消银颗粒和开玄补肾方对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型的影响

【实验研究】
消银颗粒和开玄补肾方对咪喹莫特诱导的
银屑病样小鼠模型的影响*
尹秀平1程晓菲2宋坪1※范竹雯3△
摘要：目的观察比较消银颗粒和开玄补肾方对银屑病小鼠模型的干预作用。

方法将30只BALB/c雄性小鼠随机分为空白组、模型组、消银颗粒组、开玄补肾方组和甲氨蝶呤组。

实验期间每天观察银屑病样小鼠皮损变化，对小鼠背部皮肤进行拍照，并进行银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评分；造模后第7d取小鼠背部皮肤组织，HE染色观察皮肤组织病理学改变并检测表皮厚度；免疫组化法检测皮损表皮中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。

结果根据模型组小鼠红斑、鳞屑、浸润评分及其肉眼观察，模型组小鼠皮损与银屑病样皮损类似，造模成功；在2 7d时，开玄补肾组、消银颗粒组、甲氨蝶呤组各项PASI评分均低于模型组小鼠，在4 6d时，PASI评分显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），其中消银颗粒组小鼠鳞屑评分与开玄补肾方组相比下降更明显（P＜0.05或P＜0.01），而开玄补肾方组小鼠皮损红斑评分与消银颗粒组小鼠相比下降更显著，差异有统计学意义（P＜0.05）；HE和PCNA染色显示，消银颗粒组、开玄补肾方组和甲氨蝶呤组小鼠表皮厚度显著减少，炎症细胞浸润得到抑制，表皮着色细胞层数减少（P＜0.01），其中开玄补肾方组小鼠表皮厚度、表皮着色细胞层数与消银颗粒组相比减少趋势更加明显。

结论消银颗粒和开玄补肾方可以减少小鼠银屑病样皮损、降低表皮厚度并抑制表皮细胞过度增殖，但开玄补肾方对于皮损浸润肥厚的血瘀型斑块状银屑病具有较好的改善作用，而消银颗粒对于鳞屑较多的风燥型银屑病具有较好的改善作用。

关键词：白疕；银屑病；咪喹莫特；消银颗粒；开玄补肾；风燥型；血瘀型
doi：10．3969/j．issn．1003-8914．2019．02．020文章编号：1003-8914（2019）-02-0220-05
Effect of Xiaoyin Granule and Kaixuan BushenＲecipe on Imiquimod-induced Psoriasis in Mouse
YIN Xiuping1CHENG Xiaofei2SONG Ping1※FAN Zhuwen3△
（1．Department of Dermatology，Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100053，China；
2．Department of Chinese MedicineＲehabilitation Physical Therapy，Hancunhe Town Community Health Service Center
in Fangshan District，Beijing100053，China；3．Guangming Journal of Chinese Medicine，Beijing100045，China）Abstract：Objective To observe and compare the intervention effect of Xiaoyin granule and Kaixuan Bushen recipe on psoriasis mice model．Method30BALB/c male mouse are randomly divided into blank group，model group，Xiaoyin granules group，Kaixuan Bushen recipe group and methotrexate group．During the experiment，the skin lesions of psoriasis-like mice were observed daily，and the skin of the back of the mice was photographed，and the psoriasis lesion area and severity index（PASI）scores were scored．The skin tissues of the back of the mice were taken on the7th day after modeling，and the histopathological changes of the skin were observed and the thickness of the epidermis was detected by HE staining．The expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in epidermis by immunohistochemical method was used．According to the scores of erythema，scales，infiltration and naked eye observation，the skin lesions of model mice were similar to those of psoriasis-like lesions．Ｒesult At2 7days，the PASI scores of Kaixuan Bushen group，Xiaoyin granule group and methotrexate group were lower than those of model group．At4 6days，the PASI scores of Xiaoyin granule group were significantly lower than those of Kaixuan Bushen recipe group（P＜0.05），and the scale scores of mice in Kaixuan Bushen recipe group were significantly lower than those in Kaixuan Bushen recipe group（P＜0.05or0.01）．Compared with mice in Xiaoyin granule group，the erythema score of skin lesion decreased more significantly（P＜0.05）．HE and PCNA staining showed that the epidermal thickness of mice in Xiaoyin granule group，Kaixuan Bushen recipe group and methotrexate group decreased significantly，the infiltration of inflammatory cells was inhibited，and the number of epidermal staining cell layers decreased（P＜0.01）．The epidermal thickness and the number of epidermal staining cell layers in Kaixuan Bushen recipe group decreased obviously compared with Xiaoyin granule group．Conclusion Xiaoyin granule and Kaixuan Bushen recipe can reduce psoriasis-like skin lesions，reduce epidermal thickness and inhibit excessive proliferation of epidermal cells in mice，but Kaixuan Bushen recipe has a good improvement effect on plaque psoriasis of blood stasis type with hypertrophic skin lesions，and Xiaoyin granule has a good improvement on wind-drying psoriasis with more scales．
Key words：white crust；psoriasis；imiquimod；Xiaoyin granule；Kaixuan Bushen recipe；wind dryness type；blood stasis type
*基金项目：国家自然科学基金项目（No．81573984）
作者单位：1．中国中医科学院广安门医院皮肤科（北京100053）；
2．北京市房山区韩村河镇社区卫生服务中心中医康复理
疗科（北京102400）；3．光明中医杂志社（北京100045）
△通讯作者※指导老师
银屑病是一种常见炎性、增殖性皮肤病，组织病理表现为角化不全，真皮乳头部血管迂曲扩张，伴有炎症细胞浸润。

中医多从血热、血燥、血瘀3型论治银屑病。

消银颗粒是中成药制剂，具有清热凉血、养血润燥、祛风止痒功效，用于治疗症见皮疹为点滴状，基底鲜红色，表面覆有银白色鳞屑，或皮疹表面附有较厚的银白色鳞屑，较干燥等的血热风燥型或血虚风燥型银屑病。

开玄补肾方是宋坪主任医师依据银屑病的核心病机“玄府闭郁，肾精亏损”提出的自拟方剂，用于皮损特点为皮损肥厚，颜色暗红，日久不退的血瘀型斑块状银屑病，临床疗效确切。

本研究通过建立咪喹莫特诱导的小鼠皮肤银屑病样皮损模型，研究比较消银颗粒和开玄补肾方对银屑病小鼠模型的干预作用，为临床治疗和进一步深入研究银屑病发病机制提供理论依据。

1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物BALB/c小鼠，雄性，体质量18 22g，北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物体质量合格证明：SCXK（京）2014－0013。

1.1.2实验药物5%咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限责任公司，批号：国药准字H20030128）；消银颗粒（陕西康惠制药股份有限公司，批号：国药准字Z20000019）药物组成及浓度：生地黄、牡丹皮、赤芍、当归、苦参、金银花、玄参、牛蒡子、蝉蜕、白鲜皮、大青叶、红花、防风，浓度：1.3g/kg；开玄补肾方（中国中医科学院广安门医院药剂室提供）药物组成及浓度：生麻黄、淫羊藿、黑附片、威灵仙、全蝎、桂枝、白花蛇舌草、土茯苓、甘草，浓度：0.65g/kg；甲氨蝶呤片（上海上药信谊药厂有限公司，批号：国药准字H31020644，浓度：1mg/kg）
1.2实验方法
1.2.1造模、分组及给药咪喹莫特诱导BALB/c 小鼠银屑病样模型的建立及评价：采用随机数字表法，将30只小鼠随机分为5组，每组6只：空白组、模型组、消银颗粒组、开玄补肾方组、甲氨蝶呤组。

将BALB/雄性小鼠以戊巴比妥钠（80mg/kg）经腹腔注射麻醉，刮除其背部毛发，形成约2cmˑ3cm 大小的暴露区域，然后除空白组外各组涂抹5%咪喹莫特软膏，每天1次，连续7d。

具体给药情况如下：空白组：每日定时在小鼠裸露背部涂抹适量凡士林，同时以生理盐水灌胃，0.4ml/（次·d）；模型组：每日定时在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特乳膏42mg，同时以生理盐水灌胃，0.4ml/（次·d）；消银颗粒组：每日定时在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特乳膏42mg，同时以消银颗粒浓度2.16g/kg，灌胃，0.4ml/（次·d）；开玄补肾方组：每日定时在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特乳膏42mg，同时以浓度0.65g/kg，灌胃，0.4ml/（次·d）。

实验期间每天对背部皮肤进行拍照及皮损评分，造模后第7天取背部皮肤进行病理学检测，显微镜下观察表皮厚度和炎症浸润。

1.2.2小鼠皮损面积和疾病严重程度指数（PASI）评分采用数码照相的方法每天记录，并依据PASI评分标准，给予小鼠皮损处红斑、鳞屑及浸润增厚程度0 4的积分。

评分标准如下：0，无；1，轻度；2，中度；3，重度；4，极重度。

对各组小鼠积分取平均值，观察各组小鼠皮损的变化情况。

1.2.3小鼠皮损组织HE染色检测在造模后第7天取材，每个组随机选取小鼠背部20个部位皮损组织，石蜡包埋固定、切片，经HE染色，显微镜下观察小鼠皮肤组织形态学变化并测量表皮厚度，计算平均值。

1.2.4小鼠皮损组织PCNA免疫组化染色检测取小鼠皮损组织石蜡包埋切片后，免疫组化法检测皮损表皮中PCNA的表达。

1.3统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，实验数据可用均数ʃ标准差（珋xʃs）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）进行处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1消银颗粒和开玄补肾方对银屑病样小鼠皮损PASI评分的影响与空白组小鼠比较，咪喹莫特涂抹2d后模型组小鼠皮肤即出现鳞屑、浸润，第3天出现红斑，随着用药天数增加，模型组小鼠背部皮损红斑持续增加，由淡红色斑点转为大面积红色斑块，皮肤浸润、增厚明显，形成类似银屑病样皮损；开玄补肾方组、消银颗粒组、甲氨蝶呤组与模型组小鼠相比，红斑变浅，鳞屑、浸润减少，皮肤较光滑，皮损损伤明显改善，在2 7d时，3组各项PASI评分均低于模型组小鼠，其中，在4 6d时，PASI评分显著降低，红斑、浸润、鳞屑抑制明显（P＜0.05或0.01）；与消银颗粒组比较，在第3、4、6、7天时开玄补肾方组小鼠红斑评分下降更明显，尤其是第6天时2组红斑评分差异具有统计学意义（P＜0.05），而在第2、3、5天时消银颗粒组小鼠鳞屑评分与开玄补肾方组相比下降更明显，尤其是在第5天时2组鳞屑评分差异具有统计学意义（P＜0.05）。

见图1、表1。

图1各组小鼠第6天皮损表1
小鼠皮损PASI 评分
（只，珋
x ʃs ）皮损
组别
样本数
1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 空白组6000
模型组
600
0.50ʃ0.201）0.90ʃ0.202） 1.30ʃ0.302） 1.60ʃ0.402） 1.20ʃ0.402）红斑
消银颗粒组
600.03ʃ0.070.40ʃ0.200.60ʃ0.103）0.60ʃ0.103） 1.00ʃ0.304）
1.10ʃ0.40
开玄补肾方组600.03ʃ0.07
0.32ʃ0.140.46ʃ0.223）0.72ʃ0.164）0.62ʃ0.204）5）0.64ʃ0.31甲氨蝶呤组6000.35ʃ0.15
0.48ʃ0.153）
0.70ʃ1.114）
0.83ʃ0.204）
1.58ʃ0.34
空白组600
模型组
600.20ʃ0.302）0.50ʃ0.202） 1.10ʃ0.302） 1.60ʃ0.302） 1.80ʃ0.302） 1.30ʃ0.502）鳞屑消银颗粒组
600.10ʃ0.100.40ʃ0.100.70ʃ0.204）0.80ʃ0.203）5） 1.10ʃ0.604） 1.00ʃ0.80开玄补肾方组600.13ʃ0.090.61ʃ0.180.60ʃ0.244）0.92ʃ0.193）0.78ʃ0.273）0.52ʃ0.183）甲氨蝶呤组600.10ʃ0.10
0.67ʃ2.40
0.80ʃ0.234）
1.03ʃ0.073）
1.13ʃ0.383）
0.62ʃ0.193）
空白组600
模型组
600.40ʃ0.21）0.90ʃ0.202） 1.20ʃ0.202） 1.60ʃ0.302） 1.80ʃ0.302） 1.60ʃ0.302）浸润消银颗粒组
600.30ʃ0.300.60ʃ0.103）0.80ʃ0.203）0.80ʃ0.303） 1.20ʃ0.60 1.10ʃ0.60开玄补肾方组600.28ʃ0.220.48ʃ0.143）0.76ʃ0.173）0.98ʃ0.163）0.86ʃ0.203） 1.18ʃ0.19甲氨蝶呤组
6
0.30ʃ0.14
0.57ʃ0.10
0.80ʃ0.143）
1.10ʃ0.103）
1.20ʃ0.223）
1.42ʃ0.19
注：与空白组比较，
1）P ＜0.05，2）P ＜0.01；与模型组比较，3）P ＜0.01，4）P ＜0.01；与消银颗粒组比较，5）
P ＜0.052.2
消银颗粒和开玄补肾方对银屑病样小鼠皮损病
理改变的影响HE 染色结果显示：与空白组小鼠比
较，模型组小鼠皮损角化不全，表皮棘层细胞大量增
殖，真皮炎症细胞浸润明显，表皮厚度明显增加（P ＜0.01）；与模型组小鼠比较，消银颗粒和开玄补肾方组、甲氨蝶呤组表皮角化不全的细胞明显减少，炎症细胞浸润得到抑制，表皮厚度显著低于模型组（P ＜0.01）；与消银颗粒组比较，开玄补肾方组小鼠表皮厚度减少趋势优于消银颗粒组。

见图2、表2。

表2消银颗粒和开玄补肾方对银屑病样小鼠背部
表皮厚度的影响
（只，珋
x ʃs ）组别样本数
表皮厚度（μm ）
空白组617.62ʃ5.70模型组680.43ʃ11.781）消银颗粒组648.67ʃ13.342）开玄补肾方组644.68ʃ10.782）甲氨喋呤组
6
46.50ʃ12.242）
注：与空白组比较，
1）P ＜0.01；与模型组比较，2）
P ＜0.
01图2各组HE 染色（HE 染色40ˑ）
2.3消银颗粒和开玄补肾方对银屑病样小鼠皮损表皮PCNA 过度增殖的影响PCNA 可以反映细胞增殖
状况，免疫组织化学法PCNA 显色结果发现，空白组小鼠表皮呈现弱阳性，模型组小鼠表皮着色细胞层数明
显增多；与模型组小鼠比较，消银颗粒组、补肾方组和甲氨蝶呤组小鼠表皮着色细胞层数减少（P ＜0.01），其中，补肾方组小鼠阳性细胞数较消银颗粒组小鼠减少趋势更加明显。

见图3。

图3各组小鼠PCNA 的表达情况（IHC －P 40ˑ）
3讨论银屑病俗称“牛皮癣”，是一种常见的慢性增殖性自身免疫性疾病，以红斑、鳞屑、浸润为主要临床表现，以角质形成细胞过度增生，真皮层毛细血管扩张、炎症细胞浸润为主要病理表现
［1］
，PCNA 在增殖细胞中表
达，检测PCNA 可以反应细胞增殖状况，以上指标可以
用来观察开玄补肾方和消银颗粒对于银屑病样小鼠皮损的作用机制。

咪喹莫特是Toll 样受体激动剂，可以诱导小鼠体内树突状细胞的成熟和分泌，激活皮损周围T 淋巴细胞，导致自身性免疫反应，其诱导的小鼠银屑病样皮损动物模型在皮损形态、组织病理结构等方面都与人类银屑病的表现十分相似，该皮损模型在国内外已被证实
［2，3］。

我们采用该方法，观察小鼠背部红斑、鳞屑、
炎症浸润。

在小鼠背部涂抹咪喹莫特乳膏后，第2天观察到小鼠背部皮肤出现浸润及鳞屑，第3天出现红斑，随着用药天数增加，皮损在第6天达到顶峰，继续涂抹，皮损分值逐渐下降。

根据PASI 评分，说明动物模型在第7天稳定性下降，推测咪喹莫特外用诱导的是一个暂时的炎症爆发，该模型在咪喹莫特持续作用下可能发生药物适应、耐受情况
［4］
，所以6天为一个观
察周期，来观察红斑、浸润、鳞屑情况。

组织病理显示，涂抹咪喹莫特乳膏后，表皮内细胞数量增加，真皮炎症细胞浸润。

甲氨蝶呤是一种抗肿瘤药，临床常用于系统性红斑狼疮等自身免疫疾病
［5］
，也是临床上常用的
有效的治疗银屑病药物，
其通过抑制角质形成细胞过度增生、减轻及抑制皮损内炎症反应、抑制新血管生成来治疗银屑病，因此把甲氨蝶呤设为阳性对照组。

本研究PASI 评分结果显示：开玄补肾方组、消银颗粒组和甲氨蝶呤组小鼠在观察期间红斑、浸润、鳞屑评分均低于模型组（P ＜0.05），
但开玄补肾方组在改善皮损红斑方面优于消银颗粒组，而消银颗粒组在改善皮损鳞屑方面优于开玄补肾方组，表明消银颗粒和开玄补肾方能够改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损状况，治疗效果与甲氨蝶呤相当，但开玄补肾方能够更好的改善皮损红斑症状，而消银颗粒对皮损鳞屑症状有显著改善。

组织病理显示：开玄补肾方组、消银颗粒组和甲氨蝶呤组表皮厚度、血管扩张及真皮炎症细胞浸润均较模型组明显减轻（P ＜0.05），
其中开玄补肾方在降低表皮厚度方面优于消银颗粒。

免疫组化法PCNA 染色显示：模型组小鼠的表皮细胞增殖明显增多，开玄补肾方组、消银颗粒组和甲氨蝶呤组与模型组相比可以明显降低细胞增殖（P ＜0.05），
开玄补肾方组、消银颗粒组与甲氨蝶呤组差异较小，结果表明开玄补肾方、消银颗粒可以抑制皮损增厚，而开玄补肾方较消银颗粒组抑制皮损增厚的作用更加明显。

银屑病在中医学中属于“白疕”范畴，临床多从血热、血燥、血瘀3型辨证
［6］。

血热型银屑病皮损特点是
皮损发展较快，呈鲜红色，不断有新的皮疹出现；血燥
型银屑病皮损特点为病久皮肤干燥，鳞屑层层，原有皮损部分消退，新的皮疹出现不多；血瘀型银屑病皮损特点为皮损肥厚，颜色暗红，日久不退。

消银颗粒由生地黄、牡丹皮、赤芍、当归、苦参、金银花、玄参、牛蒡子、蝉蜕、白鲜皮、大青叶、红花、防风组成，用于治疗症见皮疹为点滴状，基底鲜红色，表面覆有银白色鳞屑，或皮疹表面附有较厚的银白色鳞屑，较干燥等的血热风燥型或血虚风燥型银屑病
［7，8］。

本方中当归、红花具有
活血化瘀功效；赤芍、牡丹皮、金银花具有清热凉血功效；大青叶具有清热解毒功效；生地黄、玄参具有清热凉血、养阴生津功效；牛蒡子具有清热祛风、透疹解毒功效；苦参、白鲜皮、蝉蜕和防风具有清热解毒、祛风止痒功效，组方用药表明其适用于风燥型银屑病，与本研
究结果消银颗粒可以改善小鼠银屑病样皮损，尤其是改善皮损鳞屑症状相一致，从实验动物角度证明消银颗粒对于鳞屑较多的风燥型银屑病具有较好的改善作用。

宋坪主任医师［9，10］认为“玄府闭郁，肾精亏损”是血瘀型斑块状银屑病的核心病机，风邪外袭，玄府开阖失司，气液郁闭于内，日久化热成毒，热毒缠结络脉，壅滞肌腠，导致血管迂曲扩张，表皮细胞过度增生，产生银屑病。

《素问》曰：“勇而劳甚则肾汗出，肾汗出……逢于风，客于玄府，本之于肾，名曰风水。

”由此推测指出银屑病患者玄府闭郁症状，或根植于肾精亏损。

根据以上核心病机，宋坪主任医师提出采用自拟方“开玄补肾方”治疗。

主要用药包括：生麻黄、淫羊藿、黑附片、威灵仙、全蝎、桂枝、白花蛇舌草、土茯苓、甘草等。

全方以辛温类药物为主，既开通玄府，输布水液，濡润肾燥，使肌腠筋膜得养，在此基础上又增加淫羊藿等补肾药物，以培补肾元，助阳化气，使白疕得消，核心病机和组方用药表明开玄补肾方适用于血瘀型斑块状银屑病，与本研究结果开玄补肾方可以明显减少小鼠银屑病样皮损，尤其是改善皮损红斑症状、减少表皮厚度和抑制表皮细胞过度增殖不谋而合，从实验动物角度证明开玄补肾方对于血瘀型斑块状银屑病具有较好的改善作用。

综上所述，消银颗粒和开玄补肾方可以减少小鼠银屑病样皮损、降低表皮厚度及抑制表皮细胞过度增殖，但开玄补肾方对于皮损浸润肥厚的血瘀型斑块状银屑病具有较好的改善作用，而消银颗粒对于鳞屑较多的风燥型银屑病具有较好的改善作用。

本研究只是利用动物模型对开玄补肾方和消银颗粒治疗银屑病进行初步探索，后期仍需进一步深入探究两个组方对银屑病小鼠皮损及组织病理学改变影响的作用机制，以期指导临床用药。

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（本文校对：刘丽收稿日期：2018－12－07）
（上接第213页）
4饮食起居，心理健康
范教授认为，痤疮的治愈与生活习惯的改善不无关系。

遇到因病情影响外观，心理压力较大的患者，范教授往往嘱患者放下心理包袱；同时，嘱患者勿食辛辣、刺激之品，建立良好的生活作息习惯，慎用化妆品，对敏感皮肤，尽量不用化妆品等。

综上所述，范教授在临床治疗痤疮这一临床常见病、多发病的过程中，积累了丰富的经验，取得了良好的治疗效果。

范教授认为痤疮的发病与肾肝肺三脏相关，肾阴不足、肝经郁热、肺火偏旺为其主要的病机；内治法方面，多采用滋阴补肾，疏肝解郁，凉血解毒之法；外治方面，根据患者病情，综合采用局部外敷、穴位注射等多种治疗手段，促进病情改善。

内治疗法和外治疗法相结合、药物疗法与非药物疗法的相统一，达到减轻症状、治愈疾病、防止毁容等目的。

参考文献
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（本文校对：杨锦锋收稿日期：2018－09－18）。