软骨细胞培养

(1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。

(2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节（保留周围肌肉，软骨不能暴露），75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软骨组织，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软骨组织被风干。

(3)PBS缓冲液充分漂洗软骨小块3次，然后用小剪刀将软骨块切碎至约lmm3大小。

(4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软骨块置入放有0.2%的Ⅱ型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37℃恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞（沉淀物），加入含10%的胎牛血清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软骨细胞混悬液。

(5)把消化所得的软骨细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2×105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于CO2培养箱内。培养条件为37℃、5%CO2。

(6)未消化完的软骨小块继续用Ⅱ型胶原酶如上法消化，直至软骨块基本消失。

(7)每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照保存。

药物制备

龟甲胶、鹿角胶各10克，氨基葡萄糖1.5克，分别加PBS缓冲液30ml配成

10g/30ml、10g/30ml和1.5g/30ml的溶液。然后分别取上述溶液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml放于不同的15ml离心管中，加PBS定容至10ml，各配成6管分别为2.5%、5%、10%、20%、30%、40%含药的PBS，放4℃冰箱备用。药物组：将上述6管含药PBS分别各取1ml放于不同的15ml离心管中，加含10%胎牛血清的DMEM培养液定容至10ml，分别配成10%含药的胎牛血清DMEM培养液（避免胎牛血清的干扰），做好标记，放4℃冰箱备用。另外取1ml PBS缓冲液加到9ml含10%胎牛血清的DMEM培养液中，配成10ml 10%PBS的含胎牛血清的DMEM培养液作为空白对照组，放4℃冰箱备用。

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。（二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。

人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析

人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 The final edition was revised on December 14th, 2020.

西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析学院：生命科学学院专业：生物科学年级班级：2010级5班校区编码：北区姓名：陈建坤二零一二年十二月四日人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科

软骨细胞培养

软骨细胞培养 (1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。 (2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节（保留周围肌肉，软骨不能暴露），75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软骨组织，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软骨组织被风干。 (3)PBS缓冲液充分漂洗软骨小块3次，然后用小剪刀将软骨块切碎至约lmm3大小。 (4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软骨块置入放有0.2%的Ⅱ型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37℃恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞（沉淀物），加入含10%的胎牛血清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软骨细胞混悬液。 (5)把消化所得的软骨细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2×105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于CO2培养箱内。培养条件为37℃、5%CO2。 (6)未消化完的软骨小块继续用Ⅱ型胶原酶如上法消化，直至软骨块基本消失。 (7)每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照保存。药物制备龟甲胶、鹿角胶各10克，氨基葡萄糖1.5克，分别加PBS缓冲液30ml配成 10g/30ml、10g/30ml和1.5g/30ml的溶液。然后分别取上述溶液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml放于不同的15ml离心管中，加PBS定容至10ml，各配成6管分别为2.5%、5%、10%、20%、30%、40%含药的PBS，放4℃冰箱备用。药物组：将上述6管含药PBS分别各取1ml放于不同的15ml离心管中，加含10%胎牛血清的DMEM培养液定容至10ml，分别配成10%含药的胎牛血清DMEM培养液（避免胎牛血清的干扰），做好标记，放4℃冰箱备用。另外取1ml PBS缓冲液加到9ml含10%胎牛血清的DMEM培养液中，配成10ml 10%PBS的含胎牛血清的DMEM培养液作为空白对照组，放4℃冰箱备用。

细胞传代培养

细胞传代培养（胰蛋白酶消化法）具体操作：一. 传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。二.胰蛋白酶消化； 1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。三.吹打分散细胞： 1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。四.分装稀释细胞： 1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。五.继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。传代细胞培养注意事项： 1.严格的无菌操作 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析完整版

人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

细胞培养基种类

细胞培养基的选择及常用数据库日期：2012-04-13来源：未知作者：网友点击：次细胞实验技术经典的培养基有很多种，Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。 ◆MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的，其中增加了组分的范围及浓度。 ◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。 ◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸，它可广泛应用于各种细胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。 ◆ Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。 ◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞的培养。以前经常听到有人问，这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单，也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库，那很简单，问供应商就行了。或者找到相关的文献，作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，也很好用。选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert，包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等，它还

软骨细胞培养及其调控(一)

软骨细胞培养及其调控(一) 关键词：软骨细胞自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来〔1〕，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨〔2〕。虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。 1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下： 1.1转化生长因子beta(TGF-β) TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。TGF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力〔3〕。F.Redni等实验证明培养兔关节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了低亲和力受体表型(kd=appiox1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此，TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过不同的途径〔4〕。也有学者证明TGF-βs 在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L 浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶活性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成〔5〕。同时也有实验证明TGF-β可抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分化调控生长因子参与对细胞的调节作用〔6〕。TGF-β在细胞对其它各种分化信号的应答过程中同样也有调节作用。Wen-NingQi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF-β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ

MRI对膝关节软骨损伤的诊断

MRI对膝关节软骨损伤的诊断一、介绍关节软骨属于透明软骨，表面光滑，呈淡蓝色，有光泽，厚度约1-5mm。关节镜检查只能看到形态，MRI是目前唯一日常性成像方式，已经发展成检查关节软骨主要的主要技术。二、关节软骨的组织结构关节软骨属于透明软骨，关节软骨根据细胞胶原介质分四层结构第一层是浅表层，也称为切线层。胶原纤维排列方向与关节面相互平行；第二层是附着层；胶原纤维成斜线排列；第三层是辐射层；胶原纤维排列方向与关节面相互垂直；第四层是钙化层；与骨性关节面紧密结合在一起。在辐射层和钙化层之间有一条线，称之为潮线，是关节软骨成熟的标志。三、MRI对关节软骨的成像技术MRI对关节软骨的成像技术分为形态学成像技术和分子影像学成像技术。分子影像学成像技术涉及关节软骨的组织成分。分为软骨细胞、细胞外基质（包括电解液、5%蛋白多糖、20%胶原纤维等）。分子影像学从分子角度检测钠离子浓度变化、蛋白多糖变化以及蛋白多糖中糖原多糖变化情况，然后通过分子结构的改变来重建图像。从组织学上说，软骨损伤的因素包括外伤、配电以及其他非理化性因素等。软骨的损伤包括浅层、附着层、辐射层甚至钙化层的损伤。关节软骨无神经血管乃至淋巴，因此关节软骨受到创伤很难愈合。软骨损伤不是单一的疾病，还涉及邻近组织一些静态的改变，如韧带的损伤、组织下变化以及骨性关节炎的变化等。最终导致患者的功能障碍。核磁有很强的空间和密度

分辨率，能够早期探测出软骨的变化，进而做出适当的处理。因此核磁在软骨的探测方面，具有独到的优势。（一）形态学成像技术形态学成像技术，也是临床上常用的检测技术，可以清楚的显示关节软骨形态、大小以及厚度。能够提供准确的信息，对关节软骨的分度如局限性缺损、全层的缺损以及关节软骨修复术当中也起着很重要的作用。关节软骨从形态学上分类：0级：正常关节软骨。如右图A 1级：形态正常，信号略有增高。如右图 B 2级：关节软骨表层缺损，但未及关节软骨厚度的50%。如右图C 3级：关节软骨表层缺损，超过关节软骨厚度的50%但未达到100%。如右图D 4级：全层关节软骨的缺损。其中4级分为 1 累及关节软骨下骨质的缺损(如上图F)和未关节软骨下骨质(如上图E)两类形态学成像技术临床上常用的有T1WI、T2WI以及T2WI-fs。如上图。它们显示骨性结构，关节软骨和关节腔积液方面都具有各自的优势。 T1WI显示解剖细节有图特的优势。 T1WI下可以看见解剖结构序列、关节软骨以及软骨下的骨质、骨小梁以及骨髓分层的对比度都能很好地显示。因为关节积液在TI加权图像上显示低信号，关节软骨显示中等信号，低信号的关节积液和中等信号的关节软骨之间缺乏明显的对比，因此TI加权像对软骨表层浅层缺损的显示不敏感。但因为T1WI关节软骨和关节软骨下骨质对比明显，则T1WI显示关节软骨深层缺损比较敏感。 T2WI以及亚真像对关节积液和游离水的信号非常

人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理

实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料人的外周血淋巴细胞

软骨细胞培养

实验方法各种溶液的配制 1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9 （1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g （2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。（3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。（4）将酚红液（３）加入（２）中。（5）补加水至1000ml，混匀。（6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。 2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml （1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。（3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。（4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。（5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。 3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml （1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。（2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。（3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。（4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。 4、配制闪烁液（1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。（2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。取材与培养（1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。（2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。（4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。（5）用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。（6）过120目纱目，去除上清液。（7）用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X104。（8）将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ）适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间，胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

细胞培养板的选择和使用

细胞培养板的选择和使用（四）点击次数：1678 作者：clearair00 发表于：2008-07-23 10:32转载请注明来自丁香园来源：丁香园（一）培养板的清洗和消毒培养板一般为一次性使用，尤其在接触了有毒、有害等物质后更应该处理后丢弃。但如果要反复使用则一定要进行正确的清洗和消毒，以保证细胞培养的效果。问：只有紫外照射可以保证无菌吗?可不可以从清洗方面做点工作? 答：看你什么用途了，一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。我们一般是先泡酸过夜，清洗干净，三蒸水清洗，再用无水酒精浸泡清洗，再在工作台里用无菌水过一遍，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，打开在超净工作台里近紫外（距离紫外灯<２０ｃｍ）照射半个小时以上，效果很好，没有污染过。其实不管老板有钱没钱，我们做实验室尤其是预实验或是摸条件时，我们一般都能省就省了，留点钱还不如买点好试剂呢：）我们一般是先清洗干净，泡酸过夜，三蒸水清洗，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，有两种选择：1、在超净台里近紫外灯（距离紫外灯<3０ｃｍ）照射半个小时以上，六孔板一般半个小时，24孔板一个小时，96孔板时间更长，效果很好，没有污染过；2、到放射科照Co60，照完了尽快用。我们这里肿瘤细胞耐性很好，所以重复利用没什么问题，如果原代培养比较娇贵的细胞最好用新板

子，也不是很贵。我们的经验是:清洗后用消毒液浸泡，泡酸过夜，自来水反复冲洗，双蒸水冲洗三遍，无尘环境晾干，用之前紫外灯照射半小时以上，效果很好。我们现在的穷同仁一直在应用。永久了也会变黄，因此如果做mtt或比色时是不能用的，在不熟悉细胞培养的时候可以先学学细胞记数，熟练了用新的，不过肿瘤细胞可以在旧板子上长得很好哟，原代的细胞比较难养，塑料的较好。紫外的穿透能力很弱，板子紫外照射时是否将盖子翻过来一起照射那？还有，细胞瓶紫外效果如何？板子泡酸后和瓶子一样的清洗方法清洗后，60度烤干，然后放在工作台里（打开盖子）用紫外线照射半小时以上，最好一小时或两小时，盖子同时反过来照。瓶子照射没有效果，要用其他方法同意楼上大家的意见。96孔和24孔板子在做完了后要先泡清洗计，在用棉花搽洗每个孔，这样有些贴壁细胞才不会有细胞碎片的残留，在做mtt是很重要，要不很不准的。后面就是冲洗，泡酸，3蒸水洗，紫外照射30－60分钟，不要时间太长，这样板子容易变色！但是如果是做MTT还是建议用新板子！旧板子做，结果不准！泡酸时不要用刚配好的浓酸，因为那样会把培养板表面促进细胞贴附的一层膜腐蚀掉，细胞就无法贴壁了。用酸泡完后用自来水清洗，再用蒸馏水清洗3－5次，然后泡在75％的酒精里（酒精用纯的无水乙醇），用前在紫外线下照射1h。基本可保证95％以上无菌，用这些板做做预实验是没问题的。 1.钴60照射适合大量的板同时灭菌，最好攒一箱，再送去灭菌。 2.紫外消毒适合少量的培养皿或培养板，比如培养板，将盖打开，翻过来，连同板一起在紫外下照射2小时即可，事先不用酒精泡。 (二)方法讨论

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

体外细胞培养

第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术体外细胞培养的优缺点优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。一、体外细胞培养条件（一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室（二）、体外培养的设备和器具设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器，超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器，针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿（4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网（三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等

软骨细胞培养及其调控

关键词：软骨细胞自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。1 细胞因子对体外培养软骨细胞的影响软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL- 1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下：1.1 转化生长因子beta(TGF-β) TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。T GF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。F.Redni等实验证明培养兔关节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了低亲和力受体表型(kd=appiox 1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此， TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1 期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过不同的途径［ 4］。也有学者证明TGF-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶活性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明TGF-β可抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分化调控生? ?］。TGF-β在细胞对其它各种分化信号的应答过程中同样也有调节作用。Wen-Ning Qi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF- β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ型胶原在TGF-β存在的条件下调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖性(量效关系)。因此Ⅱ型胶原基因表达的变化在 TGF存在条件下受Ⅱ型胶原的调控［7，8］。[!--empirenews.page--] 体外实验证明，许多细胞因子对软骨细胞有协同或拮抗作用如TGF-βs、IGFs、FGF、BMP、 IL-1等，兔关节软骨细胞体外培养时，TGF-β对IGF的分泌作用有三种，(1)减少41KD的IG FBP；(2)增加IGF受体的结合位点； (3)下调了诱导型IGF-1受体的自身磷酸化［9］，从而促进软骨细胞的增殖和特异性基质的合成。也有学者认为TGF-β和IGF可以使反分化的软骨细胞再分化诱导和持久表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖［10］。软骨细胞在传代培养中表型的变化可能与软骨细胞自分泌IL-1有关，而TGFβ可作为一种IL-1的拮抗剂，减少了IL-1对胞外基质的分解代谢同时也下调了IL-1受体及其金属蛋白酶的表达［1 1］。TGFβ可能通过以下两种途径拮抗IL-1的作用，(1)刺激成软骨细胞中蛋白糖抑制剂的产生。(2)抑制软骨细胞蛋白酶的产生，因而对细胞外基质的

小鼠胚胎干细胞培养体系的建立

第19卷第2期江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立汪河海1　刘红林2　范必勤1　钟　卉3　丁家桐4 (1　江苏农科院牧医所,南京　210014;2　南京农业大学动物科技学院,南京　210059;3　南京铁道医学院,南京　210009;4　扬州大学农学院动物科学系　225009) 摘要通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1　材料和方法 111　动物准备选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112　溶液的配制按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113　胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α

实验七+人体外周血淋巴细胞培养

实验五人的外周血淋巴细胞培养一、实验原理外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。二、实验目的掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。三、实验材料人的外周血。四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。