真菌感染的非培养诊断进展
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– 隐球菌细胞壁为alpha-葡聚糖,故为阴性
• 阳性结果只能代表存在侵袭性真菌感 染,不能确定种类
侵袭性真菌感染中葡聚糖检测
AML, MDS Receiving antifungal prophylaxis
Clin Infect Dis 2004;39:199-205
侵袭性真菌感染的葡聚糖检测
12.9% Candida
Aspergillus
54.84%
9.68%
Mucor
19.35%
Cryptococcus
西南医院尸解资料，(1971-2000)，郝飞教授提供
曲霉感染: 日益严重的问题
• 曲霉是继念珠菌之后的第二常见真菌
病原体 • 虽然经过治疗，免疫抑制患者的死亡
率仍达90%
Andriole VT. J Antimicrob Chemother 1999;44:151-162; Groll AH et al. Adv Pharmacol 1998;44:343-500; Denning DW. Clin Infect Dis 1998;26:781-805; Andriole VT. Curr Clin Top Infect Dis 1998;18:19-36; Lin S-J et al. Clin Infect Dis 2001;32:358-366; Paterson DL, Singh N. Medicine
• 两种试剂盒
– Fungitec-G (marketed in Japan)
• Obayashi, Lancet 345:17-20, ’95 • “确诊真菌感染的患者”: 90% sensitive
– Glucatell (approaching US licensure)
• Ostrosky
– 多中心研究 189 侵袭性真菌感染高危的患者* – 每名患者取材1次: Sensitivity: 70%;
方法：G试验
• β-葡聚糖可特异性激活鲎（Limulus）变 形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物 凝固，故称G试验。
- b-1,3-D-葡聚糖通过激活G因子（ Factor G） 引起凝集；
– 内毒素通过激活C因子（Factor C）引起凝 集；
• 试剂盒: 祛除Factor C 葡聚糖特异
β -1,3-D-葡聚糖检测方法
检测曲霉半乳甘露聚糖抗原（GM）
检测位于曲霉细胞壁上的 galactomannan,（GM）
3. Detection – avidin-enzyme + substrate
2. Detecting Ab – anti-galactomannan [biotin conjugated]
Ag – blood, urine, BAL
50-90
80-90
Sabetta et al. JID 1985; 152: 946 Ansorg et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 582 Verweij et al. JCM 1995; 33: 3150 Maertens et al. Blood 2001; 97: 1604 Herbrecht et al. J Clin Oncol 2002; 20: 1898
IA ASP
1950 1960 1970 1980 1990 2000
Kontoyiannis et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002， 21:161-172 Warnock. JAC,1998,41(suppl D):95-105
经尸检证实的侵袭性真菌感染
β 1,3-D-glucan （葡聚糖）
• 真菌细胞壁成份，占50%以上 • 其他微生物、动物及人的细胞不含该成份 • 主要用于念珠菌和曲霉菌感染诊断
mannoproteins
b1,3
b1,6 glucans
PPL bilayer
b1,3 glucan synthase
chitin ergosterol
Imai K et al.2004，Nihon Kokyuki GakkaiZasshi 42:1024–1029
(1) 肺曲霉病患者 (2) 卡氏肺囊虫肺炎患者 (3) 其他确诊或疑似侵袭性真菌感染的患者
Kędzierska et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2007) 26:755–766
26.1%
C. parapsilosis
21.1%
21 3
Edmond et al. Clin Infect Dis 1999;29:239-44.
美国血源性念珠菌感染种类分布
(1998-2000)
C.glabrata 24.46%
C.parapsilosis 13.25%
C.albicans
45.87%
分离率
31.9% 15.7% 11.1%
7.6%
5.7% 5.4% 4.5% 4.4% 1.4% 1.4%
Edmond et al. Clin. Infect. Dis. (1999). 29:239-244
死亡率
21% 25% 32%
40%
24% 27% 28% 33% 26% 23%
侵袭性曲霉病的发病率也在增加…
Keutgen X et al, Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2007
曲霉的GM 抗原检测
乳胶凝集试验（Pastorex® ） (15ng/ml) 酶连免疫吸附试验（Platelia® ） (1ng/ml)
灵敏度（%） 特异度（%）
LA
25-70
90-100
ELISA
真菌感染的非培养诊断进展
真菌感染的流行现状
真菌感染不断增加的原因— 高危人群的增多
AIDS
条件致病菌
脓毒血症的发病率
+600% +300% +300%
Martin et al, NEJM 2003;348:1546
念珠菌血行感染发病率和死亡率高
Nosocomial bloodstream infections in hospitals in the USA
Specificity 87%.
• 界值：Fungitec:20 pg/mL Fungitell:60/80 pg/mL 金山川公司G试剂:50 pg/mL
β-1,3-D-葡聚糖 检测范围
• 不仅可检测念珠菌感染
– 曲霉、镰刀菌 和很多霉菌均存在β-1,3葡 聚糖( Miyazaki, J Clin Micro 33:3115, ‘95)
念珠菌属
2583
81.2
季也蒙念珠菌 365
78.6
其它念珠菌 1158
75.3
光滑念珠菌 5611
65.5
克柔念珠菌 1206
17.7
SDD％ R%
0.7
0.8
4.4
1.8
4.9
2.6
3.3
3.3
4.8
6.1
10.7
8.1
12.9
8.5
11.3
13.4
20.1
14.4
31.1
50.7
临床常见的条件性真菌感染
欧洲已流行近十年，在美国03年刚被批准。
B 乳胶凝集试验（Latex agglutination） (LA Pastorex Aspergillus, Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France)
两种方法比较，前者比后者更有效：
*0.5–1 ng/mL Vs 15 ng/mL。*早5天检测到
• 念珠菌病:最常见，占血源感染的第4位。 • 曲霉菌病:常见于血液系统恶性肿瘤病人，
器官移植常见合并症。
• 隐球菌病: 在艾滋病人发病率为10-20%。 • 接合菌病（毛霉病）: 多见于重症糖尿
病和烧伤病人。
临床有增多趋势的条件性真菌
• 非白念念珠菌感染 • 毛孢子菌感染 • 地霉感染 • 镰刀菌感染 • 枝顶孢霉感染 • 暗色真菌感染 • 马尔尼菲青霉
Fungitell assay
Serum (1? 3)-b-D-glucan (pg/mL)
100001005 10001004
1001003 101002
1100 11
w0 ith3c0a0n.5didPeamtiein1ats c3o1n0.5troNl osrum2baljsects2.5
Clin Infect Dis 2004;39:199-205.
C.tropicalis
Other
C.krusei
1.12%
2.04%
C.lusitaneae
12.23%
1.02%
Hajjeh. et al. (2004) J. Clin. Microbiol. 42(4):1519-1527
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
我国念珠菌种类的变化
菌种
白念珠菌 热带念珠菌 光滑念珠菌 克柔念珠菌 葡萄牙念珠菌 新型隐球菌
85-92 %
80-90 10-13
1-6 1 1 1
96-2002%
43-75 10-15 14-21 5-27 2-5 1-5
常见酵母菌对氟康唑的敏感性
菌名
株数
S％
白念珠菌
38833
98.4
近平滑念珠菌 2628
93.8
热带念珠菌
2990
92.5
葡萄芽念珠菌 274
93.4
新型隐球菌
688
89.1
Johan A et al , Clinical Infectious Diseases 2007; 44:1329–36
1. Capture antibody – monoclonal anti - galactomannan
Specificity = >90% sensitivity = 75%
GM抗原的检测方法
A 酶联免疫吸附法（Platelia Aspergillus-EIA） (PA-EIA Platelia Aspergillus, BioRad,Marnes-la-Coquette, France)
真菌感染的非培养诊断
种特异性 属特异性 真菌通用
PCR
PCR, GM试验
1-3-ß-D-glucan,G试验 PCR
非培养诊断检测方法
• G试验检测b-1,3 –D-葡聚糖 • ELISA法检测曲霉半乳甘露聚糖抗原 • 乳胶凝集试验检测新生隐球菌抗原 • ELISA法检测念珠菌抗原 • PCR_真菌通用引物、种属特异性引物
GM试验注意事项
预处理： *EDTA作预处理，分解免疫复合物，沉淀蛋白 *加热使免疫复合物失活。 界值确定： *阳性>0.5;阴性<0.5;欧美已普遍接受（06年）。 *将界值由1.5改为0.5，敏感性由76.3%提高到 97.4%，特异度由97.5%降至90.5%。 结果判读： *两次阳性可确诊感染。 *重复检测阴性可排除真菌感染。
Cut off 60 pg/ml
3
假阳性原因
*内毒素：NaOH预处理 *抗肿瘤药：香菇糖、裂殖菌多糖 *免疫治疗：白蛋白、球蛋白 *血液透析中使用硝酸纤维素制品 *术中使用棉制品、海绵等 *血红蛋白
细菌及真菌定植状态不影响G试验
Pickering J, et al. J Clin Microbiol 2005; 43: 5957–62
(Baltimore) 1999;78:123-138.
非白念珠菌的增多...
白念珠菌
(53.2%)
934例念珠菌血症
Edmond et al. Clin Infect Dis 1999;29:239-44.
非白念珠菌(46.8%)
非白念念珠菌血症
C. glabrata
42.3%
C. tropicalis
假阴性原因
体液中存在葡聚糖酶使BDG降解。
Kawai R et al.2006，Appl Microbiol Biotechnol 71:898–906
应用对象：
(1) 成人急性髓内白血病，慢性淋巴细胞白血病， 急性淋巴细胞白血病，骨髓发育不良综合症， 非霍奇金淋巴瘤。
(2) 疑有内源性真菌内眼炎的患者 (3) 术后病重患者 (4) 中暑患者 (5) 农民肺
重要致病菌流行病学监测和控制（SCOPE）计划 1995-1998
排名 1 2 3
4
5 6 7 8 9 10
病原
凝固酶阴性葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 肠球菌属
念珠菌属
大肠埃希菌 克雷伯菌属 肠杆菌属 铜绿假单胞菌 锯杆菌属 链球菌属
数量
3908 1928 1354
934
700 662 557 542 177 173
8
All other
Candida spp.
Aspergillus spp. 6
Prevalence at Autopsy [%]
4
2
0 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92
Groll et al, J Infect 1996;33:23-32.
All others
• 阳性结果只能代表存在侵袭性真菌感 染,不能确定种类
侵袭性真菌感染中葡聚糖检测
AML, MDS Receiving antifungal prophylaxis
Clin Infect Dis 2004;39:199-205
侵袭性真菌感染的葡聚糖检测
12.9% Candida
Aspergillus
54.84%
9.68%
Mucor
19.35%
Cryptococcus
西南医院尸解资料，(1971-2000)，郝飞教授提供
曲霉感染: 日益严重的问题
• 曲霉是继念珠菌之后的第二常见真菌
病原体 • 虽然经过治疗，免疫抑制患者的死亡
率仍达90%
Andriole VT. J Antimicrob Chemother 1999;44:151-162; Groll AH et al. Adv Pharmacol 1998;44:343-500; Denning DW. Clin Infect Dis 1998;26:781-805; Andriole VT. Curr Clin Top Infect Dis 1998;18:19-36; Lin S-J et al. Clin Infect Dis 2001;32:358-366; Paterson DL, Singh N. Medicine
• 两种试剂盒
– Fungitec-G (marketed in Japan)
• Obayashi, Lancet 345:17-20, ’95 • “确诊真菌感染的患者”: 90% sensitive
– Glucatell (approaching US licensure)
• Ostrosky
– 多中心研究 189 侵袭性真菌感染高危的患者* – 每名患者取材1次: Sensitivity: 70%;
方法：G试验
• β-葡聚糖可特异性激活鲎（Limulus）变 形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物 凝固，故称G试验。
- b-1,3-D-葡聚糖通过激活G因子（ Factor G） 引起凝集；
– 内毒素通过激活C因子（Factor C）引起凝 集；
• 试剂盒: 祛除Factor C 葡聚糖特异
β -1,3-D-葡聚糖检测方法
检测曲霉半乳甘露聚糖抗原（GM）
检测位于曲霉细胞壁上的 galactomannan,（GM）
3. Detection – avidin-enzyme + substrate
2. Detecting Ab – anti-galactomannan [biotin conjugated]
Ag – blood, urine, BAL
50-90
80-90
Sabetta et al. JID 1985; 152: 946 Ansorg et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 582 Verweij et al. JCM 1995; 33: 3150 Maertens et al. Blood 2001; 97: 1604 Herbrecht et al. J Clin Oncol 2002; 20: 1898
IA ASP
1950 1960 1970 1980 1990 2000
Kontoyiannis et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002， 21:161-172 Warnock. JAC,1998,41(suppl D):95-105
经尸检证实的侵袭性真菌感染
β 1,3-D-glucan （葡聚糖）
• 真菌细胞壁成份，占50%以上 • 其他微生物、动物及人的细胞不含该成份 • 主要用于念珠菌和曲霉菌感染诊断
mannoproteins
b1,3
b1,6 glucans
PPL bilayer
b1,3 glucan synthase
chitin ergosterol
Imai K et al.2004，Nihon Kokyuki GakkaiZasshi 42:1024–1029
(1) 肺曲霉病患者 (2) 卡氏肺囊虫肺炎患者 (3) 其他确诊或疑似侵袭性真菌感染的患者
Kędzierska et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2007) 26:755–766
26.1%
C. parapsilosis
21.1%
21 3
Edmond et al. Clin Infect Dis 1999;29:239-44.
美国血源性念珠菌感染种类分布
(1998-2000)
C.glabrata 24.46%
C.parapsilosis 13.25%
C.albicans
45.87%
分离率
31.9% 15.7% 11.1%
7.6%
5.7% 5.4% 4.5% 4.4% 1.4% 1.4%
Edmond et al. Clin. Infect. Dis. (1999). 29:239-244
死亡率
21% 25% 32%
40%
24% 27% 28% 33% 26% 23%
侵袭性曲霉病的发病率也在增加…
Keutgen X et al, Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2007
曲霉的GM 抗原检测
乳胶凝集试验（Pastorex® ） (15ng/ml) 酶连免疫吸附试验（Platelia® ） (1ng/ml)
灵敏度（%） 特异度（%）
LA
25-70
90-100
ELISA
真菌感染的非培养诊断进展
真菌感染的流行现状
真菌感染不断增加的原因— 高危人群的增多
AIDS
条件致病菌
脓毒血症的发病率
+600% +300% +300%
Martin et al, NEJM 2003;348:1546
念珠菌血行感染发病率和死亡率高
Nosocomial bloodstream infections in hospitals in the USA
Specificity 87%.
• 界值：Fungitec:20 pg/mL Fungitell:60/80 pg/mL 金山川公司G试剂:50 pg/mL
β-1,3-D-葡聚糖 检测范围
• 不仅可检测念珠菌感染
– 曲霉、镰刀菌 和很多霉菌均存在β-1,3葡 聚糖( Miyazaki, J Clin Micro 33:3115, ‘95)
念珠菌属
2583
81.2
季也蒙念珠菌 365
78.6
其它念珠菌 1158
75.3
光滑念珠菌 5611
65.5
克柔念珠菌 1206
17.7
SDD％ R%
0.7
0.8
4.4
1.8
4.9
2.6
3.3
3.3
4.8
6.1
10.7
8.1
12.9
8.5
11.3
13.4
20.1
14.4
31.1
50.7
临床常见的条件性真菌感染
欧洲已流行近十年，在美国03年刚被批准。
B 乳胶凝集试验（Latex agglutination） (LA Pastorex Aspergillus, Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France)
两种方法比较，前者比后者更有效：
*0.5–1 ng/mL Vs 15 ng/mL。*早5天检测到
• 念珠菌病:最常见，占血源感染的第4位。 • 曲霉菌病:常见于血液系统恶性肿瘤病人，
器官移植常见合并症。
• 隐球菌病: 在艾滋病人发病率为10-20%。 • 接合菌病（毛霉病）: 多见于重症糖尿
病和烧伤病人。
临床有增多趋势的条件性真菌
• 非白念念珠菌感染 • 毛孢子菌感染 • 地霉感染 • 镰刀菌感染 • 枝顶孢霉感染 • 暗色真菌感染 • 马尔尼菲青霉
Fungitell assay
Serum (1? 3)-b-D-glucan (pg/mL)
100001005 10001004
1001003 101002
1100 11
w0 ith3c0a0n.5didPeamtiein1ats c3o1n0.5troNl osrum2baljsects2.5
Clin Infect Dis 2004;39:199-205.
C.tropicalis
Other
C.krusei
1.12%
2.04%
C.lusitaneae
12.23%
1.02%
Hajjeh. et al. (2004) J. Clin. Microbiol. 42(4):1519-1527
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
我国念珠菌种类的变化
菌种
白念珠菌 热带念珠菌 光滑念珠菌 克柔念珠菌 葡萄牙念珠菌 新型隐球菌
85-92 %
80-90 10-13
1-6 1 1 1
96-2002%
43-75 10-15 14-21 5-27 2-5 1-5
常见酵母菌对氟康唑的敏感性
菌名
株数
S％
白念珠菌
38833
98.4
近平滑念珠菌 2628
93.8
热带念珠菌
2990
92.5
葡萄芽念珠菌 274
93.4
新型隐球菌
688
89.1
Johan A et al , Clinical Infectious Diseases 2007; 44:1329–36
1. Capture antibody – monoclonal anti - galactomannan
Specificity = >90% sensitivity = 75%
GM抗原的检测方法
A 酶联免疫吸附法（Platelia Aspergillus-EIA） (PA-EIA Platelia Aspergillus, BioRad,Marnes-la-Coquette, France)
真菌感染的非培养诊断
种特异性 属特异性 真菌通用
PCR
PCR, GM试验
1-3-ß-D-glucan,G试验 PCR
非培养诊断检测方法
• G试验检测b-1,3 –D-葡聚糖 • ELISA法检测曲霉半乳甘露聚糖抗原 • 乳胶凝集试验检测新生隐球菌抗原 • ELISA法检测念珠菌抗原 • PCR_真菌通用引物、种属特异性引物
GM试验注意事项
预处理： *EDTA作预处理，分解免疫复合物，沉淀蛋白 *加热使免疫复合物失活。 界值确定： *阳性>0.5;阴性<0.5;欧美已普遍接受（06年）。 *将界值由1.5改为0.5，敏感性由76.3%提高到 97.4%，特异度由97.5%降至90.5%。 结果判读： *两次阳性可确诊感染。 *重复检测阴性可排除真菌感染。
Cut off 60 pg/ml
3
假阳性原因
*内毒素：NaOH预处理 *抗肿瘤药：香菇糖、裂殖菌多糖 *免疫治疗：白蛋白、球蛋白 *血液透析中使用硝酸纤维素制品 *术中使用棉制品、海绵等 *血红蛋白
细菌及真菌定植状态不影响G试验
Pickering J, et al. J Clin Microbiol 2005; 43: 5957–62
(Baltimore) 1999;78:123-138.
非白念珠菌的增多...
白念珠菌
(53.2%)
934例念珠菌血症
Edmond et al. Clin Infect Dis 1999;29:239-44.
非白念珠菌(46.8%)
非白念念珠菌血症
C. glabrata
42.3%
C. tropicalis
假阴性原因
体液中存在葡聚糖酶使BDG降解。
Kawai R et al.2006，Appl Microbiol Biotechnol 71:898–906
应用对象：
(1) 成人急性髓内白血病，慢性淋巴细胞白血病， 急性淋巴细胞白血病，骨髓发育不良综合症， 非霍奇金淋巴瘤。
(2) 疑有内源性真菌内眼炎的患者 (3) 术后病重患者 (4) 中暑患者 (5) 农民肺
重要致病菌流行病学监测和控制（SCOPE）计划 1995-1998
排名 1 2 3
4
5 6 7 8 9 10
病原
凝固酶阴性葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 肠球菌属
念珠菌属
大肠埃希菌 克雷伯菌属 肠杆菌属 铜绿假单胞菌 锯杆菌属 链球菌属
数量
3908 1928 1354
934
700 662 557 542 177 173
8
All other
Candida spp.
Aspergillus spp. 6
Prevalence at Autopsy [%]
4
2
0 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92
Groll et al, J Infect 1996;33:23-32.
All others