一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510691100.8
(22)申请日 2015.10.22
G01N 33/543(2006.01)
(71)申请人中国农业科学院兰州兽医研究所
地址730046 甘肃省兰州市城关区盐场堡徐
家坪1号
(72)发明人卢曾军 付元芳 曹轶梅 孙普
白兴文 李平花 包慧芳 李冬
陈应理 刘在新
(74)专利代理机构北京方圆嘉禾知识产权代理
有限公司 11385
代理人董芙蓉
(54)发明名称
一种ELISA 试剂盒抗原间接包被酶标板的包
被方法
(57)摘要
一种ELISA 试剂盒抗原间接包被酶标板的包
被方法，包括以下步骤：(1)包被；(2)封闭：采用
10g/L 鱼明胶的0.01mol/LPBS 缓冲液封闭；(3)
捕获目标抗原；(4)加含5％蔗糖和1～5％牛血
清白蛋白的0.01mol/L，pH7.2～7.6磷酸盐缓冲
液的固相抗原稳定剂，抽干，即得抗原间接包被酶
标板。

本发明包被得到的酶标板保存期可达1年
以上，显著提高了抗原间接包被ELISA 试剂盒的
稳定性与保存期。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页CN 105388282 A 2016.03.09
C N 105388282
A
1.一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法，其特征在于，
(1)包被：用0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释单克隆抗体或多克隆抗体至工作浓度1～2μg/mL，加入酶标板，每孔加95～105μL，室温下包被过夜，然后用PBS洗3次；
(2)封闭：每孔加含10g/L鱼明胶的0.01mol/L PBS缓冲液95～105μL，35～38℃封闭1～2h，然后用PBS洗涤3次；
(3)捕获目标抗原：用0.01mol/L PBS缓冲液稀释目标抗原至工作浓度0.5～1.5μg/ mL，每孔95～105μL加入酶标板，18～25℃捕获反应1～1.5h，然后用PBS洗涤3次；
(4)加固相抗原稳定剂：在酶标板孔湿润的状况下，每孔加入120～150μL固相抗原稳定剂，室温作用20～40min，弃残液；酶标板置于室温、湿度20％～30％的洁净空间，抽湿机抽干10～12小时，即得抗原间接包被酶标板；其中，所述固相抗原稳定剂为含5％蔗糖和1～5％牛血清白蛋白的0.01mol/L，pH 7.2～7.6磷酸盐缓冲液。

2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法，其特征在于，步骤(1)中，所述单克隆抗体为口蹄疫病毒3A单克隆抗体，工作浓度为2μg/mL；所述多克隆抗体为口蹄疫病毒2C多克隆抗体，工作浓度为1μg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法，其特征在于，步骤(4)中，所述固相抗原稳定剂为含5％蔗糖和1％牛血清白蛋白的0.01mol/L，pH 7.5的磷酸盐缓冲液，加入0.1％硫柳汞防腐剂，37℃放置4周制成。

一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种酶标板的包被方法，具体涉及一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法。

背景技术
[0002] 抗原间接包被是指首先用某抗原的特异性抗体(单抗或多抗)包被酶标板，然后再通过抗原抗体的特异性结合，捕获目标抗原于酶标板上，用于组装ELISA试剂盒。

抗原间接包被制备酶标板的好处在于：一是有助于促进基因工程方法表达的目标抗原蛋白形成其自然构象，通过抗原抗体的特异性亲合反应，进一步纯化了包被抗原，经过洗涤过程使蛋白结构更接近自然构象，从而提高诊断方法的敏感性与特异性；二是经过半纯化和复性的目标抗原蛋白就可以满足要求。

[0003] 目前，国产ELISA试剂盒质量不稳定，主要原因在于直接或间接抗原包被酶标板的稳定性差，导致ELISA试剂盒保存期短；并且市场上的抗原稳定剂，不仅价格昂贵，而且来源不稳定，严重影响了我国ELISA类诊断试剂盒的研制。

因此，抗原包被酶标板的包被工艺是保证ELISA试剂盒质量的关键。

发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种稳定性好，保存期长、成本低的ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法。

[0005] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法，包括以下步骤：
[0006] (1)包被：用0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释单克隆抗体或多克隆抗体至工作浓度1～2μg/mL，加入酶标板，每孔加95～105μL，室温下(18～25℃)包被过夜，然后用PBS洗3次；
[0007] (2)封闭：每孔加含10g/L鱼明胶的0.01mol/L PBS缓冲液95～105μL，35～38℃封闭1～2h，然后用PBS洗涤3次；
[0008] (3)捕获目标抗原：用0.01mol/L PBS缓冲液稀释目标抗原至工作浓度0.5～1.5μg/mL，每孔95～105μL加入酶标板，18～25℃捕获反应1～1.5h，然后用PBS洗涤3次；
[0009] (4)加固相抗原稳定剂：在酶标板孔湿润的状况下，每孔加入120～150μL固相抗原稳定剂，室温作用20～40min，弃残液；酶标板置于室温、湿度20％～30％的洁净空间，抽湿机抽干10～12小时，即得抗原间接包被酶标板；其中，所述固相抗原稳定剂为含5％蔗糖和1～5％牛血清白蛋白的0.01mol/L，pH 7.0～7.6磷酸盐缓冲液。

[0010] 进一步，步骤(1)中，所述单克隆抗体为口蹄疫病毒3A单克隆抗体，工作浓度为2μg/mL；所述多克隆抗体为口蹄疫病毒2C多克隆抗体，工作浓度为1μg/mL。

[0011] 进一步，步骤(4)中，所述固相抗原稳定剂为含5％蔗糖和1％牛血清白蛋白的
0.01mol/L，pH 7.5的磷酸盐缓冲液，加入0.1％硫柳汞防腐剂，37℃放置4周制成。

[0012] 本发明之ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法可使间接抗原包被酶标板的保存期达到1年以上，显著提高了ELISA试剂盒的稳定性与保存期；而且所用抗原稳定剂的配方简单，对抗原抗体反应没有干扰，材料易于获得、来源不受限制，适用范围广。

具体实施方式
[0013] 下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

[0014] 1、材料与方法
[0015] (1)材料：碳酸盐缓冲液(Na2CO3/NaHCO3)及明胶购自SIGMA公司；口蹄疫病毒非结构蛋白3A与3B单克隆抗体为本实验室制备保存采用常规方法制备；辣根过氧化物酶(HRP)标记3B单克隆抗体委托南京金斯瑞公司标记，滴定工作浓度为1∶5000；口蹄疫病毒非结构蛋白2C表位区多克隆抗体由本实验室采用常规方法制备，采用表达的2C表位区蛋白免疫家兔制备；口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC参考以下文献表达：曹轶梅,刘在新,卢曾军,等.口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的表达[J].畜牧兽医学报,2004,35(1):115-118；口蹄疫病毒非结构蛋白2C3AB表达参考以下文献进行：张小丽,田美娜,卢曾军,等.FMDV非结构蛋白2C主要表位区与3AB基因的组合表达与活性分析.生物工程学报,2009,25(1):10-15[J]。

[0016] (2)非结构蛋白3ABC与2C3AB融合蛋白的表达、纯化及复性参考以下文献进行：[0017] 曹轶梅,刘在新,卢曾军,等.口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的表达[J].畜牧兽医学报,2004,35(1):115-118。

[0018] 曹轶梅,卢曾军,刘在新,等.大肠埃希氏菌表达FMDV 3ABC非结构蛋白的纯化复性与活性检测[J].中国兽医科技,2003,33(8):22-25。

[0019] (3)非结构蛋白3B单克隆抗体的制备与鉴定参考以下文献进行：
[0020] 李永亮,田美娜,卢曾军,等.口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备和鉴定[J].江苏农业学报,2009,25(2):296-300。

[0021] 实施例1：口蹄疫病毒3A单克隆抗体包被捕获3ABC酶标板的包被方法
[0022] (1)包被：用包被缓冲液(0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液)稀释3A单抗至工作浓度为1：10000，加入酶标板，每孔加100μL，4℃过夜，用PBS洗涤5次。

[0023] (2)封闭：每孔加封闭液(含1％鱼明胶的PBS溶液)100μL，37℃封闭1h，用PBST 洗涤3次。

[0024] (3)捕获3ABC蛋白：用0.01mol/L PBS缓冲液稀释3ABC蛋白至工作浓度为1μg/ mL，每孔100μL加入酶标板，37℃反应1h，PBS洗涤3次。

[0025] (4)加固相抗原稳定剂：配制含不同浓度蔗糖(50g/L与100g/L)和不同浓度牛血清白蛋白(10、30、50与100g/L)的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，检测其保护间接包被抗原稳定性的效果。

每孔加入120μL，室温作用30min，弃残液；酶标板置室温、湿度20％～30％的洁净空间，抽湿机抽干约12小时。

将彻底干燥的酶标板置透明塑封袋中，加干燥剂抽真空密封保存。

[0026] (5)加待测血清：用含1％BSA的PBST稀释NSP抗体强阳性、弱阳性与阴性对照血清(1∶5稀释)，每孔100μL加入酶标板，室温反应16～20小时，PBST洗涤5遍，拍干。

[0027] (6)加酶标3B单抗：用血清稀释液将酶标3B单抗稀释至最适工作浓度，每孔100μL加入酶标板，室温反应1h，PBST洗涤5遍，拍干。

[0028] (7)加底物显色：每孔100μL加入TMB底物溶液，37℃避光反应10～15min。

[0029] (8)终止：每孔加入0.3mol/L H2SO4使反应终止。

[0030] 测定OD值：用酶标仪测定450nm波长OD值。

[0031] 计算阳性对照与弱阳性对照样品对3B单抗结合抗原的阻断率PI，PI＝(1-阳性对照OD450/阴性对照OD450)×100％。

[0032] 实施例2：口蹄疫病毒2C多克隆抗体包被捕获2C3AB酶标板的包被方法[0033] 与实施例1的区别仅仅在于利用口蹄疫病毒2C表位区多抗包被酶标板(1∶20000)，捕获非结构蛋白2C3AB(1μg/mL)，其他反应条件与试剂实施例1。

[0034] 实施例3：抗原间接包被酶标板的稳定性与保存期的测定
[0035] 1、抗原间接包被酶标板保存期测定
[0036] 将酶标板分别置于4℃和37℃，每周1次对比检测NSP抗体阳性、弱阳性与阴性对照血清，连续检测6周。

如果37℃放置4周，酶标板检测值没有明显变化，则酶标板4℃的保存期可达1年。

[0037] 2、抗原间接包被酶标板稳定性评价
[0038] 阴性对照血清没有NSP抗体，不会与间接包被的抗原结合，加入HRP标记单抗或多抗后，OD450值达最高；弱阳性对照与阳性对照血清含有不同量的NSP抗体，与包被抗原结合，阻断3B单抗的结合，OD450值降低；因此，通过计算阳性与弱阳性对照血清的阻断率，以及阴性对照的OD450值，可以反映出包被抗原的稳定性与检测敏感性，如果阻断率与阴性对照OD450值没有显著变化，则可以认为间接包被抗原活性稳定，检测性能没有变化。

[0039] 3、不同抗原稳定剂处理抗原间接包被酶标板的检测效果
[0040] 将含5％蔗糖、1％BSA+5％蔗糖、3％BSA+5％蔗糖、5％BSA+5％蔗糖与10％BSA+5％蔗糖的PBS缓冲液，均加入0.1/100浓度的硫柳汞防腐剂，37℃放置4周，得到不同抗原稳定液，分别处理3ABC抗原间接包被酶标板后用阻断ELISA检测NSP抗体阳性、弱阳性与阴性对照血清的阻断率值，结果见表1所示。

[0041] 表1-不同抗原稳定液处理酶标板检测阳性、弱阳性对照血清PI值
[0042]
[0043] 由表1可知，只加入含5％蔗糖的PBS缓冲液作为抗原稳定液时，在酶标板吹干过程中抗原损失量大，从而导致信号强度下降；而加入含有蔗糖和BSA的PBS缓冲液作为抗原稳定液时，抗原活性提高，检测信号增强；但是随着BSA浓度的升高，对弱阳性血清检测的敏感性下降，说明BSA量过高时对抗原与抗体的结合有阻碍作用，影响检测敏感性，同时BSA用量增加，生产成本随之也增加。

因此，固相抗原稳定液的最佳配方为含5％蔗糖、1％BSA与适量防腐剂的PBS缓冲液。

[0044] 表2-含5％蔗糖与1％BSA的抗原稳定剂处理酶标板的稳定性检测结果[0045]
[0046] 由表2可知，用含5％蔗糖与1％BSA的抗原稳定剂处理3ABC抗原间接包被酶标板，37℃保存49天后，尽管阴性对照OD450值下降24.6％，但检测弱阳性对照的敏感性没有下降，说明抗原量略有下降，对检测的敏感性没有明显的影响，仍然能够保证检测敏感性的要求。

按照37℃保存4周，相当于4℃保存一年的有效期计算，采用本发明的包被方法，能够保证抗原间接包被酶标板至少一年的保存期。