多聚核苷酸

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710757969.7
(22)申请日 2017.08.29
(71)申请人 苏州大学
地址 215137 江苏省苏州市相城区济学路8
号
(72)发明人 周泉生　曹志飞　
(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人 常亮
(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)
G01N 33/574(2006.01)
A61K 31/585(2006.01)
A61P 35/00(2006.01)
(54)发明名称
多聚核苷酸-5’
激酶-3’磷酸酶的新应用(57)摘要
本发明属于涉及药物领域，公开多聚核苷
酸-5’激酶-3’磷酸酶的新应用，本发明通过免疫
组织化学染色法证明免疫组织化学染色法在胰
腺癌组织中的表达明显低于癌旁组织，且PNKP表
达越低，胰腺癌恶性程度越高。

因此提供了多聚
核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶在制备诊断胰腺癌的
产品中的应用。

本发明还提供了雷公藤内酯酮作
为多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶抑制剂的应用。

本发明进一步还提供了以多聚核苷酸-5’激酶-
3’磷酸酶为靶标在制备治疗胰腺癌的药物中的
应用。

多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶作为诊断胰
腺癌的标志物，使胰腺癌诊断更加准确、快速，作
为治疗胰腺癌药物的靶标为治疗胰腺癌提供了
新的治疗靶点和治疗途径。

权利要求书1页 说明书10页 附图8页CN 107529558 A 2018.01.02
C N 107529558
A
1.多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶作为胰腺癌标志物的应用。

2.多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶在制备诊断胰腺癌的产品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诊断胰腺癌的产品为RT-PCR诊断胰腺癌试剂盒、实时定量PCR诊断胰腺癌试剂盒、免疫检测诊断胰腺癌试剂盒或蛋白芯片诊断胰腺癌试剂盒。

4.一种免疫检测诊断胰腺癌试剂盒，其特征在于，包括与多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶特异性结合的抗体。

5.一种蛋白芯片诊断胰腺癌试剂盒，其特征在于，包括与多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶特异性结合的抗体。

6.多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶抑制剂在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。

7.一种治疗胰腺癌的药物，其特征在于，包括有效量的多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶抑制剂或其药学上可接受的盐。

8.根据权利要求7所述药物，其特征在于，所述多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶抑制剂或其药学上可接受的盐的含量为0.05wt％～90wt％。

9.根据权利要求8所述药物，其特征在于，所述多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶抑制剂为雷公藤内酯酮、其药学上可接受的盐或衍生物。

10.雷公藤内酯酮作为多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶抑制剂的应用。

权　利　要　求　书1/1页CN 107529558 A
多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶的新应用
技术领域
[0001]本发明属于涉及药物领域，具体涉及多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶的新应用，进一步涉及多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶在制备诊断胰腺癌的产品中的应用和多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。

背景技术
[0002]胰腺癌是胰腺细胞和导管细胞来源的恶性肿瘤。

流行病学研究揭示，胰腺癌发病率呈持续升高趋势。

胰腺癌是预后最差的恶性肿瘤，五年生存率仅6％。

近三十年中，胰腺癌患者增加了6倍，且其发病率逐年升高。

新发胰腺癌病例数逐年升高，流行病学专家预测，在未来三十年，胰腺癌很有可能成为癌症中第二致死数量的恶性肿瘤，对人类的危害将越来越大。

[0003]近三十年来，尽管世界各国医务人员和研究者在抗胰腺癌治疗做了坚持不懈的努力，但胰腺癌患者五年生存率仅从3％提高至6％。

虽然外科手术是治愈实体瘤的最有效治疗手段，但超过80％的胰腺癌患者在确诊时就已经在腹部扩散，或有多器官转移，错过了手术的最佳时机，外科手术已爱莫能助。

在近20％可手术的胰腺癌患者中，即使接受最理想手术治疗(R0切除),术后患者的生存期也只有15-19月，5年生存率仅为20％。

John Hopkins等研究团队报道称，标准胰和十二指肠切除联合局部淋巴结清扫并不能改善患者在1、3、5年内的中位生存期(Hackert,et al.,2015；Krska,et al.,2015)。

大宗临床资料显示，目前胰腺癌病人5年生存率为6％左右，外科手术对于改善胰腺癌的预后收效甚微(Hackert,et al.,2015；Krska,et al.,2015)。

[0004]胰腺癌对放化疗不敏感，且易产生耐药性。

研究表明，吉西他滨(gemcitabine)已取代5-Fu成为胰腺癌药物治疗的一线药物；但吉西他滨单药仅可以将5-Fu治疗的生存中位时间由4.4月延长到5.6月，仅延长了1.2个月(Krska,et al.,2015)。

近年来，以吉西他滨为基础的联合化疗方案不断被应用于临床试验，包括吉西他滨联合厄洛替尼、或卡培他滨、或吉西他滨联合放化疗，结果显示联合放化疗亦仅可延长胰腺癌病人短期生存期2-4个月，但不能提高五年生存期(Garrido-Laguna and Hidalgo,2015；Rubinson and Wolpin,2015)。

此外，免疫治疗和抗血管新生治疗等也试用于治疗胰腺癌，但疗效欠佳。

[0005]目前中药治疗胰腺癌研究大致分为三个方面：(A)中药方剂:已有报道由7味中药组成的Qingyihuaji方剂(QYHJ)在体外对胰腺癌细胞株具有抑制作用，但在动物体内抑瘤率仅为50％左右(潘会君等.,2013)，疗效不高。

(B)中药单体:蟾毒灵(李梅影等.,2013)、丹参酮ⅡA磺酸钠(陈景等.,2013)、蛋白磷酸酶2A抑制剂等，能在体外抑制胰腺癌细胞生长，但体内抗胰腺癌效果不良，迄今尚未见在临床治疗胰腺癌的报道。

(C)中药联合放化疗：中药复方制剂联合放化学治疗，能增强胰腺癌细胞对吉西他滨敏感性，使抗肿瘤效果略有所提高，并可显著降低化疗副作用(朱晓燕等.,2013)。

但从总体来看，目前中药抗胰腺癌疗效也不高，迄今尚未成为抗胰腺癌的一线药物。

[0006]如上所述，由于外科手术对80％胰腺癌病人不适合，且术后疗效不佳，放化疗成为
治疗胰腺癌的主要手段(Hackert,et al.,2015；Krska,et al.,2015)。

研究表明，对于早期胰腺癌患者，吉西他滨联合化疗能改善胰腺癌病人反应率和短期生存率，但不能延长患者的长期生存率。

在根治术后的联合放化疗，可以延长近期生存期四个月左右；但对于姑息性治疗的患者，联合放化疗能局部控制肿瘤。

对于晚期和转移性胰腺癌患者，联合化疗FOLFIRINOX方案和白蛋白结合性紫杉醇联合吉西他滨方案，也只能延长患者的短期生存率4个月左右，但不能提高胰腺癌病人5年生存率。

由于联合化疗采用了吉西他滨等4种抗癌药物，对正常人体毒副作用较大；联合化疗和放疗对胰腺癌疗效的毒副作用大，可造成多个脏器功能紊乱，导致部分病人过度治疗死亡，抗胰腺癌治疗面临巨大的挑战(Garrido-Laguna and Hidalgo,2015；Rubinson and Wolpin,2015)。

[0007]多聚核苷酸激酶/磷酸酶(polynucleotide kinase/phosphatase，PNKP)是一个相对分子质量为5.7万道尔顿的双功能DNA末端修复酶，其同时具有5'-激酶和3'-磷酸酶的活性，可以催化修复5'-P和3'-OH末端，在DNA损伤修复中有重要的作用。

然而，还未见PNKP在胰腺癌的诊断和治疗方面的相关研究报道。

发明内容
[0008]本发明人研究了多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶(PNKP)在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达，证实胰腺癌病人肿瘤组织和细胞中PNKP异常低表达，且PNKP表达越低，胰腺癌恶性程度越高。

因此本发明提供了多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶作为胰腺癌标志物的应用。

[0009]进一步，本发明提供了多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶在制备诊断胰腺癌的产品中的应用。

[0010]其中，本发明所述诊断胰腺癌的产品包括但不限于RT-PCR诊断胰腺癌试剂盒、实时定量PCR诊断胰腺癌试剂盒、免疫检测诊断胰腺癌试剂盒或蛋白芯片诊断胰腺癌试剂盒。

因此本发明还提供了一种RT-PCR诊断胰腺癌试剂盒、一种实时定量PCR诊断胰腺癌试剂盒、一种免疫检测诊断胰腺癌试剂盒、一种蛋白芯片诊断胰腺癌试剂盒。

[0011]本发明所述RT-PCR诊断胰腺癌试剂盒，至少包括一个特异扩增多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶基因的引物组。

[0012]本发明所述实时定量PCR诊断胰腺癌试剂盒，至少包括一个特异扩增多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶基因的引物组。

[0013]本发明所述免疫检测诊断胰腺癌试剂盒包括但不限于ELISA试剂盒，免疫印染试剂盒，免疫组化试剂盒，免疫荧光试剂盒。

本发明所述免疫检测诊断胰腺癌试剂盒，包括与多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶特异性结合的抗体。

本发明所述蛋白芯片诊断胰腺癌试剂盒，包括与多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶特异性结合的抗体。

[0014]所述与多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶特异性结合的抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体。

本领域技术人员可以使用一系列本领域已知的方法来制备针与多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶的特异的抗体。

例如，将提纯的多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。

同样，表达多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶或它的抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。

根据本发明制备的抗体可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤及时制备。

[0015]进一步的，本发明所述诊断胰腺癌的试剂盒还包括其他组分。

[0016]在一些实施例中，所述免疫检测诊断胰腺癌的试剂盒还包括免疫检测的其他组分，如酶免疫试剂盒还包括反应缓冲液、标记抗体的酶、酶反应底物等，其中标记抗体的酶有(horseradish peroxidase)、碱性磷酶(alkaline phosphatase)等。

[0017]雷公藤是一味传统中药，雷公藤内酯酮(triptonide，TN)和雷公藤内酯醇(triptolide)是中药雷公藤的活性成分；在分子结构上，两者属于二萜类环氧化物,其母核结构类似，但TN的C-14位为羰基，而雷公藤内酯醇的C-14位为羟基；这一活性基团的不同，使得两个化合物之间的功能和毒性大相径庭。

雷公藤内酯醇的毒性较大(ED50为0.83mg/ kg)；而小鼠体内使用20倍有效剂量的TN，未见毒性作用(Li,et al.,2015)。

已有报道，TN具有抗炎和抗生殖作用，已作为男性避孕药，试用于小鼠和大鼠等动物的避孕研究，取得了一定的避孕效果，在有效剂量范围内毒性很小(王岚等.,2000；张建伟等.,2001)。

最近，He.L 等报道，TN能够促进细胞IL-37高表达，增强免疫效应(He,et al.,2015)。

[0018]发明人发现纳摩尔水平的雷公藤内酯酮(0-8nM)能通过抑制PNKP启动子活性来抑制胰腺癌细胞PNKP基因和蛋白的表达，与常用PNKP抑制剂A12B4C3(A12B4C3通过结合到人PNKP蛋白Trp402上来影响PNKP蛋白的二级结构，从而进一步抑制PNKP的酶活性，其对PNKP 的表达没有明显影响)作用机制不同，而且比常用的PNKP抑制剂A12B4C3强100倍以上。

因此本发明还提供了雷公藤内酯酮作为多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶抑制剂的应用。

[0019]本发明还提供了一种治疗胰腺癌的药物，包括有效量的多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶抑制剂、其药学上可接受的盐或衍生物。

[0020]本领域技术人员可将所述PNKP抑制剂或其药学上可接受的盐直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如崩解剂、润滑剂、乳化剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成常用剂型，包括但不限于胶囊、微囊、片剂、颗粒剂、分散粉末、注射剂、脂质体、口服液、静脉注射液、肌肉注射液或可直接应用于肿瘤的药物剂型。

[0021]本发明所述药物中可以含有0.05wt％～90wt％的PNKP抑制剂或其药学上可接受的盐。

在一些实施例中，本发明所述药物中可以含有15wt％～60wt％的PNKP抑制剂或其药学上可接受的盐。

[0022]本发明所述药物可以通过以下方式中的适合方式给药：口服、直肠给药、鼻腔给药、局部给药、口腔给药、舌下给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选腹膜内或肌注用药方式。

[0023]本发明所述治疗胰腺癌的药物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病程严重程度以及诊治医师的主观判断。

本领域的技术人员根据上述因素可以容易地决定使用剂量和使用方法。

一般本发明所述药物制剂可以按照0.005～10mg/kg/天的剂量使用，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围使用。

[0024]优选的，所述多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶抑制剂为雷公藤内酯酮、其药学上可接受的盐或衍生物。

[0025]其中，所述雷公藤内酯酮具有式I所示结构，
[0026]
[0027]本发明所述雷公藤内酯酮可以通过从雷公藤提取而得，也可以通过已知的方法化学合成而得。

[0028]由上述技术方案可知，本发明通过免疫组织化学染色法证明免疫组织化学染色法在胰腺癌组织中的表达明显低于癌旁组织，且PNKP表达越低，胰腺癌恶性程度越高。

因此提供了多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶在制备诊断胰腺癌的产品中的应用。

本发明还提供了雷公藤内酯酮作为多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶抑制剂的应用。

本发明进一步还提供了多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶抑制剂在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。

多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶作为诊断胰腺癌的标志物，使胰腺癌诊断更加准确、快速，作为治疗胰腺癌药物的靶标为治疗胰腺癌提供了新的治疗靶点和治疗途径。

附图说明
[0029]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0030]图1示实施例1胰腺癌病人肿瘤组织PNKP异常低表达；其中图A用PNKP特异性抗体和免疫组织化学染色法分析了PNKP蛋白在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达情况；图B：对PNKP蛋白在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达情况进行统计学分析；图C：对PNKP蛋白在胰腺癌组织(I-II期、III-IV期)和癌旁组织中的表达情况进行统计学分析；
[0031]图2示实施例2 PNKP在正常组织中高表达，而在胰腺癌细胞中低表达；**P值小于0.01；
[0032]图3示实施例3 PNKP过表达抑制肿瘤细胞DNA损伤，图中箭头表示DNA损伤；[0033]图4示实施例4 PNKP过表达降低致瘤性；其中图A：计数相同数目的细胞，与低熔点琼脂糖培养液孵育14天后，用体式学显微镜拍照；图B：克隆形成数目的统计图，**P值小于0.01；
[0034]图5示实施例5 PNKP抑制剂雷公藤内酯酮有效地抑制胰腺癌细胞内PNKP基因表达；图A：人胰腺癌细胞Patu8988和Panc-1与0-8nM TN共同孵育3天后，收集细胞，提取RNA，通过RT-PCR从基因水平上检测雷公藤内酯酮对PNKP表达的影响，**P值小于0.01；图B：对Patu8988细胞结果的统计学分析；图C：对Panc-1细胞结果的统计学分析；
[0035]图6示实施例6 PNKP抑制剂雷公藤内酯酮有效地抑制胰腺癌细胞内PNKP蛋白表达；图A：人胰腺癌细胞Patu8988和Panc-1与0-8nM TN共同孵育3天后，收集细胞，提取蛋白
样品，通过western-blot从蛋白水平上检测雷公藤内酯酮对PNKP的表达的影响，**P值小于0.01；图B：对Patu8988细胞结果的统计学分析；图C：对Panc-1细胞结果的统计学分析；[0036]图7示实施例7 PNKP抑制剂雷公藤内酯酮抑制胰腺癌细胞内PNKP启动子的活性；图中纵坐标表示PNKP启动子活性，横坐标表示雷公藤内酯酮的浓度；
[0037]图8示实施例8 comet实验验证PNKP抑制剂雷公藤内酯酮诱导胰腺癌细胞内DNA损伤，图中箭头表示DNA损伤；
[0038]图9示实施例9γH2AX实验证明PNKP抑制剂雷公藤内酯酮诱导肿瘤细胞DNA损伤；[0039]图10示实施例10 PNKP抑制剂雷公藤内酯酮诱导胰腺癌细胞凋亡；图中纵坐标表示FITC-Annexin V的染色强度，横坐标表示PI的染色强度。

具体实施方式
[0040]本发明公开了多聚核苷酸-5’激酶-3’磷酸酶的新应用。

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。

特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。

本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0041]为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0042]如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂及细胞均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

如免疫组化试剂盒购自上海基因公司。

细胞培养基RPMI 1640、DMEM(高糖)和胎牛血清为Hyclone公司产品。

Alamarblue试剂为INVITROGEN公司产品。

[0043]实施例1、PNKP在胰腺癌组织中低表达
[0044]收集了124例胰腺癌病人的手术后癌组织与癌旁组织，用免疫组织化学染色法分析了PNKP蛋白在不同组织中的表达情况。

[0045](一)实验材料
[0046]将收集的124例胰腺癌病人的手术后癌组织与癌旁组织通过商业公司构建胰腺癌组织芯片；免疫组化试剂盒。

[0047](二)实验方法
[0048]脱蜡前，应将胰腺癌患者组织芯片在室温中放置于60℃恒温箱中烘烤30min，组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min，无水乙醇中浸泡5min，95％乙醇中浸泡5min，85％乙醇中浸泡5min，75％乙醇中浸泡5min，自来水冲洗，最后蒸馏水冲洗，3min×2次；在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将切片片放入，断电，间隔5min，反复2次；PBS洗3次各5min；滴加正常山羊血清封闭液，室温30min，甩去多余液体；滴加一抗50μl，4℃过夜；PBS洗3次各5min，滴加羊抗鼠/兔二抗50μl，37℃1h；PBS洗3次各5min，加DAB显色5-20min；PBS洗3次各5min，放置于烘箱内烘干；封片、镜检。

[0049](三)实验结果
[0050]结果显示PNKP在胰腺癌病人的癌旁(Adi.Normal tissue)组织呈高表达，在胰腺
癌病人癌组织(PC)中为低表达(图1A和1B)。

[0051]采用美国癌症联合委员会(AJCC)2007年标准对胰腺癌病人进行分期分析显示，I 和II期(早期)和III和IV期(晚期)胰腺癌病人癌组织PNKP基因表达水平要比癌旁组织分别低3.5倍和8.1倍(图1C)，表明胰腺癌病人癌组织PNKP非常显著降低(P<0.01)。

临床胰腺癌病人临床分期分析揭示，PNPK表达水平越低，胰腺癌病人临床分期越差，这些结果提示PNKP 表达水平高低与胰腺肿瘤恶性程度高低密切相关，PNKP表达越低，胰腺癌恶性程度越高。

[0052]实施例2、PNKP在正常组织中高表达，而在胰腺癌细胞中低表达
[0053](一)实验材料
[0054]人胰腺癌细胞Patu-8988、Panc1、SW1990、CFPAC-1、ASPC-1和BXPC-3为本实验室保存；细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。

Trizol试剂：购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒：Fermentas，美国；PCR试剂盒：ABI公司产品；正常组织cDNA购自商业公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司。

[0055](二)实验方法
[0056]取对数生长期的人胰腺癌细胞，采用Trizol提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。

PCR 反应体系为25μl，PCR条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，45个循环，72℃延伸8min。

所得数据通过2-ΔΔCT进行分析：ΔCt＝Ct(mRNA)-Ct(actin)。

Ct代表反应体系中荧光信道的强度值达到设定阈值时的PCR循环次数。

[0057](三)实验结果
[0058]实时定量PCR显示，PNKP mRNA在六株人胰腺癌细胞株(Patu-8988、Panc1、SW1990、CFPAC-1、ASPC-1和BXPC-3)中的表达显著低于六种正常人组织(肝脏、胰脏、脾脏、前列腺、睾丸和卵巢)中的表达(图2)，提示PNKP在正常组织中高表达，而在胰腺癌细胞中低表达。

[0059]实施例3、PNKP过表达抑制肿瘤细胞DNA损伤。

[0060](一)实验材料
[0061]人胰腺癌细胞Patu-8988为本实验室冻存。

细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。

comet试剂盒：Trevigen，美国。

[0062](二)实验方法
[0063]将人PNKP基因克隆进venus载体，venus与venus-PNKP分别侵染肿瘤细胞，并经过筛选成为稳定表达的肿瘤细胞株。

取对数生长期的以上细胞，接种于培养皿内，进行UVB辐照(2mJ/cm2)，制备细胞悬液，取30细L细胞悬液在200悬L0.6％的低熔点琼脂糖凝胶中充分混匀，将混合液轻轻滴加于铺有1％普通琼脂糖的载玻片上，待胶凝固后，4℃解旋液中放置20min，然后电泳20min，预冷的去离子水清洗载玻片3-5次，再用预冷的70％乙醇4℃固定5min，风干后，加入SYBR Green I染料，室温放置10min。

最后，去离子水将载玻片清洗干净后，在荧光显微镜下拍照。

[0064](三)实验结果
[0065]前面结果显示PNKP在肿瘤组织和细胞中低表达，由于PNKP蛋白是一种DNA损伤修复蛋白。

那么，PNKP过表达后能否降低DNA损伤呢？因此，我们利用彗尾实验(comet)观察了UVB辐射对PNKP过表达及其对照的胰腺癌细胞DNA损伤的作用。

结果显示，UVB辐射后能显著地促进对照的人胰腺癌细胞DNA损伤，而对PNKP过表达的胰腺癌细胞DNA损伤则影响不大(图3A和3B)，提示PNKP过表达抑制肿瘤细胞DNA损伤。

[0066]实施例4、PNKP过表达降低致瘤性。

[0067](一)实验材料
[0068]肿瘤细胞株及试剂：人胰腺癌细胞Patu-8988(venus-PNKP和venus)为本实验室冻存。

细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。

[0069](二)实验方法
[0070]培养PNKP过表达及其对照的胰腺癌细胞，收集细胞并计数，每个浓度取1000个活细胞与甲基纤维素一起震荡混匀加入30mm的小皿中。

细胞培养14天后进行计数和拍照，并且统计实验结果。

[0071](三)实验结果
[0072]克隆形成实验结果显示，PNKP过表达的胰腺癌细胞集落生成能力显著大于对照组的胰腺癌细胞(图4A和4B)，提示PNKP过表达能显著降低肿瘤细胞的致瘤性。

[0073]实施例5、雷公藤内酯酮抑制胰腺癌细胞PNKP基因的表达
[0074](一)实验材料
[0075](1)肿瘤细胞株及试剂：人胰腺癌细胞Patu-8988和Panc1；细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。

Trizol试剂：购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒：Fermentas，美国；PCR试剂盒：大连宝生物工程有限公司；GelRed核酸凝胶染料：购自美国Boitium；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司。

[0076](2)受试药物：雷公藤内酯酮用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

[0077](二)实验方法
[0078]用生物信息方法筛选差异表达基因，DNA损伤修复基因，再找出雷公藤内酯酮作用的候选基因，并用PCR测定了雷公藤内酯酮处理前后胰腺癌细胞中基因表达水平。

取对数生长期的人胰腺癌细胞，接种于T25培养瓶内，并分别加入含不同浓度雷公藤内酯酮的完全培养基，对照组加入含0.001％DMSO的培养基，作用3天后采用Trizol提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。

PCR反应体系为25μl，PCR条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，22-35个循环，72℃延伸8min。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍照。

[0079](三)实验结果
[0080]RT-PCR显示，8nM雷公藤内酯酮能使胰腺癌Patu8988和Panc1细胞中DNA损伤修复基因PNKP mRNA水平非常明显地降低(图5A-5C)，提示非常低剂量的雷公藤内酯酮就能有效地抑制胰腺癌细胞中PNKP基因表达。

[0081]实施例6、雷公藤内酯酮对胰腺癌细胞PNKP蛋白表达的影响
[0082](一)实验材料
[0083](1)肿瘤细胞株及试剂：人胰腺癌细胞Patu-8988和Panc1；细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。

[0084](2)受试药物：雷公藤内酯酮用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

[0085](二)实验方法
[0086]采用western-blot法测定了雷公藤内酯酮对胰腺癌细胞内PNKP蛋白表达的影响。

取对数生长期的人胰腺癌细胞，接种于T25培养瓶内，并分别加入含不同浓度雷公藤内酯酮的完全培养基，对照组加入含0.001％DMSO的培养基，作用3天后收集细胞并提取细胞总蛋白。

制备SDS-聚乙丙烯蛋白电泳胶，待凝胶聚合后，每个加样孔加入30mg上述细胞蛋白样品，以恒压150V进行电泳。

电泳结束后，以恒流250mA将SDS-聚乙丙烯蛋白电泳胶上的蛋白转移至NC纤维膜上。

转膜结束后，取出NC膜，用5％牛奶(1×TBST配制)封闭液封闭2小时。

封闭结束后，用1×TBST洗涤NC膜3次，10min/次，孵PNKP抗体4℃过夜。

一抗孵育之后，用1×TBST洗膜3次，10min/次后，孵HRP辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG抗体，室温孵育2小时。

二抗孵育结束后，用1×TBST洗膜3次，10min/次后，加入ECL显影液，用Koda凝胶成像系统显影。

[0087](三)实验结果
[0088]结果显示，雷公藤内酯酮能显著地抑制人胰腺癌Patu8988和Panc1细胞中PNKP蛋白的表达，并呈现剂量依赖性(图6A-6C)。

以上结果提示雷公藤内酯酮能抑制人胰腺癌细胞内PNKP蛋白的表达。

[0089]实施例7、雷公藤内酯酮抑制胰腺癌细胞PNKP启动子的活性
[0090]前面结果显示，雷公藤内酯酮可以抑制胰腺癌细胞PNKP基因和蛋白的表达，其机制是否是通过抑制PNKP启动子的活性进而抑制基因和蛋白的表达，于是进一步检测雷公藤内酯酮对PNKP启动子的影响。

[0091](一)实验材料
[0092](1)肿瘤细胞株及试剂：人胰腺癌细胞Patu-8988和Panc1；细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。

[0093](2)受试药物：雷公藤内酯酮用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

[0094](二)实验方法
[0095]首先用不同浓度的药物对含有PNKP启动子片段的阳性细胞处理48小时。

然后用双荧光素酶报告系统检测PNKP启动子的活性，通过检测细胞内荧光素酶报告基因的表达强度来反映PNKP启动子活性的强弱。

具体操作为：将PNKP启动子克隆到pGL4载体上，然后用阳性重组子转染肿瘤细胞，经G418筛选得到稳定转染的阳性细胞株。

将对数生长期的阳性细胞，接种于6孔板中，然后分别用不同浓度的药物处理细胞，于37℃、5％CO2培养箱培养48小时。

收集药物作用后的细胞制备蛋白裂解液，分别取20μL进行化学发光检测实验，在加入荧光素酶底物后反应5秒，立即用化学发光仪进行荧光检测，记录检测所得化学发光荧光值。

用Excel对所测数据进行整理分析，并用SPSS16.0软件对结果进行方差分析。

[0096](三)实验结果
[0097]结果显示雷公藤内酯酮可以明显抑制PNKP启动子活性(图7)。

表明雷公藤内酯酮通过抑制其启动子活性来抑制胰腺癌细胞PNKP基因和蛋白的表达，与现有的PNKP抑制剂(抑制PNKP活性)作用机制不同。

[0098]实施例8、雷公藤内酯酮通过抑制PNKP表达促进胰腺癌细胞DNA损伤：方法一[0099]前面结果显示雷公藤内酯酮不同于其他的PNKP抑制剂，雷公藤内酯酮能通过抑制PNKP启动子活性来抑制PNKP基因和蛋白的表达。

还发现PNKP蛋白是一种DNA损伤修复蛋白，在胰腺癌组织低表达，且与胰腺癌的恶性程度密切相关。

进一步为了确定雷公藤内酯酮能。