培养条件对蝙蝠蛾拟青霉菌株SH-1产生粉红色变化的影响

培养条件对蝙蝠蛾拟青霉菌株SH-1产生粉红色变化的影响张宗豪;李玉玲
【摘要】冬虫夏草[Cordyceps sinensis (BerK.) Sacc.]菌培养过程中,蝙蝠蛾拟青
霉菌株SH-1的菌丝产生粉红色变化的现象,粉红菌株与SH-1菌株形态上存在很大差异,为查明产生的原因,在草因素试验基础上考察培养时间、培养温度、光照、pH 和装液量对粉红色变化的影响,通过响应面法优化冬虫夏草真菌的培养环境,分析影
响粉红色变化的关键因素.结果表明,产生粉红变化的最适培养条件为培养时间80d、培养温度20.55℃、pH 7.51、装液量250 mL,在此培养基条件下,粉红菌株ZH-1
产生概率为35.14％;得出菌株ZH-1的最大得率培养条件为培养时间80 d、培养
温度为22.25℃、pH 6.89、装液量250 mL,在此培养基条件下,粉红菌株ZH-1得率为8.95％.
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2016(000)013
【总页数】7页(P3420-3425,3429)
【关键词】冬虫夏草菌[Cordyceps sinensis(BerK.) Sacc.];响应面法;蝙蝠蛾拟青霉;培养条件;粉红色变化
【作者】张宗豪;李玉玲
【作者单位】青海大学畜牧兽医科学院,西宁810016;青海大学畜牧兽医科学院,西
宁810016
【正文语种】中文
【中图分类】S567.3+5
冬虫夏草［Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.］为真菌界（Fungi）子囊菌纲（Asocmycotetes）肉座菌目（Clavicipitales）麦角菌科（Clvaieipiacteae）冬虫夏草属（Cordyceps）的蝙蝠蛾拟青霉寄生在蝙蝠娥科昆虫幼虫上的子座及幼
虫尸体的复合体，具有补肺益肾、止血化痰的功效，可用于久咳虚喘、阳痿遗精、腰膝酸痛的治疗［1］。

冬虫夏草主要分布在中国青海、西藏、四川、甘肃等海拔
3 000～5 000m的地区，冬虫夏草是主产区群众经济来源的重要组成部分［2］。

近年来，冬虫夏草被过度采挖，使冬虫夏草野生资源濒临枯竭，野生冬虫夏草生产面积正在逐年缩小，产量也随之下降［3］。

冬虫夏草菌无性型的分离与鉴定工作在多年以前就已进行［4，5］，分离到的冬
虫夏草真菌菌丝体是天然冬虫夏草的替代品，其成分、含量与天然冬虫夏草非常相似［6］。

在静止培育冬虫夏草菌株SH-1的过程中，发现部分培养瓶内菌丝体生
长到一定时期，从中间开始转化成粉红色，逐步蔓延到瓶壁，原先的粗糙表面变成有张力、有韧性的光滑表面，富含水分，周围又形成多层毛刺状结构。

随着生长瓶内培养物往往形成一个整体，周围与瓶壁紧密结合，培养物颜色鲜艳，整体呈果冻状，将产生变化后的粉红色菌株编号为ZH-1。

粉红色变化影响了SH-1的正常生长，为了查明产生的原因和可能存在的相互关系，本试验针对培养过程中与菌株生长有直接关系的培养基配方进行研究，利用响应面法分析配方组合对粉红菌株产生的影响。

Box-Behnken设计结合响应面法是通过多元线性拟合或二项式回归分析来表达因素与响应值之间函数关系的一种统计方法［7，8］，可以明确任意两个
因素的交互作用，结果直观、可靠，且试验效果好［9］。

本研究在单因素试验的基础上选择培养时间、培养温度、pH、装液量4个主要因
素［10，11］，考察4个因素对粉红菌株ZH-1产生的概率和得率、SH-1得率的影响，对影响粉红菌株产生的概率和得率的培养条件进行了优化，以期找出适合粉
红菌株生长的最适培养条件，为下一步阐明两个菌株之间的关系和探讨产生的机理提供数据支持和理论依据。

1.1 材料、仪器和试剂
供试菌种：冬虫夏草菌由青海省畜牧兽医科学院纯化培养，编号为SH-1，经中国科学院微生物研究所鉴定为蝙蝠蛾拟青霉，保存备用。

仪器：组培瓶、高压灭菌锅、超净工作台、多功能光照培养箱、FA1004型电子分析天平。

分离用固体培养基（改良PDA培养基）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂
15～20 g，自来水1 000mL，添加3 g牛肉膏。

培养用液体培养基：每200mL溶液中，土豆20 g、胡萝卜10 g、氮源A 45mL、氮源B 5 g、葡萄糖8 g、MgSO4为0.1 g、K2HPO4为0.4 g。

1.2 方法
1.2.1 培养条件冬虫夏草菌液体培养条件：500mL的培养瓶中加入培养液200mL，接种量10mL，pH 5.8，培养温度20℃，光照条件为自然光照，培养时间60 d。

单因素试验每个处理134瓶，重复3次。

响应面试验每个处理20瓶，重复3次。

1.2.2 菌丝体生物量的测定每个处理菌丝体在生长到60 d以后，收集已长成菌块
的菌丝体，用去离子水洗涤3次，60℃条件下干燥至恒重，即为菌丝体干重。

1.2.3 产生概率和得率的计算
式中，M为收取的菌丝体干重（g），V为平均装液量（mL）。

1.2.4 单因素试验和响应面法试验设计冬虫夏草菌的培养过程中，影响粉红菌株可
能的因素有培养时间、光照条件、培养温度、pH及装液量，对这些条件进行单因素试验。

1）培养时间对产生粉红菌株ZH-1概率及其得率的影响。

固定光照为自然光，温
度20℃，pH 5.8，装液量200mL，选择培养时间为20、40、60、80、100 d进
行试验。

2）光照条件对产生粉红菌株ZH-1概率及其得率的影响。

固定培养时间为60 d，温度20℃，pH 5.8，装液量200mL，选择光照条件为无光照、自然光照、全日
光照进行试验。

3）培养温度对产生粉红菌株ZH-1概率及其得率的影响。

固定培养时间为60 d，光照条件为自然光照，pH 5.8，装液量200mL，选择培养温度为5、10、15、20、25、30℃进行试验。

4）pH对产生粉红菌株ZH-1概率及其得率的影响。

固定培养时间为60 d，光照
条件为自然光照，培养温度20℃，装液量200mL，选择pH为4、5、6、7、8、9、10进行试验。

5）装液量对产生粉红菌株ZH-1概率及其得率的影响。

固定培养时间为60 d，光照条件为自然光照，培养温度20℃，pH 5.8，选择装液量为100、150、200、250、300mL进行试验。

应用Design-expert 8.0软件，设计4因素3水平的响应面试验，利用响应面试
验结果，确定产生粉红变化的最适培养条件以及影响粉红菌株ZH-1得率的最适培养条件。

试验因素与水平见表1。

2.1 冬虫夏草菌培养条件单因素试验结果
2.1.1 培养时间对产生粉红菌株ZH-1概率及其得率的影响由图1可知，培养时间为60 d时SH-1产生ZH-1的变化概率最大。

图2显示，随着时间的增加，菌株SH-1和ZH-1的得率也在增加，60 d后两个株菌得率的增长趋势变缓，考虑到培养效率与成本，培养时间选择60 d为宜。

培养过程中，SH-1产生ZH-1的变化
概率由18.66%下降为13.43%，部分ZH-1在没有完全覆盖原来的菌盖之前，又
从边缘开始变白，重新生成正常菌丝，因此，ZH-1的数量随时间的增长而下降。

2.1.2 光照条件对产生粉红菌株ZH-1概率及其得率的影响由图3可知，光照条件
对菌株SH-1产生ZH-1的变化概率影响不大。

图4显示，随着光照条件的改变，菌株SH-1和ZH-1的得率没有显著变化，因此，选择光照条件为自然光照。

2.1.3 培养温度对产生粉红菌株ZH-1概率及其得率的影响由图5可知，不同培养温度对菌株SH-1产生ZH-1的变化概率影响较大，在25℃时，变化概率最大。

图6显示，低温（小于10℃）时没有产生粉红菌株ZH-1，随着温度的进一步升高，菌株SH-1和ZH-1的得率呈先增加后降低的趋势，但ZH-1的得率变化不显著，因此，选择培养温度20℃为宜。

2.1.4 pH对产生粉红菌株ZH-1概率及其得率的影响由图7可知，pH为7时菌株SH-1产生ZH-1的变化概率最大。

图8显示，在pH为7时菌株ZH-1的得率产
生最大值，而菌株SH-1的得率在pH为6时产生最大值。

在pH为4和8时，没有菌株ZH-1出现，说明pH对菌株SH-1产生ZH-1的变化概率影响较大，因此选择pH 7为宜。

2.1.5 装液量对产生粉红菌株ZH-1概率及其得率的影响由图9可知，装液量为300mL时菌株SH-1产生ZH-1的变化概率最大。

图10显示，菌株ZH-1与SH-1的得率随着装液量的增加而增加，得率最大值都产生在装液量为300mL时，说明装液量对粉红菌株ZH-1的产生和得率都有影响。

2.2 响应面法试验结果
通过单因素试验分析，筛选出培养时间（X1）、培养温度（X2）、pH（X3）、
装液量（X4）4个主要因素，采用Box-Behnken设计结合响应面法，以菌株SH-1产生菌株ZH-1的概率（Y1）和ZH-1的得率（Y2）为响应值，考察影响产生
粉红菌株的培养条件，试验结果见表2。

根据表3中回归模型的方差分析可知，模型1的F=5.862 1，P＜0.01，模型2的F=166.352 7，P＜0.000 1，说明本试验所选用的二次多项式模型具有高度的显著性。

模型1的失拟项F=4.722 2，P=0.074 0＞0.05，模型2的失拟项F=4.705 8，
P=0.074 5＞0.05，失拟项均不显著，2个模型的决定系数R2值分别为0.854 3
和0.994 0，说明2个模型能够解释85.43%和99.40%的响应值变化。

因此，该
模型拟合程度较好，可以用此模型来分析和预测菌株ZH-1的产生概率和得率。

在总的作用因素中，回归方程一次项X1、X2、X4对菌株ZH-1产生概率的影响达
到显著或极显著水平；回归方程一次项X1、X2、X4，二次项X12、X22、X32和交互项X1X2、X1X3、X1X4、X2X4对菌株ZH-1得率的影响达到显著或极显著
水平，由F值的大小可以推断3个因素影响菌株ZH-1得率（Y2）的大小顺序为
X4＞X2＞X1。

试验所选用的4个因素，不仅影响到菌株SH-1产生菌株ZH-1的概率，而且对粉红菌株ZH-1得率有影响。

分别以Y1、Y2为响应值，以X1、X2、X3、X4为因
变量，通过拟合可求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联方程，多元回归拟合分析得到产生粉红菌株ZH-1的概率和ZH-1得率的二次方程（表4）。

2.3 因素间的交互影响
根据拟合模型绘制菌株ZH-1产生概率和得率响应面三维图与等高线，可直观地看出响应面的最高点，即参数范围内的极值以及因素间的相互作用对响应值的影响，依次可以确定最适培养基配方条件范围，采用Design-expert 8.0软件处理后三维响应面和等高线见图11、图12。

分析可知，培养温度（X2）对菌株SH-1产生ZH-1的概率影响极显著，培养时
间（X1）与装液量（X4）对菌株SH-1产生ZH-1的概率影响显著。

培养时间
（X1）、培养温度（X2）与装液量（X4）对粉红菌株ZH-1的得率有极显著影响，表现为曲线较陡，即随着元素含量的增加或减少，响应值变化较大；其他项影响较小，表现为曲线较为平滑。

交互项影响中，对于粉红菌株ZH-1的产生概率，交互作用不显著。

培养时间（X1）与培养温度（X2）、培养时间（X1）与pH（X3）、
培养时间（X1）与装液量（X4）、pH（X3）与装液量（X4）对菌株ZH-1得率
有显著的交互作用。

2.4 菌株ZH-1产生概率及得率的最适配方
确定通过软件Design-expert 8.0求解方程，得出发生粉红变化产生菌株ZH-1的最适培养条件为培养时间80 d、培养温度20.55℃、pH 7.51、装液量250mL，
在此培养基条件下，粉红菌株ZH-1产生概率为35.14%；得出ZH-1的最大得率培养条件为培养时间80 d、培养温度22.25℃、pH 6.89、装液量250mL，在此
培养基条件下，粉红菌株ZH-1得率为8.95%。

本研究以冬虫夏草菌菌丝体生物量为量化指标，从培养时间、培养温度、光照条件、pH、装液量5个因素进行单因素试验，在此基础上通过响应面法试验，建立了培
养时间、培养温度、pH、装液量4个因素与冬虫夏草粉红菌株产生概率之间的数
学模型，研究采用响应面法确定环境因素影响粉红菌株产生的可行性［12］。

试
验表明，模型的回归效果显著，培养温度、培养时间与产生粉红菌株有直接关系，可作为预测粉红菌株产生的参考因子，4个因素的交互作用对产生粉红菌株ZH-1
和ZH-1得率有一定的影响。

试验确定了产生粉红菌株ZH-1最适的培养条件和获得ZH-1最大得率的培养条件。

【相关文献】
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