PDX1正义表达载体的构建及表达

PDX1 正义表达载体的构建及表达*
马娟1 ，刘庆华2 学科学院消化科（ 广州 510080） ； 2 中山大学附属第一医院肾内科（ 广州 510080）
【摘要】 目的 亚克隆人胰十二指肠同源框 － 1 （ PDX － 1） 基因，构建 PDX1 正义表达重组质粒。方法 亚 克隆 PDX1 基因至真核表达载体 pcDNA3. 1，双酶切及测序鉴定。同时瞬时转染胃癌细胞株，免疫印迹法检测 PDX1 的过表达。结果 双酶切和测序鉴定结果正确； PDX1 正义表达载体转染 SGC7901 和 TMK1 细胞 24 h 后， PDX1 蛋白表达水平显著升高。结论 成功获得正义表达重组质粒 pcDNA － PDX1，顺利在胃癌细胞中过表达 PDX1，为进一步研究 PDX1 在胃癌发生发展中的作用奠定了基础。
［5］ GUZ Y，MONTMINY M R，STEIN R，et al． Expression of murine STF － 1，a putative insulin gene transcription factor，in beta cells of pancreas，duodenal epithelium and pancreatic exocrine and endocrine progenitors during ontogeny［J］． Development，1995，121 （ 1） ： 11 － 18．
·3031·
步表明表达载体构建成功。
图 2 pcDNA － PDX1 真核表达质粒的酶切鉴定
2． 3 pcDNA － PDX1 真核表达质粒的测序鉴定结果 对鉴定为阳性克隆的质粒送 Tech Dragon Ltd． 公司同 时做 双 向 测 序，经 过 BLAST （ http： / / blast． ncbi． nlm． nih． gov / Blast． cgi） 显示质粒中含有目的序列与基因库 中 PDX1 cDNA 序列相比有 100% 一致性（ 图 3） ，表明 质粒构建成功。
【关键词】 胰十二指肠同源框 － 1； 基因克隆； 基因表达
胰十二指肠同源异型基因（ pancreatic duodenal homeobox1） 编码胰腺十二指肠同源框蛋白 1 （ pancreatic duodenal homeoprotein 1，PDX1） ，又称 IPF － 1、IDX － 1、 IUF － 1。PDX1 属于 ParaHox 家族转录因子的一员［1］， 位于染色体 13q12. 1 上，与胚胎消化道发育分化有关。 生理情况下 PDX1 表达于远端胃的三种分别分泌胃泌 素、生长抑素、5 － 羟色胺的内分泌细胞［2］。但 PDX1 在 胃癌中的表达和功能并不明了。为此 2009 年 9 月至 2010 年 2 月我们构建了 PDX1 基因克隆，转染胃癌细胞， 用于进一步研究 PDX1 在胃癌发生发展中的作用。
图 3 pcDNA － PDX1 真核表达质粒的测序鉴定结果
2． 4 PDX1 在胃癌细胞中的瞬时过表达 免疫印迹法 显示与转染空质粒的细胞（ SGC7901 － pcDNA、TMK1 － pcDNA） 相比，转染了 PDX1 的 SGC7901 和 TMK1 细胞 （ SGC7901 － PDX1、TMK1 － PDX1 ） 显 著 高 表 达 PDX1 （ 图 4） ，证实 PDX1 正义表达质粒有效。
图 4 PDX1 在胃癌细胞中的瞬时过表达
3 讨论 同源异型基因（ homeobox genes） 是一类包含同源
框即 183 个氨基酸序列（ homeobox） 的调节基因，能够
编码 有 转 录 因 子 功 能 的 同 源 异 型 蛋 白 （ homeoproteins） ，在胚胎发育及肿瘤发生发展中有着特殊的表达 模式： 有些在肿瘤中表达上调的同源异型基因可能在 胚胎发育中和未分化细胞中正常表达； 相反，有些在肿 瘤中表达下调的同源异型基因可能在成年和（ 或） 分 化细胞中正常表达［3］。
图 1 PDX1 酶切片段
2． 2 pcDNA － PDX1 真核表达质粒的酶切鉴定 pcDNA － PDX1 经 Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ双酶切后，电泳显示 4 kb 载体片段和 854 bp 插入目的基因条带（ 图 2） ，初
广东医学 2010 年 12 月 第 31 卷第 23 期 Guangdong Medical Journal Dec． 2010，Vol． 31，No． 23
PDX1 属于同源异型基因亚族 ParaHox 家族转录 因子的一员［1］，在 胚 胎 消 化 道 发 育 中 有 重 要 作 用。 研 究显示，小鼠胚胎发育第 8. 5 天，Pdx1 开始表达于消化 道的背细胞内； 第 9 天，Pdx1 出现在十二指肠、背胰芽 和腹胰芽细胞内； 胚胎发育到第 13. 5 天，Pdx1 表达于 胰管大部分上皮细胞及胰腺原基细胞； 胚胎继续发育 至 17. 5 天，Pdx1 基因则选择性表达于胰脏内分泌腺的 β 细胞和十二指肠绒毛上皮的 Brunner 氏腺体，胃窦内 分泌腺细胞［4 －5］直至小鼠出生。PDX1 基因敲除后，小 鼠的胃十二指肠接合处发育异常，无法正常胃排空，最 终导致胃潴留［6］。
PDX1 基因的异常表达亦与胃的病 理 过 程 相 关。 FALLER 等［7］报道 PDX1 表达可能与胃黏膜萎缩及化 生的免疫学和形态学有关； SAKAI 等［8］报道 PDX1 蛋 白在假幽门腺及胃肿瘤中表达。因此我们推断 PDX1 基因及蛋白在胃癌发生发展中有着重要作用和功能。 本试验中我们成功构建 PDX1 表达载体，为下一步研 究高表达 PDX1 对胃癌细胞生物学行为的影响、揭示 PDX1 在胃癌发生发展中的作用打下了坚实的基础。
免疫印迹法图4pdx1在胃癌细胞中的瞬时过表达3讨论同源异型基因homeoboxgenes是一类包含同源框即183个氨基酸序列homeobox的调节基因能够编码有转录因子功能的同源异型蛋白homeoproteins在胚胎发育及肿瘤发生发展中有着特殊的表达模式
·3030·
广东医学 2010 年 12 月 第 31 卷第 23 期 Guangdong Medical Journal Dec． 2010，Vol． 31，No． 23
［6］ OFFIELD M F，JETTON T L，LABOSKY P A，et al． PDX － 1 is required for pancreatic outgrowth and differentiation of the rostral duodenum［J］． Development，1996，122（ 3） ： 983 － 995．
* 国家自然科学基金资助项目（ 编号： 81001112 ） ，广东省自然科 学基金博士启动项目（ 编号： 9451008004002824）
同时经双酶切及测序鉴定阳性重组体。 1． 4 PDX1 表达质粒在胃癌细胞的瞬时转染 接种约 5 × 106 AGS 和 TMK1 细胞至六孔板中，培养 12 h 后用 脂 质 体 Lipofectamine 2000 为 介 质 转 染。 pcDNA － PDX1 质粒与脂质体比例为 4. 0 μg∶ 10 μL。继续培养 24 h 后，收集细胞，免疫印迹法检测 PDX1 蛋白表达。 转染空质粒 pcDNA3. 1（ + ） 的细胞作为对照。 1． 5 免疫印迹法 细胞转染 24 h 后，弃去培养液，冰 PBS 洗 2 遍，每孔加入 100 μL 细胞裂解液，经细胞刮 刮取 细 胞 裂 解 物，冰 上 裂 解 30 min。以 4℃ 、12 000 r / min离心 10 min。收集上清，BSA 标准品定量后，各 取 20 μg，95 度变性 10 min，进行 12% SDS － PAGE。 将蛋白用半干转移法转印至 PVDF 膜。膜用 5% 脱脂 奶粉室温封闭 1 h，与 1∶ 300 稀释的抗 PDX1 抗体 4℃ 孵育过夜。膜与 1∶ 3 000 稀释的辣根过氧化物酶（ peroxidasehorseradish，HRP） 偶联的抗兔 IgG 室温孵育 1 h 后，利用 ECL 化学发光检测试剂盒进行检测。 2 结果 2． 1 PDX1 酶切片段 经过限制性内切酶 BamH Ⅰ （ GGATCC） 和 Hind Ⅲ（ TCTAGA） 酶切后，质粒 pUB － PDX1 的酶切产物经电泳显示，在 DNA marker 850 bp 处见一明显目的基因条带，即为 854 bp 的 PDX1 全长 cDNA。见图 1。
［2］ LARSSON L I，MADSEN O D，SERUP P，et al． Pancreatic － duodenal homeobox 1 － role in gastric endocrine patterning［J］． Mech Dev，1996，60（ 2） ： 175 － 184．
1 材料与方法
1． 1 主要材料及试剂 pUB － PDX1 质粒由 JS Caldwell 教 授 （ Genomics Institute of the Novartis Research Foundation，San Diego，California 92121，USA ） 赠 送。 质粒 pcDNA3. 1（ + ） 购自 Invintrogen 公司。大肠杆菌 DH5α 保存于本实验室。质粒提取试剂盒和 PCR 产物 回收试剂盒，限制性内切酶 BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ，T4 连 接酶 分 别 购 自 美 国 New England Biolabs 公 司 （ Cat． M0202S） 。兔抗 PDX1 抗体购自 Santa － Cruz 公司，兔 抗 glyceraldehyde － 3 － phosphate dehydrogenase （ GAPDH） 抗体购 自 Abcam 公 司，羊 抗 兔 二 抗 购 自 Santa － Cruz 公司。 1． 2 PDX1 cDNA 全长的获得 取 1 μL pUB － PDX1 质粒转化 DH5α 感受 态 细 菌。挑 选 转 化 的 单 克 隆 菌 落，经 37℃ 培养箱培养后经质粒小抽试剂盒提取质 粒。取质粒 pUB － PDX1 2 μL 加 入 含 有 BamH Ⅰ 和 Hind Ⅲ各 1 μL、10 × 酶切缓冲液 2 μL、10 × BSA 2 μL 的酶切体系（ 加双蒸水补足总体积 20 μL） 中，37℃ 水 浴孵育 45 min。20 μL 酶切产物经 1% 琼脂糖凝胶电 泳，于紫外线灯下仔细切取目的条带，回收纯化。 1． 3 正义表达质粒 pcDNA － PDX1 的构建及鉴定 空 白质粒 pcDNA3. 1（ + ） 经 BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切后 与 PDX1 纯化片段用 T4 连接酶 4℃ 孵育 16 h，再次转 化 DH5α 感受态细菌，铺于含有氨苄青霉素的 LB 培养 板上，37℃ 过 夜。次 日 挑 选 单 克 隆 菌 落，提 取 质 粒。
［3］ ABATE SHEN C． Deregulated homeobox gene expression in cancer： cause or consequence？ ［J］． Nature Reviews Cancer，2002， 2（ 10） ： 777 － 785．
［4］ STOFFERS D A，HELLER R S，MILLER C P，et al． Developmental Expression of the Homeodomain Protein IDX － 1 in Mice Transgenic for an IDX － 1 Promoter / lacZ Transcriptional Reporter ［J］． Endocrinology，1999，140（ 11） ： 5374 － 5381．
参考文献
［1］ BROOKE N M，GARCIA － FERNANDEZ J，HOLLAND P W． The ParaHox gene cluster is an evolutionary sister of the Hox gene cluster［J］． Nature，1998，392（ 6679） ： 920 － 922．