TGF-β3在小鼠放射性肺纤维化中的作用研究

TGF-β3在小鼠放射性肺纤维化中的作用研究
汪倩君;徐龙;熊珊珊;肖凤君;杨陟华;潘秀颉;朱茂祥
【摘要】Objective To observe the changes of lungs in mice after 60 Co γ-ray irradiation on whole breast,and to explore the role of TGF-β3 in radiation-induced pulmonary fibrosis in mice. Methods 180 C57BL/6 female mice were randomly divided into control group,irradiation group and TGF-β3 group. The mice in irradiation group and TGF-β3 group were irradiated once by 60 Coγ-ray with does of 20 Gy on whole chest. Then,the mice of both groups above were intraperitoneal injected 0. 9% saline and TGF-β3 (1 μg/kg) 0. 5 ml respectively once a week. Kill the mice at 3,7,14 days and 1,3,6 months after irradiation. To observe pathology of lungs by HE staining and Sirius red staining,and to detect the number of CF in lungs of mice. Results To establish the model of radiation-induced pulmonary fibrosis in mice. 6 months after irradiation,the lungs in TGF-β3 group appeared proliferation of some fi-broblasts and deposition of a small amount collagen. From 14 days to 6 months after irradiation,the number of CF in lungs in irradiation group was significantly higher(P<0.05) than control group. 1 month after irradiation,number of CF in lungs in TGF-β3 group was significantly lower ( P<0.05 ) than irradiation group. Conclusion TGF-β3 obviously reduces the accumulation of CF in lungs of mice after radiation,which may play an important role in dela-ying the occurrence of pulmonary fibrosis.%目的观察经60 Coγ射线全胸照射后小鼠肺脏的改变,探究转化生长因子-β3(TGF-β3)在小鼠放射性肺纤维化中的作用。

方法180只
C57BL/6雌性小鼠随机分为对照组、照射组和TGF-β3组。

照射组和TGF-β3组经60 Co γ射线单次全胸照射,照射后每周分别腹腔注射0.5 ml 0.9%生理盐水和TGF-β3(1μg/kg)一次。

于照射后3、7、14 d和1、3、6个月活杀,肺脏经HE和天狼星红染色观察病理,检测小鼠肺内循环纤维细胞( CF)的数量。

结果建立小鼠放射性肺纤维化模型。

照射后6个月时,TGF-β3组肺脏见点状实变,部分成纤维细胞增生,少量胶原纤维沉积。

照射后14 d到6个月,照射组肺脏 CF 数量比对照组明显增加( P <0.05)。

照射后1个月时,TGF-β3组肺脏CF数量比照射组明显减少
( P<0.05)。

结论 TGF-β3使CF在肺内的聚集明显减少,其可能在延缓肺纤维化发生过程中发挥重要作用。

【期刊名称】《安徽医科大学学报》
【年(卷),期】2014(000)010
【总页数】4页(P1396-1399)
【关键词】放射性肺纤维化;循环纤维细胞;TGF-β3
【作者】汪倩君;徐龙;熊珊珊;肖凤君;杨陟华;潘秀颉;朱茂祥
【作者单位】安徽医科大学研究生院，合肥 230032; 军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850;安徽医科大学研究生院，合肥 230032; 军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850
【正文语种】中文
【中图分类】R114;R563.9
放射性肺纤维化是临床胸部肿瘤放疗和骨髓移植预处理最常见的并发症之一，目前尚无有效的治疗方法［1］。

循环纤维细胞（circulating fibrocytes，CF）向受损部位聚集并分化成效应细胞是纤维化发病的重要机制之一［2］。

转化生长因子-
β3（transforming growth factor-β，TGF-β3）对细胞分化、增殖和细胞外基质沉积有重要作用，在哺乳动物中有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种亚型［3］。

有报道［4］表明，TGF-β1介导肺纤维化的发生，而TGF-β3却没有相同的作用。

有文献［5］报道，TGF-β3通过减少肝内胶原沉积减轻了肝纤维化的程度。

笔者
采用60Coγ射线胸部照射建立小鼠放射性肺纤维化模型，予以TGF-β3干预，观
察肺脏病理变化和循环纤维细胞数量的关系，探讨TGF-β3在小鼠放射性肺纤维化发生过程中的作用。

1.1 主要试剂及仪器APC标记大鼠抗小鼠CD45抗体、FACS Calibuer流式细胞
仪（美国BD公司）；兔抗小鼠Ⅰ型胶原抗体（美国Millipore公司）；细胞固定／穿膜液（美国eBioscience公司）；重组人TGF-β3（美国Peprotech公司）；天狼星红染色液（北京Leagene公司）；显微镜（日本Nikon公司）；低温离心机（德国Eppendorf公司）；涡旋混匀器（德国IKA公司）；细胞分析仪（美国MUSE公司）；旋转式恒温振荡器（江苏太仓实验设备厂）。

1.2 动物模型的制备及标本处理清洁级雌性C57BL／6小鼠180只，体重（20±2）g，购自北京维通利华生物科技有限公司。

按随机数法平均分为3组：对照组、照射组和TGF-β3组。

照射前适应性饲养7 d，未见异常。

照射前2 h禁食不禁水，戊巴比妥钠腹腔麻醉，采用60Coγ射线单次全胸照射，照射剂量20 Gy，照射野面积3 cm×1.5 cm，照射距离3 m，未照射部位用10 cm厚铅砖屏蔽。

照射后，照射组和TGF-β3组每周分别腹腔注射一次0.9%生理盐水和TGF-β3（1 μg／kg）各0.5 ml，对照组不予特殊处理。

分别于照射后3、7、14 d和1、3、6个月活
杀取材。

1.3 肺组织病理染色动物活杀后迅速取出肺脏，生理盐水漂洗后，4%中性甲醛溶
液固定，常规病理切片，进行HE染色和天狼星红染色，观察肺组织病理和胶原纤维表达情况。

1.4 CF检测兔抗小鼠Ⅰ型胶原抗体采用Per-CP试剂盒标记。

动物活杀后迅速取出肺脏，预冷生理盐水肺泡灌洗后，将全肺组织剪碎，采用0.1%Ⅳ型胶原酶37℃消化成单个细胞，计数，经与APC标记大鼠抗小鼠CD45抗体孵育后，细胞穿膜，与Per-CP标记兔抗小鼠Ⅰ型胶原抗体结合，流式细胞仪检测［6］。

1.5 统计学处理采用SPSS 13.0软件分析，数据以±s表示。

方差齐性的数据采用
单因素方差分析，方差不齐的数据采用秩和检验分析方法。

2.1 各组小鼠体重照射后7 d起，各组小鼠体重均逐渐升高，照射组和TGF-β3组小鼠体重较对照组呈明显下降趋势（P＜0.05）。

TGF-β3组体重较照射组略增加，差异无统计学意义，见图1。

2.2 各组小鼠肺脏重量照射后7 d内，照射组和TGF-β3组小鼠双侧肺脏重量均低于对照组。

随着时间的延长，照射组小鼠双侧肺脏重量逐渐回复，至照射后14 d 起，照射组小鼠肺脏重量高于对照组。

照射后3个月和6个月，照射组和TGF-β3组小鼠肺脏重量高于照射组（P＜0.05）。

照射后6个月时，TGF-β3组小鼠肺脏
重量较照射组高（P＜0.05）。

见图2。

2.3 各组小鼠肺脏HE染色照射后3个月时，照射组见肺泡壁增厚，肺泡腔变小，肺泡腔内炎性细胞浸润，血管和支气管等肺间质周围成纤维细胞增生；TGF-β3组见肺泡内有炎性细胞浸润伴有少量成纤维细胞增生。

照射后6个月时，照射组肺
脏肉眼可见部分实变，镜下见肺泡壁大量成纤维细胞增生，肺泡腔进一步缩小，部分肺泡融合以致消失；TGF-β3组肺脏肉眼见点状实变，镜下见部分肺泡壁成纤维细胞增生，见图3。

2.4 各组小鼠肺脏天狼星红染色天狼星红染色中，Ⅰ型胶原呈强橙黄色或亮红色，Ⅲ型胶原呈绿色。

随着时间延长，照射组小鼠肺组织中红色比例逐渐增多，胶原纤维沉积加剧。

照射后6个月时，照射组肺泡壁红色呈弥漫性分布，提示放射性肺
纤维化小鼠模型建立，TGF-β3组小鼠肺泡壁红色部分比例比照射组降低，见图4。

2.5 各组小鼠肺内CF数量照射后7 d，照射组小鼠肺内CF数量比对照组明显减少（Z＝－2.263，P＜0.05），TGF-β3组小鼠肺内CF数量比对照组明显减少（Z＝－2.627，P＜0.05），照射组及TGF-β3组间差异无统计学意义。

照射后14 d至6个月，照射组小鼠肺内CF数量比对照组明显增加（P＜0.05）。

照射后1个月，TGF-β3组小鼠肺内CF数量比照射组明显减少（P＜0.05）。

以上提示，照射后
14 d起，CF在小鼠肺内大量聚集，照射后1个月时，TGF-β3使CF数量在肺内
聚集比照射组明显减少（P＜0.05），见图5。

肺纤维化以Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原变化为主，最主要的效应细胞是肺成纤维细胞，其过度增生及胶原合成异常增多是肺纤维化的主要特征［7－8］。

已有研究［9］显示，肺成纤维细胞的来源有3种：自身的肺成纤维细胞增殖、肺泡上皮细胞间质
表型转化及骨髓来源的CF的转化。

其中，CF可分泌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、波形
蛋白等细胞外基质蛋白，从而介导肺、肝、心及皮肤等多种器官的纤维化过程［1］。

早期研究［2］显示，60Co γ射线小鼠胸部照射后，CF介导了肺纤维化
的发生。

本研究结果表明，小鼠胸部接受大剂量γ射线照射后，其肺内CF数量的明显增加与肺纤维化的发生具有相关性，这与既往的报道相一致［1，10］。

已有研究［3］表明，TGF-β3导致肺内非纤维化的组织修复，同时下调TGF-β1
诱导的基因表达。

TGF-β1介导体内及体外CF的出现，并进一步刺激CF向成纤
维细胞的分化［9］。

因此，为探索TGF-β3 对CF的影响及其在肺纤维化发生过
程中的作用，本研究观察了小鼠胸部照射并给予TGF-β3后肺内CF数量的变化情况，结果显示，在肺脏出现严重炎症及肺纤维化发生的较晚时期，照射组的CF数
量明显高于对照组，但TGF-β3组CF数量却明显低于照射组，病理显示TGF-β3组肺纤维化程度较轻。

有学者［6，11］发现，CF在肺内的聚集受特定的信号通
路调节，阻断相应的信号轴能减少CF的聚集，从而减轻肺纤维化的发展。

TGF-
β3在诱导ALK5和TGF-βⅡ型受体的表达上没有TGF-β1明显［3］。

TGF-β3可能拮抗了TGF-β1介导体内CF的过程，阻断了相应的信号通路，从而减少了肺内CF的数量，一定程度上延缓了肺纤维化发生的进程。

【相关文献】
［1］ Keeley E C，Mehrad B，Strieter R M.The role of fibrocytes in fibrotic diseases of the lungs and heart［J］.Fibrogenesis Tissue Repair，2011，4：2.
［2］熊珊珊，李若曦，杜丽，等.纤维细胞和Th1／Th2型细胞因子在放射性肺损伤中的作用及
相关机制［J］.中华放射医学与防护杂志，2013，33（2）：124－7.
［3］ Hall B E，Wankhade U D，Konkel J E，et al.Transforming growth factor-β3（TGF-β3）knock-in ameliorates inflammation due to TGF-β1 deficiency while promoting glucose tolerance［J］.J Biol Chem，2013，288（44）：32074－92.
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