食品中微生物快速检测方法研究进展

食品中微生物快速检测方法研究进展
摘要:本文介绍了近年来新发展的食品中微生物快速检测及其自动化技术,主要包括分子生物学方法、免疫检测技术、快速测试片法和基因芯片技术并对各自优点和缺点进行了比较。

关键词:食品微生物检测;分子生物学方法;免疫检测技术;快速测试片法;基因芯片技术
多年以来,对食品微生物的检测,通常采用琼脂平板培养法,这种方法既费时费力又繁杂。

快速检测及其自动化则是通过综合引用微生物学、化学、生物化学、生物物理学、免疫学以及血清学试验技术对微生物进行分离、检测、鉴定和计数,与传统方法比较,更快、更方便、更灵敏。

本文主要介绍分子生物学方法、免疫检测技术、快速测试片法和基因芯片技术。

1分子生物学方法
1.1核酸探针法
细胞核酸DNA和RNA是唯一一类可以传递遗传信息的大分子,利用其可作为检测的标靶。

标靶通常是一个特异性的核酸序列,它可以通过补体核酸分子作为探针来检出。

探针需要附加适当的标记,如放射性同位素、酶或者发光的标识物。

现在比较热门的是以核酸杂交为基础的第二代技术—比色计。

这种方法依赖于核糖体RNA(tRNA)发育过程中储存的核酸成分进行检测,使得无辐射检测成为可能,同时又保持了与放射性同位素方法相当或者更高的灵敏度。

但是该方法每检测一种菌就需要制备一种探针,而且尚未建立所有菌种的探针,所以还有待进一步发展。

1.2聚合酶链反应法(PCR方法)
PCR检测技术是利用耐热DNA聚合酶的作用,通过变性-延伸-复性的循环操作,在体外将DNA模板迅速扩增数百万倍后,再通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增DNA产物的荧光条带,以确定微生物的特定种类的技术。

用此方法已经对乳酸菌、双歧杆菌以及啤酒中淀粉酵母和啤酒酵母、水体中大肠杆菌和大肠菌群等进行了精确的检测和鉴定。

该方法可以快速、灵敏的检测样品中是否存在某些细菌或致病菌,尤其是人工无法培养的细菌,但它仅限于核酸序列已知的微生物的鉴定,并且不能区分活细胞和死细胞,定量能力较差。

2免疫检测技术
2.1免疫检测技术的基本原理
免疫学是以抗原抗体特异性识别和结合反应为基础。

抗原是指能够刺激动物
体的免疫系统发生免疫应答,产生抗体或致敏淋巴细胞,并能在体内或体外与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质。

食品或食物中的许多大分子都是良好的抗原,而一些小分子物质(如激素、真菌毒素或农药残留物)可以通过与大分子载体(一般为蛋白质) 相结合制备成人工抗原。

因此,从理论上看食品科学中遇到的几乎一切物质都可直接或间接地作为抗原。

抗体则是抗原引起的免疫应答的产物之一,可与引发的抗原发生特异性结合反应,据此可进行精确的定性定量的分析测定。

2.2在食品检验中应用的主要免疫检测技术
(1)酶联免疫分析法(ELISA)
ELISA在食品微生物检测中运用较为广泛,最近几年出现了更灵敏的显色剂和底物,提高了ELISA的有效性。

将特定抗原或抗体吸附于固相载体的表面,酶标记物与相应的抗体或抗原结合形成酶标记抗原/抗体复合物,在遇到相应底物时,结合物上的酶催化底物产生水解、氧化或还原等反应,从而生成可溶性或不溶性的有色物质,可根据颜色的深浅来定性、定量检测相应的微生物。

近年来发展了一种基于上转换发光材料(UCP)作为标记物的免疫层析方法,在用于一些传染病的检测中取得了理想效果。

(2)乳胶凝集试验
该方法用人工大分子乳胶颗粒标记抗体与待测抗原发生肉眼可见的凝集反应,以达到检测目标病原微生物或毒素的目的。

如检测金黄色葡萄球菌的Aureus Test试剂盒,该试剂聚苯乙烯乳胶粒子中含有抗金黄色葡萄球菌A蛋白的IgG,当含有金黄色葡萄球菌的样品悬浮液加入含乳胶粒子的试剂中后,A蛋白与IgG结合,凝聚酶和鞭毛抗原结合, 1min内将产生凝聚反应,灵敏度和特异性均较高。

(3)免疫磁性微球(IMS)
由于食品检样常为固液多相混合体,借助免疫磁性分离技术可以达到快速分离的目的。

免疫磁性分离方法是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面,与样品中被检致病微生物发生特异性结合,磁性颗粒在外加磁场的作用下,向磁极方向聚集,使致病微生物得到分离和浓集。

免疫磁性分离可以很快地在含有大量杂菌的悬液中有选择性地分离出目的微生物,数倍地提高分离效率和检测极限。

3快速测试片法
快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体,将特定的培养基和显色物质附着在上面,通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

采用快速测试片检测具有显著的优点:一,可测定少量检品,不需要配制试剂,不需要大量的玻璃器皿,操作简便迅速;易于消毒保存,便于运输,携带方便,价格低廉,除纸片外无其他任何废液废物,适用于实验室、生产现场和野外环境工作使用。

二,可以在取样时同时接种,结果更能反映当时样本中真实的细菌数,防止延长接
种时间时由于细菌繁殖造成的数量增多。

三,测试片无需进行使用前的准备工作,大大缩短了时间。

4基因芯片法
基因芯片技术是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面,微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针,再与芯片上寡核苷酸点杂交,最后通过扫描仪定量并分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。

基因芯片技术可以对环境中的微生物实现高通量和并行检测。

在理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病原.用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标;同时具有灵敏、特异和快速便捷等优点,有很好的发展前景。

该方法虽然在样品采集、处理以及基因芯片技术等方面取得了很大的进展,但要更广泛地应用于检测食品微生物,还需解决诸如建立标准化程序、降低检测费用、简化样品制备和标记操作、进一步提高检测的特异性等问题。

5结束语
总之,微生物的快速检测方法在食品卫生检验方面起着越来越重要的作用。

免疫学、分子生物学、自动化和计算机技术的发展对食品微生物学检测起到了积极的促进作用。

近年来兴起的基因芯片技术及自动微生物检测系统,将从根本上改变微生物的检测方法,具有非常广阔的应用前景。

从定性和定量检测技术两方面出发,准确、可靠、方便、快速、经济是食品中微生物检测的发展方向,应尽可能使快速检测技术的灵敏度及准确度要能达到标准限量要求,至少要与标准方法检测结果相当,能在较短的时间内检测大量的样本,还必须具有实际应用价值。

参考文献:
[1]杨向荣,江志毅等.快速方法在食品微生物检测中的应用[J].学术论坛.2006.5.
[2]李军生,叶云等.免疫检测技术在食品检验中的应用[J].广西工学院学报. 2003,16(1):23-26.
[3]王兰兰.临床免疫学和免疫检验[M].北京:人民卫生出版社,2003.91-93.
[4]熊剑娟,王盛良.胶体金免疫试纸法快速测定调味汤料中罂粟生物碱[J].中国卫生监督杂志,2002,(6):354.
[5]李洪,龚涛,达永淑,等.探讨影响大肠菌群快速纸片法的因素[J].职业卫生与病伤,2002,17 (3): 198–1991.
[6]杨文鸽,孙翠玲.水产品中致病微生物的快速检测方法[J].中国食品学报.2006,6(1):402-405.
[7]BoruckiM.K.Discrimination among Listeriam onocytog enes isolates using a mixed genome DNA microarray [J].VetMicrobiol,2003,92:351~342.
[8]V olokhov Deta1.Identification of Listeria species by microarray-based assay[J].J Clin Microbiol,2002,40:4720-4728.
[9]Call D .R .Detecting and genoty ping Escherich iacoli0157:H7 using multiplexed ER and nucleic acid microarray[J].Int J Food Microbiol,200l,67:71~78.。