PCR扩增仪在肺癌患者白色念珠菌临床分离株基因分型中的应用

PCR扩增仪在肺癌患者白色念珠菌临床分离株基因分型中的
应用
张玉敏;李玉柱;陈晖;马荣芬;刘艳红;张尊
【摘要】目的:探讨美国ABI 9700型PCR扩增仪在肺癌患者感染白色念珠菌基因分型中的应用价值,并分析不同基因型对不同抗真菌药物的耐药情况,旨在为临床用
药提供依据.方法:选取2012年5-12月肺癌患者感染的36株白色念珠菌临床分离株,采用经优化的随机扩增多态性DNA(random amplification polymorphic DNA,RAPD)方法进行分型鉴定,并对分型菌株进行药敏试验.结果:使用9700型PCR扩增仪快速、准确地将36株白色念珠菌分为A型(13株)、B型(10株)、C
型(7株)、D型(6株);36株白色念珠菌对氟康唑、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、咪康唑、克霉唑、酮康唑的耐药株数分别为2、1、4、2、0、6株.结论:美国ABI 9700型PCR扩增仪能够对肺癌患者感染的白色念珠菌快速、准确地做出分型,从而为临床
用药提供依据,是一台可靠、经济、高效的检测仪器.
【期刊名称】《医疗卫生装备》
【年(卷),期】2016(037)007
【总页数】3页(P81-83)
【关键词】PCR扩增仪;肺癌;白色念珠菌;基因分型;药敏分析
【作者】张玉敏;李玉柱;陈晖;马荣芬;刘艳红;张尊
【作者单位】063000河北唐山,唐山市人民医院检验科;063000河北唐山,唐山市
人民医院影像科;063000河北唐山,唐山市人民医院检验科;063000河北唐山,唐山
市人民医院检验科;063000河北唐山,唐山市人民医院检验科;063000河北唐山,唐
山市人民医院检验科
【正文语种】中文
【中图分类】R318;R446.1
近年来，随着医学技术的飞速发展，念珠菌感染病例日益增多[1]。

目前对肺癌患
者念珠菌感染的研究甚少，且主要集中于形态学表型分型，这些传统的分型方法所能鉴定的念珠菌种类有限且无法进行种内的分型鉴定，严重影响了对念珠菌感染的及时诊断、早期治疗[2]。

因此，从分子水平进行种间及种内的分型对有效预防和
控制念珠菌感染具有重要意义。

随机扩增多态性DNA（random amplification polymorphic DNA，RAPD）因其快速、简便、价廉、无需预知物种的基因序列
即可分析大样本等特点，在念珠菌属医院感染的分子流行病学研究中应用较为广泛[3-4]。

我院现使用的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪器是美国ABI 9700型PCR扩增仪。

该仪器在运行中比同类产品较为优良，能够对
肺癌患者感染的白色念珠菌快速、准确地做出分型，从而为临床用药提供依据。

1.1 材料
1.1.1 菌种来源
2012年5—12月唐山市人民医院收治的肺癌患者发生念珠菌感染的临床标本中分离的36株白色念珠菌，所有菌株均按常规方法进行分离、培养、鉴定及药敏试验。

2.1 白色念珠菌分型结果
36株白色念珠菌经RAPD方法得到分子指纹图谱，按聚类分析算法可分4型。

分型结果如下：菌株1、3、4、6、7、12、19、24、27、28、29、30、35为A 型，2、11、13、14、15、17、25、26、34、36为B型，8、9、18、20、21、31、32为C型，5、10、16、22、23、33为D型。

2.2 不同基因型药敏结果
36株白色念珠菌对氟康唑、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、咪康唑、克霉唑、酮康唑的
耐药株数分别为2、1、4、2、0、6株（见表1）。

随着现代生命科学技术的进步，PCR技术在近几年得到了很大发展，已渗透到分
子生物学的各个领域，定量PCR扩增仪主要由PCR和荧光检测系统组成[6]。

目前，对肺癌患者真菌感染的研究主要集中在临床分析中的危险因素，寻求其他方法从分子水平进行种间及种内的分型是念珠菌临床研究及治疗亟须解决的关键问题。

基于核酸的分子生物学方法（主要是PCR方法）是念珠菌诊断、分型的发展趋势。

因此，临床检查肺癌患者感染不同念珠菌基因型的仪器及方法是临床治疗的关键。

美国ABI公司推出的9700型PCR扩增仪具有9600型PCR扩增仪的性能和2401型PCR扩增仪的操作界面，每个PCR方法运行时其时间和温度程序会实时
动态显示，可更换样品基座满足不同需要，满足RAPD等实验的要求。

其特点如下：（1）计算机计算不同体积样品的实际样品温度，PCR扩增仪直接控制样品实际温度而不控制样品板温度，控温更精确，扩增效果重现性更好。

（2）采用105℃热盖防止蒸发，反应管内无需加石蜡油，操作省时方便，同时便于PCR产物进行
酶切分析和测序。

（3）软件容量大，可储存多达100个完整的PCR方法，可以
用户名和方法名储存，软件可自动计算引物解链温度，操作简单。

（4）自动断电保护，恢复供电后自动执行未完成循环，保证扩增全过程安全运行。

（5）蓝色大屏幕液晶显示屏，PCR编程像填表一样简便直观，程序运行可闪烁显示当前状态。

本研究中36株临床分离的白色念珠菌经RAPD方法分型：A型13株，B型10株，C型7株，D型6株。

PCR产物大小与Tamura等[7]的研究相一致。

36株
白色念珠菌对氟康唑、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、咪康唑、克霉唑、酮康唑的耐药
株数分别为2、1、4、2、0、6株，不同基因型耐药性不同，临床医师可以针对
不同基因型用药，能够快速、准确地治疗白色念珠菌感染的肺癌患者。

以分子生物学技术应用于临床检验是未来检验行业的趋势之一，PCR平台是分子
检测的基础，依靠PCR扩增仪可在短时间内完成体外核酸序列扩增，获得大量目
的基因，在此平台之上可以实现检验行业多个亚学科的快速、准确以及高通量检测。

现阶段，PCR扩增仪在临床检验工作的使用可归纳为以下几个优势：（1）敏感性高。

PCR扩增仪精密的温度调控保证了检测的敏感性，特别在肝炎病毒检测、HIV 检测中，PCR的高灵敏度可以发现低病毒载量的早期感染状态[8-9]。

（2）特异
性强。

PCR可用于区分微生物种内差异，如本文中所述PCR鉴定白色假丝酵母菌基因亚型，为临床诊治提供了一定的帮助。

（3）高效快速。

PCR扩增仪可以快速高通量地完成目的基因的体外扩增，加快了检测效率，如在疫情爆发状态下采用PCR扩增仪快速鉴定病原微生物[10-11]。

随着技术的发展，高分辨率荧光PCR
扩增仪将可用于基因的定量检测[12]，并进一步提高了敏感性。

此外，PCR扩增
仪与测序仪联用将大大提高检测的特异性与准确性[13]。

美国ABI 9700型PCR扩增仪对白色念珠菌种内基因分型具有一定的特殊性，可
有效地提高分型的准确性，本研究中也进一步证实，该型PCR扩增仪能够对肺癌
患者感染的白色念珠菌快速、准确地做出分型，从而为临床用药提供依据，是一台可靠、经济、高效的检测仪器。

1.1.2 仪器与试剂
美国ABI 9700型PCR扩增仪，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

科玛嘉
念珠菌显色培养基（法国CHROMagar公司）、药敏纸片（购于广州乐通泰生物
科技有限公司）。

1.2 方法
1.2.1 PCR扩增
白色念珠菌RAPD引物：OPA-14（5′-TCTGTGCTGG-3′）。

采用25μl反应体系。

反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，72℃最后延伸10 min，循环40次，采用同一引物扩增均重复3次以上。

电泳：2%琼脂糖凝胶，5V/cm电泳60min。

每孔加入5μlPCR反应产物、1.0 μl 上样缓冲液。

图像分析仪进行结果采集分析。

1.2.2 药敏试验
以美国临床实验室标准委员会（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）酵母菌纸片扩散法敏感试验2003年方案[5]进行试验，按要求测量抑菌环直径，读取药敏结果。

【相关文献】
[1]赵德军，胡昭宇，武静，等.恶性肿瘤患者深部念珠菌感染的调查及药敏分析[J].国际检验医学杂志，2012，33（17）：2 147-2 148.
[2]李菁，马佳毓.RAPD技术及其在假丝酵母菌研究中的应用[J].齐齐哈尔医学院学报，2006，27（3）：334-335.
[3]徐鸿绪，黄健宇，崔颖鹏，等.白色假丝酵母菌的随机扩增多态性DNA分型研究[J].中华医院感染学杂志，2010（7）：925-928.
[4]李菁，张文莉，郭薇媛，等.48株临床分离假丝酵母菌DNA异质性分析[J].微生物学杂志，2006，26（4）：91-94.
[5] 徐英春，王澎，谢秀丽，等.美国临床实验室标准化委员会酵母菌纸片扩散法敏感试验2003年版方案介绍[J].中华检验医学杂志，2003，26（9）：579-580.
[6]杜琼，倪滔，刘小琦，等.ABI 7700、7500荧光定量PCR仪性能评价[J].实用医院临床杂志，2009，6（1）：63-64.
[7]TAMURA M，WATANABE K，MIKAMI Y，et al.Molecular characterization of new clinical isolates of candida albicans and C.dubliniensis in Japan：analysis reveals a new genotype of C.albicans with group I Intron[J].J Clin Microbiol，2001，39（12）：4 309-4 315.
[8]HUSSAIN A B，KARAMAT K A，ANWAR M，et
al.CorrelationofHBVDNAPCRandHBeAginhepatitisBcarriers[J]. J Coll Physicians Surg Pak，2004，14（1）：18-20.
[9] SHAH I.Efficacy of HIV PCR techniques to diagnose HIV in infants born to HIV infected mothers?An Indian perspective[J].JAPI，2006，54：197-199.
[10]POON L L M，CHAN K H，WONG O K，et al.Early diagnosis of SARS coronavirus
infection by real time RT-PCR[J].J Clin Virol，2003，28（3）：233-238.
[11]RAOULT D，ABOUDHARAM G，CRUEZY E，et al.Molecular identification by"suicide PCR"of Yersinia pestis as the agent of medieval black death[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2000，97（23）：12 800-12 803.
[12]李旦，王加启，卜登攀，等.高分辨率熔解曲线及其应用[J].生物技术通报，2009（7）：48-51.
[13]王峰，朱玉梅，桂静，等.PCR测序和基因芯片快速鉴定分枝杆菌菌种的应用研究[J].中国防痨杂志，2011，33（11）：713-717.。