg，供提取及培养骨髓间充质干细胞所用；成年健康新疆阿勒泰大尾绵羊9只，雌雄不拘，12
月龄，体质量(33.0±1.5)kg，单独圈养于新疆医科大学动物中心。

经bFGF转染的骨髓间充质干细胞复合同种异体支架骨、β-磷酸三钙及同种异体支架骨材料由新
疆医科大学第一附属医院口腔修复科提供。

实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[5]。

基因转染骨髓间充质干细胞复合同种异体骨修复绵羊极限骨缺损实验的主要实验试
剂及仪器：
试剂及仪器来源一抗为 Rabbit Anti-OPN/BSP(兔抗骨桥蛋白抗体)、Rabbit
Anti-Collagen Ⅰ(兔抗Ⅰ型胶原抗体)二抗为山羊抗兔抗体，显色液为浓缩型DAB 试剂盒，封闭血清为进口山羊血清，脱钙液为进口脱钙液1×71倒置荧光显微镜HR40-IIA2生物安全柜3543二氧化碳孵育箱ZHJH-1214C超净工作台LEICA DM 3000显微镜、LEICA RM 2135切片机BCD-539WT冰箱GZX-9070 MBE
数显鼓风干燥箱EYELA SLI-700恒温培养箱HC-2514高速离心机G70F20N2L-DG(SO)微波炉A1-V通风柜北京博奥森北京中杉金桥OLYMPUS，日本Thermo，德国Thermo Fisher，美国思龙，中国Leica，德国Haier，中国博迅，中国东京
理化，日本中佳，中国格兰仕，中国雷柏特，中国
实验方法：
骨髓间充质干细胞的培养[6]：取6月龄新疆阿勒泰大尾绵羊，髂骨区备皮，碘伏
消毒皮肤，选16号骨穿针进行穿刺，抽取约30 mL骨髓血，以体积1∶5比例加入3%肝素钠内不间断颠倒混匀，迅速放入超净台，将骨髓血用无菌滤网过滤至
50 mL离心管内，再以体积1∶1与DMEM-F12培养基(含1%青-链霉素、2.38
g/L Hepas、0.6 g/L L-谷氨酰胺、0.05-0.06 g/L抗坏血酸及体积分数10%胎牛
血清)共4-6 mL，在25 cm2细胞培养瓶内进行全骨髓培养法，放入37 ℃、体积分数5%CO2恒温孵育箱内培养，每二三天进行半换液，直到血红细胞基本被培
养基替代，镜下观察即可见细胞贴壁生长，大小不一，呈短梭形、多角形及不规则形，此后每二三天全换液，待细胞融合达90%-95%时，1∶2-1∶3传代或冻存，见图1。

图1 羊骨髓间充质干细胞第1代培养第7天(光镜，×10)Figure 1 Morphology
of sheep bone marrow mesenchymal stem cells in the first generation after culture for 7 d(Light microscopy, ×10)注：细胞呈短梭形、多角形及不规则形。

骨髓间充质干细胞的诱导：第1代骨髓间充质干细胞培养5-7 d后，将培养液换
成诱导培养基(DMEM-F12培养基中含1%青-链霉素，2.38 g/L Hepas、0.6 g/L L-谷氨酰胺、0.05-0.06 g/L L-抗坏血酸、2.16 g/L β-甘油磷酸钠、4 μg/L地塞
米松及体积分数10%胎牛血清)。

入37 ℃、体积分数5%CO2恒温孵育箱内培养，每二三天换液，待细胞融合达90%-95%时，1∶2-1∶3传代至第3代，细胞呈长梭形，形态较均一，排列旋涡状，生长旺盛，冻存备用，见图2。

图2 羊骨髓间充质干细胞成骨诱导培养第3代第7天(光镜，×10)Fig ure 2 Sheep bone marrow mesenchymal stem cells at the 3rd generation after culture for 7 d (Light microscopy, ×10)注：细胞呈长梭形，形态较均一，排列
旋涡状，生长旺盛。

构建bFGF慢病毒载体：参照本课题组前期实验方法[7]，复苏293-FT细胞，二三天传代，传代3次后，接种于6孔板，待细胞生长达90%-95%融合时即可开始转染bFGF基因质粒，转染293-FT细胞48 h后收集慢病毒上清1 mL/冻存管，-
80 ℃ 冻存备用。

采用课题组前期转染方法用慢病毒液转染骨髓间充质干细胞[8]。

①转染前1 d，消化诱导培养第3代羊骨髓间充质干细胞并计数，1×107 L-1的
细胞浓度接种入6孔板，孵育过夜。

②转染当天，每细胞孔中加入1 mL病毒液，再加入10 mg/L Polybrene，孵育过夜。

③第3天，全换液，37 ℃，体积分数5%CO2潮湿的孵箱孵育过夜。

④第4天，用含5 mg/L Blasticidin的培养基全换液，孵育过夜；以后每三四天换1次液(含Blasticidin的培养液)。

⑤第14-16天，经10-12 d的Blasticidin压力筛选后，可见数个大小不等的、分散的细胞团块。

羊松质骨支架材料与骨髓间充质干细胞的复合培养：参照本课题组前期实验方法[9]，无菌条件下将准备好的羊松质骨材料置于6孔板中，加入适量DMEM/F12
培养液预湿12 h，将培养液吸干弃去。

分2组，每组2块支架，每块1孔，共4孔。

调整细胞悬液浓度为1×1010 L-1，于超净台内向每块支架缓慢滴加细胞悬液
100 μL，置37 ℃，体积分数为5% CO2饱和湿度孵箱内孵育。

2 h后将6孔板
取出，于超净台内沿6孔板壁缓慢加入DMEM/F12培养液3 mL，放入培养箱中培养。

每日倒置相差显微镜观察材料周围和孔隙内细胞形态、生长情况；复合培养后第7天扫描电子显微镜观察细胞在材料表面的黏附、生长、增殖和基质分泌情况。

实验动物模型建立：实验前将9只阿勒泰大尾羊单独圈养并禁食24 h，3%戊巴比妥钠0.005-0.02 mg/kg耳缘静脉推注麻醉，在双侧髂骨区备皮，常规消毒后，
由皮依次分层至髂骨骨膜，翻开骨膜，在其外侧用牙科慢速机制备15
mm(长)×10 mm(宽)×10 mm(高)大小骨缺损(预实验3个月末已证实此范围缺损
无法自行成骨修复，正式实验不再重复，未设空白组)，用生理盐水冲洗去除骨碎
屑后随机均分成3组，均于左侧植入bFGF+骨髓间充质干细胞(1×1010 L-1)+同
种异体骨作为基因转染细胞支架组，于其中3只右侧植入骨髓间充质干细胞
(1×1010L-1)+同种异体骨作为细胞支架组，另3只右侧植入β-磷酸三钙作为磷酸三钙组，剩余3只右侧植入同种异体骨作为支架组，见图3。

图3 在阿勒泰大尾羊髂骨区制备15 mm×10 mm×10 mm骨缺损模型Figure 3 Preparation of a bone defect mo del of 15 mm×10 mm ×10 mm in the Altay tailed sheep iliac area
等待缺损区血充盈，再将骨膜复位缝合，依次缝合术区。

免疫组织化学染色：每组动物于术后4，8，12周末各处死1只，分离出手术部位骨块(边界大于术区)，去尽软组织，体积分数10%甲醛液固定24 h，进口脱钙液
脱钙处理后常规脱水包埋，制成蜡块。

选取各组蜡块进行组织切片，每组20张，置入60 ℃烤箱过夜，每例中取5张进行常规的苏木精-伊红染色，其他切片进行
免疫组织化学染色，二甲苯处理，梯度乙醇脱水，自来水洗1次，蒸馏水洗3次，5 min/次，将切片放入装有体积分数3%H2O2的塑料盒内去除过氧化物酶，室温
浸泡10 min，0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次。

再将切片放入装有枸橼酸钠
缓冲液的高压修复盒内，高温微波修复10 min，取出后自然冷却至室温，0.01 mol/L PBS浸洗3次，5 min/次。

山羊血清封闭非特异性抗原37 ℃ 30 min，0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次。

分别用兔抗BSP抗体、兔抗Collagen Ⅰ抗体孵育切片，4 ℃冰箱过夜。

用0.01 mol/L PBS浸洗3次，5 min/次。

滴加通用型二抗37 ℃ 孵育30 min。

用 0.01 mol/L PBS浸洗3次，5 min/次。

显微镜下用新鲜配制的DAB液显色，待显色充分，及时用自来水终止显色。

苏木精复染，盐酸乙醇分化，0.01 mol/L PBS返蓝。

梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

采用LEICA DM 3000数码显微镜采集图像进行观察分析，观察骨涎蛋白和Ⅰ型胶原的表达，摄取图像，用Image-Pro Plus分析软件进行图像分析。

主要观察指标：各组大体观察、组织学观察、免疫组织化学观察结果。

统计学分析：数据均以表示，由统计人员经SPSS 17.0统计软件进行处理，两组
间比较用t 检验，多组间比较用方差分析，P ＜ 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results
2.1 各组大体观察结果术后4，8，12周实验动物均存活，伤口愈合良好。

术后4周，基因转染细胞支架组移植区完全被骨膜覆盖，剖面见致密结缔组织，
至8，12周移植区内新骨形成逐渐增多，骨皮质表面平整无凹陷或凸起，人工骨
与周边骨床界限不清，用口腔探针刺探缺损修复区硬度与周围基本一致，达到正常骨硬度。

术后4周，细胞支架组、磷酸三钙组、支架组在各时间点均无明显新骨生成，但
各有差异。

细胞支架组移植区后完全被骨膜覆盖，剖面见结缔组织，随时间点推移有所增加但不明显，总体较基因转染细胞支架组稀疏，植骨区特别是中间部位硬度下降明显；支架组移植区后骨膜覆盖完整，术区剖面有结缔组织，结缔组织内可见
部分支架材料松散存在，口腔探针刺探植骨区硬度广泛明显降低；磷酸三钙组移植区后骨膜覆盖完整，口腔探针刺探植骨区硬度与周围正常骨一致，但修复区明显隆起突出，表面光滑连续，硬度变化小。

2.2 各组组织学观察结果基因转染细胞支架组术后4周苏木精-伊红染色见移植区同种异体骨有部分吸收，周围充满纤维结缔组织，手术结合区有成软骨样结构及成骨样细胞出现，同种异体骨周围多有破骨样细胞围绕，中央区同种异体骨内开始出现骨小梁结构，内有成骨样细胞圈状排列；至8，12 周，移植区内新骨形成进一
步增多，同种异体骨孔洞内成骨样细胞分泌的成骨基质逐渐连接成片，部分区域新骨逐渐改建成熟。

同种异体骨材料吸收明显，其吸收后的间隙由新生骨所取代，同种异体骨内及周围组织未见炎性细胞浸润，见图4。

图4 将转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞与同种异体骨联合
植入羊髂骨极限缺损处4周末的苏木精-伊红染色(光镜，×10)Figure 4 Basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cells combined with allogeneic bone implantation for repair of critical-size bone defects in sheep iliac bone at the end of 4 wk under light
microscopy(Hematoxylin-eosin staining, ×10)注：移植区同种异体骨有部分吸收，周围充满纤维结缔组织，手术结合区有成软骨样结构及成骨样细胞出现，同种异体骨周围多有破骨样细胞围绕，中央区同种异体骨内开始出现骨小梁结构，内有成骨样细胞圈状排列。

4周末，细胞支架组手术结合区出现成软骨样结构和成软骨样细胞，但中央区为死骨结构，支架材料内充有纤维结缔组织，但较基因转染细胞支架组稀疏，术区少有破骨样细胞，随时间点迁移，至8，12周有支架骨材料降解，无其他明显骨改建，见图5。

4周末支架组、磷酸三钙组主要为死骨结构，手术结合区有成软骨样细胞及结构，
术区材料周围有成纤维细胞包绕，细胞成分单一，至8，12周末基本无明显骨改建，见图6，7。

图5 将骨髓间充质干细胞与同种异体骨联合植入羊髂骨极限缺损处4周末的苏木精-伊红染色(光镜，×10)Figure 5 Bone marrow mesenchymal stem cells combined with allogeneic bone implantation for repair of critical-size bone defects in sheep iliac bone at the end of 4 wk under light
microscopy(Hematoxylin-eosin staining, ×10)注：手术结合区出现成软骨样结构和成软骨样细胞，但中央区为死骨结构，支架材料内充有纤维结缔组织，但较稀疏，术区少有破骨样细胞。

图6 将同种异体骨植入羊髂骨极限缺损处4周末的苏木精-伊红染色(光镜，
×10)Figure 6 Allogeneic bone implantation for repair of critical-size bone defects in sheep iliac bone at the end of 4 wk under light microscopy (Hematoxylin-eosin staining, ×10)注：主要为死骨结构，手术结合区有成软骨样细胞及结构，术区材料周围有成纤维细胞包绕，细胞成分单一。

图7 将β-磷酸三钙植入羊髂骨极限缺损处4周末的苏木精-伊红染色(光镜，
×10)Figure 7 β-tricalcium phosphate implantation for repair of critical-size bone defects in sheep iliac bone at the end of 4 wk under light microscopy(Hematoxylin-eosin staining, ×10)注：主要为死骨结构，手术结合区有成软骨样细胞及结构，术区材料周围有成纤维细胞包绕，细胞成分单一。

2.3 各组免疫组织化学观察结果见图8，9。

图8 将不同材料植入羊髂骨极限缺损处12周末的骨涎蛋白表达情况(免疫组织化学染色，×10)Figure 8 Bo ne sialoprotein expression at the end of 12 wk after different materials implanted into critical-size iliac bone defects of sheep (Immunohistochemical staining, ×10)
基因转染细胞支架组：术后4周末可见中等量骨涎蛋白及Ⅰ型胶原阳性染色的细
胞间质，染色部位呈现棕黄色，支架骨与正常骨交界区阳性染色较多，且以围绕支架材料周围为多，支架材料周围可见多核的破骨样细胞，随时间点推移，支架材料面积有逐渐减小的趋势，周围可见成骨样细胞增多，骨基质中骨涎蛋白及Ⅰ型胶原含量增多，阳性范围明显增加，以致棕黄色染色连成片状布满视野，见图8A、图
9A。

细胞支架组：术后4周植入区内可见少量骨涎蛋白及Ⅰ型胶原阳性染色的细胞间质，阳性表达分布范围较分散，呈零星状，多在支架骨与正常骨界面区和支架骨周围，成骨样细胞少见，支架骨孔洞内有纤维组织，且未能填满孔洞，随时间点推移，阳性染色范围略有增加，周围可见成骨样细胞增多呈圈状包绕，见图8B，图9B。

支架组：术后各时间点骨涎蛋白及Ⅰ型胶原表达情况与细胞支架组类似，但支架骨孔洞内纤维组织与周围骨片不连续，周围基本无成骨样细胞及破骨样细胞，见图
8C，图9C。

磷酸三钙组：术后各时间点骨涎蛋白及Ⅰ型胶原表达情况与支架组类似，中央区可见未降解的无活性样β-磷酸三钙材料，见图8D，图9D。

图9 将不同材料植入羊髂骨极限缺损处12周末的Ⅰ型胶原表达情况(免疫组织化
学染色，×10)Figure 9 Collagen typeⅠexpression at the end of 12 wk after different materials implanted into critical-size iliac bone defects of sheep (Immunohistochemical staining, ×10)
2.4 免疫组织化学统计分析参照Francisco等[10]的方法，利用LEICA DM 3000
数码显微镜摄取图像，先在显微镜下仔细观察每一片的表达情况，选表达阳性标本进行测量。

每张切片随机选取5个400倍光学显微镜下视野。

为获得具有可比性
的吸光度值，在采集图像时选择相同的光源、光圈大小、亮度、对比度、色彩饱和度、增益及锐度等条件。

将图像信息传输到Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件，选择平均吸光度值作
为参考指标。

平均吸光度值即所选范围内的所有象素点灰度值的平均，代表该标本的表达强度，平均吸光度值越大则阳性染色越强[11]。

对4组免疫组织化学阳性的表达进行显微图像分析，结果见表1，2。

表1 将不同材料植入羊髂骨极限缺损处不同时间点的骨涎蛋白平均吸光度值比较Table 1 Absorbance values of bone sialoprotein expression at different
time after different materials implanted into critical-size iliac bone defects
of sheep ±s)与A组比较，aP ＜ 0.05。

注：A-D 分别植入碱性成纤维细胞生长
因子+骨髓间充质干细胞+同种异体支架骨、骨髓间充质干细胞+同种异体支架骨、同种异体支架骨及β-磷酸三钙。

结果说明A组成骨效果最好。

组别植入4周植
入8周植入12周0.289±0.036 B 0.241±0.026a 0.253±0.020a 0.257±0.025a
C 0.249±0.027a 0.252±0.025a 0.269±0.029a
D 0.236±0.040a 0.246±0.033a
0.256±0.032a A 0.269±0.0370.274±0.022
表2 将不同材料植入羊髂骨极限缺损处不同时间点的Ⅰ型胶原平均吸光度值比较Table 2 Absorbance values of collagen type Ⅰ expression at different time after different materials implanted into critical-size iliac bone defects of sheep ±s)与A组比较，aP ＜ 0.05。

注：A-D 分别植入碱性成纤维细胞生长因子+骨髓间充质干细胞+同种异体支架骨、骨髓间充质干细胞+同种异体支架骨、同
种异体支架骨及β-磷酸三钙。

结果说明A组成骨效果最好。

组别植入4周植入
8周植入12周A 0.222±0.005 0.242±0.003 0.271±0.0036 B 0.092±0.003a 0.095±0.002a 0.098±0.002a C 0.081±0.001a0.085±0.001a 0.088±0.002a D 0.078±0.001a 0.079±0.001a 0.081±0.002a
由表可看出骨涎蛋白及Ⅰ型胶原阳性表达的平均吸光度值在各组中随时间推移略有增加，基因转染细胞支架组两项指标平均吸光度值均明显高于其他各组(P ＜ 0.05)，
但其自身在时间上并无统计学差异。

细胞支架组、支架组及磷酸三钙组3组之间
均差异无显著性意义(P ＞ 0.05)。

3 讨论 Discussion
传统骨移植方法修复大面积骨缺损存在着可获得的骨量有限、成形困难、排斥反应和供区并发症等缺陷。

组织工程骨的应用为修复大面积骨缺损带来新的希望。

Schmitz等[12]最早定义骨极限缺损的概念，即指在特定的骨骼上所造成的终生不能自行修复并愈合的最小缺损。

他们首先建立了大鼠、兔和狗颅骨极限缺损模型，已被大量应用于测量评价各种骨替代材料的修复效果。

实验采用Schmitz的标准，采用转染bFGF基因的骨髓间充质干细胞复合支架材料构建组织工程骨，通过骨传导作用、骨生成作用、骨诱导作用修复髂骨极限缺损[13]。

bFGF是促进细胞生长作用很强的多肽因子，它是骨组织工程中信号调节因子之一，对骨组织的损伤有修复作用。

成骨细胞胞膜表面存在bFGF受体，成骨细胞合成的bFGF以自分泌或旁分泌形式释放到胞外与受体结合，可促进骨原细胞分化为成骨细胞，诱导成骨细胞分裂、增殖，并促使其合成骨基质、钙结合蛋白及含有羟基磷灰石颗粒的基质小泡，加快基质钙化。

bFGF可促进成软骨细胞增殖，并合成Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原，加速骨折端软骨形成。

同时bFGF也是一种强大的促血管生长因子，刺激血管内皮细胞增殖和迁移，诱导内皮细胞长入胶原基质中，并形成与毛细血管相似的管腔，对血管的爬入支架内起到了促进作用[14]。

许多体内外实验均表明外源性植入碱性成纤维细胞生长因子能明显促进骨形成过程[15-16]，但是外源性碱性成纤维细胞生长因子在体内易降解，影响疗效。

因此实
验用分子生物学技术，用慢病毒载体携带bFGF基因转染骨髓间充质干细胞，为成骨修复提供成骨潜能细胞，且提供生长因子基因诱导其分化成骨，增强成骨活性，最后复合具有桥梁支架作用的同种异体骨修复骨缺损，产生更强大的骨诱导能力、更稳定的物理性能及良好的生物相容性，最终促进机体成骨修复。

李春明等[17]利
用bFGF基因转染犬骨髓间充质干细胞组织工程骨预构复合体+种植体修复犬颌骨极限骨缺损，通过实验发现种植体复合bFGF基因转染的犬骨髓间充质干细胞(或未转染骨髓间充质干细胞)都能够良好地修复颌骨缺损，并能够使种植体与组织工程骨形成良好的骨结合。

这些利用骨组织工程技术，特别是基因转染技术的复合组织工程骨，成为近几年修复大面积骨缺损研究、应用发展的前沿。

骨涎蛋白是由成骨细胞、破骨细胞和成齿细胞合成的磷酸化糖蛋白，主要分布于矿化的胶原基质如骨、牙本质、牙骨质和生长期的钙化软骨以及含有矿化区的软组织中[8]。

骨涎蛋白是骨新陈代谢的标志物, 能激活成骨细胞、成骨样细胞，可优先与Ⅰ型胶原的α-2链相连结，形成羟基磷灰石结晶晶核，引导矿化的形成。

在新形成骨及骨再建活跃部位高表达，骨涎蛋白在未成熟成骨细胞的前体细胞中不表达，分化的早期短暂表达，后来在分化成熟的成骨细胞中表达量明显增加。

骨涎蛋白在血管形成过程中也起着重要作用。

新生毛细血管的血管内皮细胞表面可表达αvβ3 整合素受体，该受体可识别骨涎蛋白的C末端RGD序列。

骨形成初期是无血管的软骨，软骨在生长期间需血管长入及成骨细胞与破骨细胞的参入才能转变成骨。

软骨细胞和成骨细胞可表达血管形成分子如骨涎蛋白,它可在骨基质钙化中支持血管的长入。

研究证实骨涎蛋白参与骨的早期形成，通过电子显微镜在早期矿化沉积物中观察到骨涎蛋白。

所以在骨形成过程中的血管生长入骨，骨涎蛋白起着重要的支持作用[18]。

李景辉等[19]用人恒牙牙髓干细胞诱导培养至第3代，接种到三维明胶支架上进行成骨向诱导培养，诱导14 d后植入裸鼠背部皮下，通过免疫组织化学方法检测骨涎蛋白的表达等验证其成骨效果。

Ⅰ型胶原由成骨细胞以原胶，原的形式分泌，骨基质 90%由Ⅰ型胶原构成，Ⅰ型胶原纤维间通过特殊的共价键相互组合，为钙盐沉积提供基础。

有研究发现，高水平的Ⅰ型胶原 mRNA表达反映了成骨细胞的大量形成[20]。

Ⅰ型胶原对维持骨结构的完整及骨生物力学特性，防止骨的变形和断裂起着非常重要的作用，它决定着。