短期高果糖喂养对小鼠肝脏脂质沉积和胰岛素敏感性的影响

短期高果糖喂养对小鼠肝脏脂质沉积和胰岛素敏感性的影响任路平;宋光耀;章冬梅;孙文;李凡;陈树春
【摘要】目的:探讨短期高果糖饮食对小鼠肝脏甘油三酯含量及胰岛素敏感性的影响.方法:雄性C57BL/J6小鼠分为对照组及高果糖组,经喂养3 d后对小鼠行腹腔葡萄糖耐量试验,处死小鼠后测定各组肝脏甘油三酯含量,采用HE染色观察肝脏组织的病理改变;测定肝脏脂质合成酶类的蛋白表达,同时通过比较各组注射与未注射胰岛素的小鼠磷酸化Akt/总Akt (p-Akt/t- Akt)和磷酸化GSK-3α/β/总GSK-
3α/β(p- GSK-3α/β/t- GSK-3α/β)表达变化评估肝脏胰岛素敏感性.结果:喂养3 d 后,与对照组相比,高果糖组葡萄糖耐量曲线下面积和肝腔甘油三酯均显著增加(均P<0.01),同时肝组织HE染色显示高果糖组小鼠肝细胞已有明显脂滴沉积;与对照组相比,高果糖组的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)和硬脂酰辅酶A脱饱和酶-1(SCD-1)表达显著增加(均P<0.01);胰岛素注射后,与对照组相比,高果糖组的p-Akt/t-Akt及p-GSK-3α/β/t-GSK-3α/β均显著降低(均P<0.01).结论:3 d高果糖饮食即可引起肝脏脂质沉积,脂质沉积与果糖刺激FAS、ACC和SCD-1表达增加有关;肝脏脂质沉积的同时伴有肝脏胰岛素抵抗发生.%AIM: To investigate the effect of short - term high - fructose feeding on liver triglyceride content and hepatic insulin sensitivity in mice. METHODS: Male C57BL/J6 mice were divided into control group and high ( HF-ru ) fructose group. After 3 - day feeding, intraperitoneal glucose tolerance test ( ipGTT ) was performed to evaluate whole - body insulin sensitivity. The mice were sacrificed, and the liver samples were collected for measuring the liver triglyceride content and observing the pathological changes of the liver under light microscope with HE staining. The protein levels of li-pogenic
enzymes in the liver tissues were measured. To evaluate the hepatic insulin sensitivity, the protein levels ( expressed as the ratio ) of phosphorylated Akt/total Akt ( p - Akt/t - Akt ) and phosphorylated GSK - 3α/β/total GSK - 3α/ β( p - GSK - 3α/β/t - GSK - 3α/β ) were compared between 2 groups of the mice with or without insulin injection. RESULTS : After 3 - day feeding of high - fructose diet, compared with control group, the area under the curve of ipGTT and triglyceride contents in the liver tissues were significantly increased in Hfru group. HE staining of the liver in the mice in Hfru group showed obvious lipid droplet formation. Compared with control group, the protein expression of acetyl - CoA carboxylase ( ACC ), fatty acid synthase ( FAS ) and stearoyl - CoA desaturase 1 ( SCD - 1 ) was significantly increased in Hfru group. After insulin injection, the ratio of p - Akt/t - Akt and p - GSK - 3a/β/t - GSK - 3α/β was significantly decreased in Hfru group as compared with control group. CONCLUSION: A 3 - day short - term high - fructose feeding induces liver steatosis, which is related to the increased protein expression of FAS, ACC and SCD - 1. Liver steatosis occurssimultaneously with the development of hepatic insulin resistance.【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2011(027)012
【总页数】5页(P2286-2290)
【关键词】甘油三酯类;脂肪肝;胰岛素抵抗
【作者】任路平;宋光耀;章冬梅;孙文;李凡;陈树春
【作者单位】河北省人民医院内分泌一科,河北,石家庄,050051;河北省人民医院内
分泌一科,河北,石家庄,050051;河北省人民医院内分泌一科,河北,石家庄,050051;河北省人民医院内分泌一科,河北,石家庄,050051;河北省人民医院内分泌一科,河北,石家庄,050051;河北省人民医院内分泌一科,河北,石家庄,050051
【正文语种】中文
【中图分类】R333.4
近年来，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病率逐渐增加，非酒精性脂肪肝与代谢综合征关系密切［1］。

大部分非酒精性脂肪肝病患者为单纯性脂肪肝，也简称为“脂肪肝”，膳食因素如脂类过量摄入与脂肪肝的发生发展有关［2］。

随着含果糖的软饮料如可乐、果汁等的摄入量逐年增加，果糖对机体糖脂代谢的影响也引起了人们的重视。

既往研究表明慢性高果糖喂养后可诱导啮齿类动物发生肝内脂质沉积和胰岛素抵抗［3］，但是关于短期高果糖过量摄入对肝脏脂质沉积和肝胰岛素敏感性的影响研究较少。

本研究旨在通过高果糖饮食喂养小鼠3 d，观察高果糖摄入对肝脏糖脂代谢的危害，并探讨脂肪肝发生的早期机制及其与肝胰岛素抵抗的关系。

材料和方法
1 材料
1.1 动物成年雄性C57BL/J6小鼠按随机数字表随机分为对照(control)组及高果糖(HFru)组，20只/组，体重25～30 g。

对照组进食普通饲料;高果糖组果糖占总热量34.5%(高果糖饲料配方参考文献［4］，具体配方为:果糖34.5%，淀粉34.5%，脂肪9%，蛋白21%)。

两组每天进食热量基本相等，喂养3 d后行相关指标测定
并处死小鼠，留取组织。

1.2 试剂兔抗鼠乙酰辅酶A羧化酶(acetyl－CoA carboxylase，ACC)、硬脂酰辅酶 A脱饱和酶－1(stearoyl－CoA desaturase 1，SCD －1)、磷酸化蛋白激酶
B(phosphorylated protein kinase B，p－Akt)和总蛋白激酶B(total protein kinase B，t－Akt)、磷酸化糖原合成激酶－3(phosphorylated glycogen synthase kinase 3，p－GSK －3α/β)和总糖原合成激酶－3(total glycogen synthase kinase 3，t－ GSK －3α/β)抗体均由 Cell Signaling 提供(#3662、
#2438、#9271、#9272、#9331和#7291)，兔抗鼠脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)抗体由 ABCAM公司提供(ab9686)，内参照抗体pan 14－3－3
由ABCAM提供(ab12341)。

2 检测指标及方法
2.1 小鼠腹腔葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test，ipGTT)
各组小鼠喂养3 d后，随机选取6只，过夜禁食12 h，后采尾血测定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)(Roche血糖仪)，其后经腹腔注射3 g/kg葡萄糖，于注射葡萄糖后30、60、90 min分别采尾血测定全血葡萄糖。

通过0、30、60、90 min 各时点血糖值(FBG、BG30 min、BG60 min、BG90 min)计算血糖曲线
下面积(area under curve，AUC)，AUC=(FBG+BG30 min)×30/2+(BG30
min+BG60 min)×30/2+(BG60 min+BG90 min)×30/2。

以进一步反映各组小鼠葡萄糖耐量。

2.2 肝脏病理变化检查取新鲜肝组织1块(约10 mm×10 mm×2 mm)，置于10%中性甲醛液中固定，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，制成厚度为3 μm切片，行苏木素－伊红(HE)染色，中性树胶封固。

2.3 肝脏甘油三酯(triglyceride，TG)测定取肝脏组织30 mg经氯仿/甲醇抽提甘
油三酯后，加入0.6%NaCl分离水相和有机相，吸取有机相待干燥后溶于100%
乙醇500 μL，应用GPO－PAP试剂盒测定TG含量(Boehringer Mannheim)。

2.4 Western blotting方法检测蛋白表达于肝脏组织匀浆中加入10倍裂解液，13000 r/min离心15 min，BCA法测蛋白含量。

取20 μg蛋白进行10%聚丙烯
凝胶电泳，湿法电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入
1∶1000稀释的抗体，4℃摇床过夜，TTBS缓冲液洗膜后加入1∶10000稀释的
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，室温孵育1 h，最后用ECL化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。

用ImageJ软件分析，以目的蛋白
的灰度值除以内参照pan 14－3－3的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

每组随机选6例样本进行蛋白表达分析。

2.5 肝脏胰岛素敏感性评估于喂养3 d后每组随机取12只小鼠，禁食10 h过夜，每组小鼠随机选取6只小鼠注射生理盐水，另向6只小鼠腹腔内注射含有葡萄糖
3 g/kg BW、胰岛素2 U/kg的混合溶液，于注射后40 min处死小鼠，其后留取肝脏、肌肉和脂肪组织，冻存于－70℃。

应用Western blotting方法测定前述胰岛素葡萄糖混合溶液注射后40 min小鼠肝脏组织的2个重要胰岛素信号转导因子Akt和GSK－3α/β总蛋白和磷酸化蛋白的表达。

通过比较各组注射与未注射胰岛素溶液的小鼠p－Akt/t－Akt和p－GSK－3α/β/t－GSK －3α/β 表达变化评估胰岛素敏感性，比值减少代表肝细胞内胰岛素信号转导通路蛋白Akt和GSK－3α/β的磷酸化减少，提示肝脏胰岛素敏感性下降。

Western blotting检测同方法2.4。

3 统计学处理
在SPSS 11.0软件上进行数据分析。

数据用均数±标准差()表示。

组间数据进行单因素方差分析。

结果
1 喂养3 d后两组小鼠各项指标检测结果
各组小鼠实验起始体重无差异，不同饲料喂养3 d后体重均无明显增长，但高果
糖组附睾脂肪含量明显高于对照组(P＜0.01)。

高果糖组的血葡萄糖与对照组无差
异，但ipGTT实验后的血糖曲线下面积明显高于对照组(P＜0.01)，提示存在机体胰岛素抵抗。

与对照组相比，高果糖组的肝脏TG水平显著增高(P ＜0.01)，见表1。

2 肝脏病理变化
肝组织HE染色切片显示对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，脂滴少见;高果糖组小鼠肝细胞脂滴数量明显增多，部分肝细胞脂肪变性，多数肝细胞结构尚完整，见图1。

表1 两组小鼠喂养3 d后的各项指标Table parison of parameters in the 2 groups of mice after 3－day feeding(.n=20)＊＊P ＜ 0.01 vs
control.FBG:fasting blood glucose;AUC:area under curve.Group Body weight(g) Epdydimal fat(g/100 g BW) FBG(mmol/L) AUC of ipGTT TG content in liver(μmol/g)Control 26.2 ±0.6 1.2 ±0.1 6.2 ±0.1 1014 ±39 10.05 ±0.34 HFru 25.1 ±0.5 1.6 ±0.1＊＊6.3 ±0.2 1399 ±54＊＊23.42 ±3.96＊＊Figure 1.Pathological changes of liver tissues in mice after 3－day feeding(HE staining，×400).A:cont rol group;B:HFru group.图1 小鼠喂养3 d 后肝脏病理变化
3 两组肝脏脂质合成相关酶类表达情况
与对照组相比，高果糖组脂质合成相关酶类ACC、FAS和SCD－1的表达均明显增加(P＜0.01)，提示高果糖组内源性脂质合成增加，见图2。

4 两组肝脏胰岛素敏感性评估
与对照组相比，高果糖组小鼠基础状态时p－Akt/t－ Akt和 p － GSK －3α/β/t － GSK －3α/β 的比值无明显差异(P＞0.05);胰岛素注射40 min后，与对照组相比，高果糖组p－Akt/t－Akt显著减少(P＜0.01)，差异显著;与对照组相比，高果糖组的p－ GSK －3α/β/t－ GSK －3α/β 的比值亦显著减少(P＜0.01)，差异显著
(P＜0.01)，提示高果糖组小鼠的肝脏对胰岛素敏感性减低，胰岛素信号转导减弱，见图3。

讨论
肝脏是人体功能最活跃的合成和分解代谢器官之一，肝脏对糖、脂、蛋白的代谢均有直接的影响。

本研究证明了3 d高果糖喂养即可引起小鼠肝脏脂质沉积，表现
为甘油三酯含量增高和肝细胞内脂滴形成，说明肝脏对饮食因素具有非常迅速的反应，也证实了果糖对肝脏和机体代谢的危害［5］。

Figure 2.Protein expression of lipogenic enzymes in mouse livers in the 2 groups.A:ACC;B:FAS;C:SCD － 1.＊＊ P ＜0.01 vs control.图2 两组小鼠肝脏脂代谢相关酶类蛋白表达的变化
果糖为己糖单糖，为葡萄糖的同分异构体。

自然界中果糖以游离状态大量存在于水果的浆汁和蜂蜜中;加工食品如软饮料、糖果、面包等中的蔗糖与高果糖玉米糖浆(high－fructose corn syrup，HFCS)含有多量果糖。

自上世纪70年代HFCS引
入食品加工业，果糖的人群摄入量也相应增加［6］。

既往研究发现慢性高果糖喂养刺激肝脏脂质从头合成而诱导脂肪肝的发生［7］。

通过本研究表明，果糖过量摄入对肝脏脂质代谢有直接而迅速的影响，可在3 d之内就引起肝脏的脂质沉积。

肝脏脂质从头合成关键酶为ACC、FAS和SCD－1，本研究发现3 d果糖过量摄
入后肝脏FAS、ACC、SCD－1的表达即明显增加，使脂肪酸从头合成途径增强，提示与长期高果糖喂养相同，脂质从头合成增强是短期高果糖饮食引起脂肪肝的重要机制之一。

Figure 3.The change in phosphorylation of Akt and GSK －3α/β in mouse livers after insulin stimulation.＊＊P ＜0.01 vs control+Ins.图3 两组小鼠胰岛素刺激后肝脏Akt和GSK－3α/β的磷酸化变化
同时，高果糖喂养3 d后的小鼠糖耐量试验表明机体的糖耐量已经下降，同时伴
有小鼠附睾脂肪增多。

本研究进一步评价了小鼠肝脏的胰岛素敏感性。

已知磷脂酰激醇－3激酶(PI－3K)－PKB(亦称Akt)途径是将胰岛素作用向肝细胞内转导的主要信号途径之一。

胰岛素受体底物Akt是胰岛素信号转导途径中位于PI－3K下游重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，GSK －3α/β 是 Akt的直接底物［8］。

因此，本研究选用Akt和GSK－3α/β作为评价小鼠肝脏胰岛素敏感性的指标，经胰岛素注射40 min后，与对照组相比，高果糖喂养小鼠的肝脏胰岛素信号通路下游因子Akt 和GSK－3α/β的磷酸化蛋白表达均显著降低，表明高果糖喂养小鼠的肝脏胰岛素敏感性均下降，出现了肝脏胰岛素抵抗。

以上对整体糖耐量和肝脏胰岛素敏感性的评估结果表明，短期过量的果糖摄入对小鼠肝脏脂代谢和肝胰岛素敏感性均有不利的影响。

另外，3 d高果糖喂养诱导小鼠肝脏同时出现甘油三酯沉积和肝脏胰岛素抵抗，提示脂肪肝和肝胰岛素抵抗密切相关，为并行出现机体代谢障碍的表现;然而，本研究结果尚不能确定肝脏胰岛素抵抗和脂肪肝发生发展的先后关系和因果关系，二者的关系还需进一步深入研究。

综上所述，本研究提示短期高果糖饮食通过刺激内源性肝脏脂质合成引起脂肪肝和肝脏胰岛素抵抗，并伴有小鼠机体糖耐量减低，揭示了高果糖饮食对肝脏及全身代谢的危害与脂肪肝和胰岛素抵抗有密切联系。

［参考文献］
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