蔗糖酶米氏常数的
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蔗糖酶米氏常数的测定
【目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系， 学习求蔗糖酶米氏常数的方法 【原理】：米氏方程式 v = Vmax[S] Km +[S] 式中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏 常数。 米氏常数的求法很多，最常用的是LineweaVer— Burk的作图法(双倒数作图法)。 将米氏方程式改写为下列倒数形式： 1／V=Km／Vmax· 1／[S]+1／Vmax
实验时，选择不同的[s]，测定相应的v，求出两者 的倒数，以1/[s]为横坐标，以1/υ吉为纵坐标作图， 绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为1/Km。
【仪器与试剂】 1. 仪器：分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒 表、坐标纸 2．试剂 标准葡萄糖溶液（1mg/ml）、 0.2 mol／L蔗糖溶液、 0.2 mol／L NaAc缓冲溶液(pH4.6)、 ０.1mol／L NaOH溶液 3，5一二硝基水杨酸试剂。
将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用 冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25ml，摇匀。测540nm处 A值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标 准曲线。
2．底物浓度和初速度υ测定
取试管8支，按1～8编号,按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分 别加入8支试管中，于37℃水浴中保温10min。 取一定量酶液，放入同一水浴中保温约10min。 于各管中依次按同样时间间隔(0.5min或1min)加人已保温过 的酶液1.0mL，计时，立即摇匀，在37℃水浴中作用5min。 按同样次序和时间间隔，加入5mL 1mol／L NaOH，摇匀， 终止反应。 吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂 和1.0mL水的试管中，都放入沸水浴中加热5min，冷却后稀 释至25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/[S]为横坐标， 1/v为纵坐标作图，由图求出Km值。
【操作步骤】
1．葡萄糖标准曲线的制定
管号 葡萄糖标准液/ml 0 0 0 2.0 1 0.2 0.2 1.8 3.0 2 0.4 0.4 1.6 3.0 3 0.6 0.6 1.4 3.0 4 0.8 0.8 1.2 3.0 5 1.0 1.0 1.0 3.0
相当葡萄糖量/mg
蒸馏水/ml
3,5—二硝基水杨酸试 3.0 剂/ml
数据处理
A540 υ
底物 1/[s] 1/υ 浓度 (1/M)
1.0 1.0 1.0 1.0 10 5.0 5.0 5.0 5.0
【实验结果与讨论】
反应物
管 0.2mol 醋酸 号 ／L 缓 蔗糖 冲液 (ml) 液 (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.75 5.0 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 1.25 0 酶液 (ml) 1mol／L NaOH (ml_)
活力测定
吸取 反 应物 (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 水杨 水 (ml) 酸 试剂 (ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
【目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系， 学习求蔗糖酶米氏常数的方法 【原理】：米氏方程式 v = Vmax[S] Km +[S] 式中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏 常数。 米氏常数的求法很多，最常用的是LineweaVer— Burk的作图法(双倒数作图法)。 将米氏方程式改写为下列倒数形式： 1／V=Km／Vmax· 1／[S]+1／Vmax
实验时，选择不同的[s]，测定相应的v，求出两者 的倒数，以1/[s]为横坐标，以1/υ吉为纵坐标作图， 绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为1/Km。
【仪器与试剂】 1. 仪器：分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒 表、坐标纸 2．试剂 标准葡萄糖溶液（1mg/ml）、 0.2 mol／L蔗糖溶液、 0.2 mol／L NaAc缓冲溶液(pH4.6)、 ０.1mol／L NaOH溶液 3，5一二硝基水杨酸试剂。
将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用 冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25ml，摇匀。测540nm处 A值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标 准曲线。
2．底物浓度和初速度υ测定
取试管8支，按1～8编号,按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分 别加入8支试管中，于37℃水浴中保温10min。 取一定量酶液，放入同一水浴中保温约10min。 于各管中依次按同样时间间隔(0.5min或1min)加人已保温过 的酶液1.0mL，计时，立即摇匀，在37℃水浴中作用5min。 按同样次序和时间间隔，加入5mL 1mol／L NaOH，摇匀， 终止反应。 吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂 和1.0mL水的试管中，都放入沸水浴中加热5min，冷却后稀 释至25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/[S]为横坐标， 1/v为纵坐标作图，由图求出Km值。
【操作步骤】
1．葡萄糖标准曲线的制定
管号 葡萄糖标准液/ml 0 0 0 2.0 1 0.2 0.2 1.8 3.0 2 0.4 0.4 1.6 3.0 3 0.6 0.6 1.4 3.0 4 0.8 0.8 1.2 3.0 5 1.0 1.0 1.0 3.0
相当葡萄糖量/mg
蒸馏水/ml
3,5—二硝基水杨酸试 3.0 剂/ml
数据处理
A540 υ
底物 1/[s] 1/υ 浓度 (1/M)
1.0 1.0 1.0 1.0 10 5.0 5.0 5.0 5.0
【实验结果与讨论】
反应物
管 0.2mol 醋酸 号 ／L 缓 蔗糖 冲液 (ml) 液 (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.75 5.0 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 1.25 0 酶液 (ml) 1mol／L NaOH (ml_)
活力测定
吸取 反 应物 (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 水杨 水 (ml) 酸 试剂 (ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0