软骨细胞培养

小鼠未成熟关节透明软骨细胞的培养与生物学特征研究

ｖｂｌｙｗｓｅｒｉｅｙＭＴｈｌｃｓｔｎｐｒｒＧｕ）１，ＰＫａｄｈｐｘｄｃｌｆｃｒ１ｉｉｔａｔｍｎｄｂＴ．Ｔｅｇｏｅｒｓｏｅｓ（ｌｔ一，３Ｇｎｙｏｉｉｕｉｅａｔ一ａｉｄｅｕａｔａｎｂｏ（Ｉ－）ｍＲＡａｄｐｏｉｘｒｓｏｅｅｃｅｋｄｗｔｅｌｉｅＰＲａｄＷｅｔｌｔｎｌｃｓＨＦｌ￣ｃＮｎｒｔｎｅｐｅｓｎｗｒｈｃｅｉｒａｔＣｎｓｒｂｏｅｉｈ —ｍｅｎ，ａｄｇｏｅｕ
Ｓｐｏｔｂｓａｇａｖｒａｏｐｒｔｎｐｎｎ０Ｄ０６６；Ｓａｇａｒｒｉｐｏｃｕｒｄｙｐｅｈｎｈｉｅｅｓｏａａｉｏｅｄ４Ｚ５０）ｏｓｃｏｆｈｎｈｉｉｉｚｒｅｔｐｏｔｅｊ
（５Ｚ２１）ＳａｇａＰｊｎｌｎｏｔｅｔｅｌｔ５Ｊ４６）０Ｄ２３７；ｈｎｈｉｕａｇｐａａｎｅｐｏｅＰ１０１ｉｆｌｄｐ０Ｃｒｓｏｄｎｕｏ：ＤＮｉｎｕＥｍａ：ｌｅｇＤｎｃｍｏｒｐｎｉａｔｒＥＧＬａ－，－ｉｆｎ＠Ｉ．ｏｅｇｈｆｌｄｓ
于低氧（：积百分比为２）常氧（：积百分比２％）件下培养，用四甲基偶氮唑盐（Ｔ）Ｏ体％和Ｏ体１条应ＭＴ法检测细胞活性；ＴＰＲ检测细胞葡萄糖转运体一，Ｒ —Ｃ１３及磷酸果糖激酶ｍＮＲＡ的表达；萄糖氧化酶方法葡测定细胞对葡萄糖的摄取量。结果 Ⅱ 胶原免疫组化和阿利辛蓝染色证实获得细胞为透明软骨细型胞。低氧培养环境可提升细胞的增殖能力，细胞表达低氧诱导因子；随低氧诱导因子一的表诱导１伴１达及其表达量的提高，萄糖转运体一，葡１３和磷酸果糖激酶的表达水平升高，胞对葡萄糖的摄取量细增加。结论所建立的分离、养方法可以获得高纯度的透明软骨细胞；骨细胞可通过氧感应机培软制以适应低氧环境而调整其代谢和生存状态。【键词】软骨细胞；细胞低氧；鼠关

软组织工程研究：软骨细胞的培养

型和 Ⅲ 合成基质，最终难于形成软骨组织。而生物相容性良好养过程中向成纤维细胞样转化，细胞开始表达Ｉ和生物可降解性细胞载体的应用，能为软骨细胞提供理型胶原，并逐渐丧失分泌软骨基质能力。体外培养的软想的表面支持和稳定的三维空间支架结构，以及足够的骨细胞是研究软骨分化以及细胞因子、生长因子对软骨孔隙率，供细胞在其中进行物质交换、生长代谢和分泌细胞表型促进或抑制作用的一种必要的实验模型。对于软骨基质。以三维立体培养为基础的组织工程技术在软用组织工程技术构建软骨的软骨细胞来说，研究其体外骨细胞培养方面已取得突破性进展。用软组织工程技术培养时细胞外基质的分泌情况，一方面可以了解软骨细构建软骨的重要条件之一就是获得一定数量的软骨细胞的功能状态；另一方面，任何体细胞在体外培养过程中都有一定生存期，不可能无限制地生长，对软骨细胞胞，体外培养、扩增并保持一定的功能活性。
｜ＳＳＮ１７．２５ＣＮ１１３９Ｒ６３８２２．５，ｃｏＤＥＮ：ＫＨＡＨＺＬ
节盘及耻骨联合等处；弹性软骨分布于耳廓等处。软骨
７３７１
７ｗｃ尺瑚伽
学部软织程究软细的养术＿：组Ｉ研：骨瞻培
中国组织工程研究与临床康复
劳７４誊笫４７
２１００—１０—０８出版
ＪｕｒａｉｉａｌＲｅｂｌａｉｅｉｓｅｎｏｎｌｏｆＣｌｃｈａｉｔｔＴｓｕＥｇｍｅｅｎｓａｃＯｃｏｅ．２０ＶＬ１，Ｎｏ４１ｎｉｖｎｇＲｅｅｒｈｔｂｒ８０１ｏ４．

软骨实验报告总结

摘要：本研究旨在通过体外培养软骨细胞，探讨软骨细胞的生长特性、增殖能力及其在生物医学领域的应用潜力。

通过一系列实验，我们对软骨细胞的体外培养条件、增殖状态、细胞形态及功能进行了深入研究。

以下为实验总结。

一、实验目的和要求：1. 建立软骨细胞体外培养体系，优化培养条件。

2. 观察软骨细胞的增殖状态、细胞形态变化及功能表达。

3. 探讨软骨细胞在生物医学领域的应用前景。

二、实验仪器设备：1. 培养箱2. 超净工作台3. 移液器4. 倒置显微镜5. CO2培养箱6. 电热恒温水浴锅7. 流式细胞仪8. 低温离心机9. 低温冰箱三、实验设计及调试：（一）实验内容：1. 软骨细胞分离与培养2. 软骨细胞增殖实验3. 软骨细胞形态观察4. 软骨细胞功能实验（二）实验电路：无（三）实验设计及调试步骤：1. 对实验内容和实验电路进行分析，理出完成实验的设计思路。

2. 列出程序设计所需的特殊标志位、堆栈sp、内部ram、工作寄存器等资源的分配列表，分配列表时注意考虑资源在程序执行过程可能会出现冲突的问题。

3. 画出程序设计流程图，包括主程序和各子程序流程图。

4. 根据上述内容写出实验程序。

5. 调试程序，使用模拟仿真器进行模拟实验，观察结果，修改程序，继续调试，直至实验成功。

（四）实验调试过程中所遇到的问题、解决问题的思路和方法：1. 问题：软骨细胞在培养过程中出现污染。

解决方法：加强无菌操作，提高实验室空气质量，定期更换培养箱内的空气。

2. 问题：软骨细胞增殖缓慢。

解决方法：优化培养条件，调整细胞密度，增加生长因子。

3. 问题：软骨细胞功能表达不足。

解决方法：延长培养时间，提高细胞浓度，优化培养条件。

四、实验结果与分析：1. 软骨细胞在体外培养条件下，成功分离并建立了稳定的细胞系。

2. 软骨细胞增殖实验结果显示，细胞在体外培养条件下具有较好的增殖能力。

3. 软骨细胞形态观察表明，细胞呈典型的软骨细胞形态，细胞质丰富，细胞核清晰。

软骨细胞培养及其调控(一)

软骨细胞培养及其调控(一)关键词：软骨细胞自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来〔1〕，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。

实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨〔2〕。

虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。

软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。

软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。

在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。

组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。

1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。

近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。

也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。

目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下：1.1转化生长因子beta(TGF-β)TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。

实验方法各种溶液的配制1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9（1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g（2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。

（3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。

（4）将酚红液（３）加入（２）中。

（5）补加水至1000ml，混匀。

（6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。

2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml（1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。

（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。

（3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。

（4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。

（5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。

3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml（1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。

（2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。

（3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

（4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。

4、配制闪烁液（1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。

（2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。

取材与培养（1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。

（2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。

（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。

（4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。

每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。

用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。

兔软骨细胞的分离培养及其生物学特征的检测

置显微镜下观察、绘制生长曲线、组织化学染色及逆转录一聚合酶链反应（１ＰＲ等方法了解其生物学特性。Ｒ１ｃ）＿结果分离获取细胞活性率可达９％以上，８原代细胞和第１代细胞以三角形或多角形为主，生长融合时呈卯圆形，甲苯胺蓝
染色呈阳性。第３以后细胞出现反分化现象。结论代ｆ关键词１兔；软骨细胞；培养本方法是一种方便且有效的培养法。
［中图分类号］Ｑ３９３【２．３文献标识码】Ａ［文章编号］１０—７５２０）６０７－３００２１（０８０ —５３－０
Ｉｏａｉｎ，ｕｔｒａｄｂｏｏｉａｃａａｔｒｓｉｓｏｒｂｉａｔｕａｓｌｔｏｃｌｅｕｎｉｌｇｃｌｈｒｃｅｉｔｃｆａｂｔｒｉｌｒｃｃｏｄｏｙｅｈｎｒｃｔｓＳＮＧＨｏ。ＨＥＷｅ２ＯｎＣＮｉ（．ｅａｔｎｆＭｉｏｉｌｇ，Ｚｎｉｄｃｌｏｌｇ，ｕｚｏｕｙ６０３Ｃｉａ２１ＤｐｒｍｅｔｃｂｏｏｙｕｙｉａＣｌｅＧｉｕＺｎｉ３０，ｈｎ；．ｏｒＭｅｅｈ５
ｂｏｏｉａｈｒｃｅｉｔｔｄｅ．ｅｈｄｔｕａｈｎｒｃｔｓｗｒｂａｎｄｂｎｙｔｉｅｔｎｆｍｈａｉｇｆｉｌｇｃｌｃａａｔｒｓｃｓｕｉｓＭｔｏｓＡｒｉｌｒｃｏｄｏｙｅｅｅｏｔｉｅｙｅｚｍａｃｄｇｓｏｒｉｃｉｉｏｔｅｃｒｌｅｏｔａｒｂｉ．Ｔｅｂｏｏｉａｈｒｃｅｉｔｏｈｎｒｃｔｓｗｒｎｅｔａｅｙｉｖｒｅｃｏｃｐｂｅｖｎ，ｇｗｔｕｖａｂｔｈｉｌｇｃｌｃａａｔｒｓｃｆｃｏｄｙｅｅｅｉｖｓｇｔｄｂｎｅｄｍｉｒｓｏｅｏｓｒｉｇｒｈｃｒｅｉｏｉｔｏｄｐｃｎ，ｔｌｉｉｅｂｕｓｉｉｇ，ｅｅｓｒｎｃｉｔｐｌｍｅａｅｃａｎｒａｔｎｅｉｔｇｏｕｄｎｌｅｔｎｎｒｖｒｅｔａｓｒｐｏｙｒｓｈｉｅｃｉ．ＲｅｕｔｅｖａｉｔｆｔｅｈｒｅｔｄｉａｏｓｌＴｈｉｌｙｏａｖｓｅｓｂｉｈｃｏｄｏｙｅｓ９％ｏｖｒｇ．ｒｍａｙａｄｆｔａｓｇｈｎｒｃｔｓａｃｔａｇｅｏｌ－ｎｌｎｓａｅｎｅａｈｎｒｃｔｓｗａ８ｎａｅａｅＰｉｒｎｒｓａｅｃｏｄｙｅｒｎｌｒｉｐｓｏｒｉｍｕｔａｇｅｉｈｐ，ａｄｂｃｍｅｉｅｌｔｈｐｔｔｅｇｏｉｇｃｎｕｎｅｗｔｔｏｇｈｔｒｃｒｍｉｏｔｌｉｉｅｂｕ．ｒｍａｓｇ，ｈｘｒｓｉｎｏｐｌｐｉｓａｅａｈｒｗｎｏｆｅｃｈｓｒｎｅｅｈｉｃｌｉｏｏａｔｏｕｄｎｌｅＦｏｐｓａｅ３ｔｅｅｐｅｓｏｆｔｅｙ

人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养

人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养魏钰;魏民【摘要】背景:大量针对骨关节炎细胞水平的研究仍集中在动物模型关节软骨细胞的体外培养.动物模型引发的退变效应与人骨关节炎的发生并不完全一致.如何利用人骨关节炎软骨组织构建体外细胞模型并研究其特征性蛋白变化趋势,是模拟体内骨关节炎软骨退变过程的关键.目的:探讨人骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养方法,观察原代至第3代人骨关节软骨细胞的形态学特性和相关蛋白表达变化.方法:取6例因重度骨关节炎行关节置换术患者的废弃软骨组织(获得中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准,伦理批号为S2017-23-7),男2例,女4例;年龄62-72岁,平均(68.3±3.39)岁,采用一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)分离培养人骨关节炎软骨细胞,并进行传代培养,从而构建体外人骨关节炎软骨细胞培养体系.倒置相差显微镜观察各代细胞形态;苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色方法进行细胞鉴定.采用Western blot法检测各代软骨细胞于70％融合率时Col2a、Aggrecan与MMP-13的表达.结果与结论:经过Ⅱ型胶原酶消化后,培养1周左右可见组织块周围爬出散在的细胞,3周左右可传代进行下一步研究;形态学、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫荧光染色证明培养出的细胞为人软骨细胞.第3代软骨细胞Col2a、Aggrecan的相对表达量与原代比较有明显降低(P<0.01),且随着培养代数增加表达逐渐降低;MMP-13随着培养代数的增加表达逐渐增强(P<0.01).结果表明,Ⅱ型胶原酶一步消化法可成功从标本中分离出骨关节炎软骨细胞并传代培养.体外培养的骨关节炎软骨细胞去分化特性随着传代次数增加而逐渐增强,功能性蛋白表达整体下降.3代以内的软骨细胞符合人骨关节炎时软骨退变的表现,可能是用于实验研究的最佳选择.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2019(023)025【总页数】6页(P4056-4061)【关键词】骨关节炎;关节置换;人软骨细胞;一步酶消化法;Ⅱ型胶原酶;Ⅱ型胶原;聚集蛋白聚糖;国家自然科学基金【作者】魏钰;魏民【作者单位】中国人民解放军总医院,北京市 100000;中国人民解放军总医院,北京市 100000【正文语种】中文【中图分类】R459.9;R394.20 引言 Introduction骨关节炎是最常见的老年退行性关节疾病，以软骨磨损和骨质增生为主要特征[1]。

软骨细胞体外培养及鉴定

括：Ｉ、、Ⅺ型胶原、蛋白聚糖、软骨连接蛋白和基质蛋Ｉ Ⅸ
白，以及在不同生长阶段所表达的蛋白，其中儿型胶原和蛋白聚糖是评价软骨细胞功能的主要指标。
２软骨细胞的来源
体外软骨细胞培养可取材于成熟软骨组织，可由间充也
骨髓分造血和基质两大系统，骨髓基质含有能分化为成
骨细胞、骨细胞、软脂肪细胞及肌细胞的前体细胞群，称为骨髓基质细胞（ａｏｒｍａｃｌＭＳＳ）ｍｒｗｓｏｌｅ，Ｃ或骨髓间充质ｒｔｌ
干细胞（ｓｎｈｍａｅｃｌＭＳ）ｍｅｅｃｙｌｔｍｌｓｅ，ＣＳ。ＭＳｓ一种多潜Ｃ是能成体干细胞，主要存脂肪干细胞、血管内皮细胞、胚胎干细
３３
文章编号：ｗｇ２１１－２４ｓｋ０］ — ２０２
软骨细胞体外培养及鉴定
王勇平蒋壶
软骨组织（ａｔａｅ由软骨细胞（ｈｎｒｃｔ）和细ｃｒｌｇ）ｉｃｏｄｏｙｅ胞外基质（ｘｒｃｌｌｔｘＣ）成，软骨细胞是软ｅｔｅｌａｍａｒ，ＥＭ构ａｕｒｉ骨组织中唯一的细胞成分，是软骨破坏过程中的靶细胞，因此软骨细胞的体外培养是研究关节软骨生理及病理的常用体外实验模型 …。软骨组织内无血管，软骨细胞所需营养由软
２１０２年
－
０８月
第９卷第４期

大鼠软骨细胞与兔软骨细胞的培养与比较

作者单位：湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院麻醉科，湖北襄阳441000通信作者：罗辉宇，E⁃mail：****************·实验研究论著·大鼠软骨细胞与兔软骨细胞的培养与比较张振罗辉宇曾炼【摘要】目的体外分离培养大鼠及兔膝关节软骨细胞，观察并比较两种软骨细胞的培养特点。

方法采用机械-酶消化法处理SD大鼠幼鼠和新西兰兔的软骨组织，传代培养，倒置显微镜观察细胞形态，细胞计数法测定生长曲线，实时定量PCR测定不同代数的软骨细胞Ⅱ型胶原与含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs5,ADAMTS5）表达水平，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色对细胞进行鉴定。

结果原代培养大鼠软骨细胞12h，内贴壁成多角形或不规则型，排列成“铺路石”状，培养3~5d后进入快速增殖期，1周后进行细胞传代培养。

兔软骨细胞相对贴壁缓慢，生长滞后。

两类软骨细胞随着培养代数的增加，Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达量逐渐减少，ADAMTS5的表达逐代升高，表明随着培养代数的增加，软骨细胞活力逐渐下降。

相同代数的大鼠软骨细胞活性较兔软骨细胞更高。

甲苯胺蓝染色可见大鼠软骨细胞内成蓝色异染的糖胺多糖成分。

不同波段的荧光激发下，Ⅱ型胶原酶免疫荧光染色可见大鼠原代培养的软骨细胞胞浆和胞膜呈清晰的绿色荧光，兔软骨细胞呈红色荧光，细胞核为明亮的蓝色荧光。

结论本实验通过比较大鼠及新西兰兔软骨细胞的培养与特点，证实随培养代数增加，软骨细胞活性逐渐降低，且相同代数大鼠软骨细胞较兔软骨细胞具备更高活性。

【关键词】关节软骨；软骨细胞；细胞分离培养Culture and comparison of rat and rabbit chondrocytes.ZHANG Zhen,LUO Hui⁃yu,ZENG Lian. Department of Anesthesiology,Xiangyang First People s Hospital,Hubei Medical University,Xiangyang441100, ChinaCorresponding author:LUO Hui⁃yu,E⁃mail:****************【Abstract】Objective To isolate and culture rat and rabbit knee chondrocytes in vitro,observe and compare the culture characteristics of the chondrocytes in rats and rabbits.Methods Chondrocytes were obtained by the mechanical separation combined with typeⅡcollagenase enzymatic digestion from the cartilage of young SD rats and New Zealand white rabbits,and subcultured.The cell morphology was observed by an inverted microscope,growth curve was measured by cell counting,the expression levels of collagenⅡand a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs5(ADAMTS5)in different generations of chondrocytes were detected by real⁃time PCR,and the cells were identified by toluidine blue staining and type Ⅱcollagenase immunofluorescence staining.Results Primary cultured rat chondrocytes were presented with polygonal or irregular shape after12h,and arranged as“paving stones”.After culture for3⁃5d,chondrocytes entered a period of rapid proliferation and cell subculture was carried out after1week.The chondrocytes of rabbits were adhered and grew slower than the rat chondrocytes.By comparing the expression of CollagenⅡand ADAMTS5in two types of different generation chondrocytes,it was found that the expression of CollagenⅡin both chondrocytes decreased from generation to generation and that of ADAMTS5increased,indicating that the activity of chondrocytes gradually decreased with the increase of chondrocytes generation.And the rat chondrocytes of the same generation had higher activity than rabbit chondrocytes.The toluidine blue staining revealed that there were some blue⁃stained glycosaminoglycan components in chondrocytes.Under the fluorescence excitation of different wave bands,collagenase typeⅡimmunofluorescence staining showed clear green fluorescence in the cytoplasm and membrane of primary cultured rat chondrocytes,and red fluorescence of rabbit chondrocytes,the nucleus was bright blue fluorescence.Conclusion The study compared the culture and characteristics of chondrocytes in rats and New Zealand rabbits.It was confirmed that the chondrocyte activity gradually decreased with the increase of culture passages,and that rat chondrocytes of the sameDOI：10.3969/j.issn.1674⁃8573.2020.04.010generation had higher activity than rabbit chondrocytes.【Key words】Articular cartilage;Chondrocytes;Cell isolation culture骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）作为一种慢性的关节退行性病变，其主要的病理改变是关节软骨损伤［1］。

关节镜下膝关节滑膜软骨细胞培养与移植技术

对患者进行长期随访，了解移植后关节功能恢复情况
收集患者反馈，评估手术满意度和生活质量改善情况
总结经验教训，不断优化手术流程和术后康复方案
04
并发症预防与处理策略
感染风险预防与控制措施
1 2
严格无菌操作
在手术过程中，需严格遵守无菌操作原则，确保手术器械、敷料等无菌物品不被污染。
预防性使用抗生素
人工智能在关节镜手术中应用
手术导航系统
利用人工智能技术对医学影像进行处理和分析，构建三维模型并规划手术路径，提高关节镜手术的精准度和安全性。
机器人辅助手术
研发具有高精度、高稳定性的手术机器人，可在医生远程操控下完成关节镜下的精细操作，减轻医生工作强度并提高手术效率。
智能康复评估系统
通过对患者术后康复过程中的生理指标、运动功能等进行实时监测和分析，为患者提供个性化的康复方案和指导。
基因治疗在滑膜软骨修复中前景
基因治疗策略
通过向滑膜软骨细胞导入特定基因，如生长因子基因、转录因子基因等，以调节细胞增殖、分化和基质合成等生物学行为。
载体系统研究
开发高效、低毒的基因载体系统，如病毒载体、非病毒载体等，以实现基因的定向导入和稳定表达。
临床试验进展
目前已有部分基因治疗产品进入临床试验阶段，初步显示出对滑膜软骨修复的良好效果。
其他可能出现的并发症及应对策略
神经损伤
在手术过程中，需避免损伤周围重要神经，一旦发现神经损伤，需及时采取修复措施。
移植物排斥反应
部分患者可能对移植物产生排斥反应，需密切观察患者病情变化，并采取相应治疗措施。
深静脉血栓形成
术后需鼓励患者尽早进行下肢活动，以降低深静脉血栓形成的风险，一旦发现血栓形成，需及时采重的心肺功能不全、凝血功能障碍、关节感染等，应在术前进行充分评估和准备。

软骨细胞培养及其调控

软骨细胞培养及其调控【摘要】本文介绍了软骨细胞培养及其调控的相关内容。

在阐述了软骨细胞培养及其调控的概述以及软骨细胞在人体中的重要性。

在分别探讨了软骨细胞培养技术、生长因子对软骨细胞生长的调控、细胞外基质对软骨细胞的影响、生物力学调控软骨细胞功能以及调控软骨细胞分化的方法。

在展望了软骨细胞培养及其调控的前景，并指出了研究中存在的问题与挑战。

通过本文的介绍，读者可以了解软骨细胞的培养和调控在组织工程和再生医学领域的重要作用，同时也能够认识到未来研究中需要解决的挑战。

【关键词】软骨细胞培养, 软骨细胞调控, 生长因子, 细胞外基质, 生物力学, 分化, 前景, 问题, 挑战1. 引言1.1 软骨细胞培养及其调控概述软骨细胞培养是一种重要的细胞培养技术，可以为软骨修复和再生提供重要的支持。

软骨细胞的培养与调控是软骨组织工程的关键步骤，通过控制培养条件和添加合适的生长因子等方法，可以促进软骨细胞的增殖和分化，从而实现软骨组织的修复和再生。

软骨组织是人体内一种重要的结缔组织，具有耐压、弹性好等特点，因此软骨细胞的培养与调控对于维持软骨组织的功能和结构至关重要。

在软骨细胞培养及其调控的研究中，已经取得了一些进展，但同时也存在一些挑战和问题，需要进一步深入研究。

软骨细胞培养及其调控的研究对于促进软骨组织工程的发展，提高软骨修复和再生的效果具有重要意义。

1.2 软骨细胞的重要性软骨细胞是软骨组织的主要细胞类型，具有重要的生理功能和临床意义。

在人体中，软骨细胞通过合成和分泌胶原蛋白、硫酸软骨素等细胞外基质成分，维持着软骨组织的结构和功能。

软骨组织具有良好的弹性和韧性，能够减轻关节间的摩擦和冲击，保护关节软骨不受损伤。

软骨细胞还参与修复和再生过程，对于损伤软骨的修复至关重要。

在生理情况下，软骨细胞的增殖和分化受到多种生长因子、细胞外基质成分和生物力学信号的调控。

这些调控因素对软骨细胞的生长、合成和分泌具有重要影响，是软骨组织正常功能的保障。

软骨细胞培养流程

软骨细胞培养流程
《软骨细胞培养流程》
软骨细胞培养是一种重要的实验技术，用于研究软骨细胞的生长、增殖和分化。

软骨细胞是一种特殊的细胞，具有重要的支持和维持软骨组织结构和功能的作用。

软骨细胞培养流程需要一系列精细的操作和严格的实验条件。

首先，要获得软骨组织样品，可以从实验动物或人体骨骼中获取。

然后将软骨组织样品切割成小块，并用消化酶处理，以释放软骨细胞。

接下来，将释放的软骨细胞收集并进行离心，去除异物和细胞碎片。

然后将软骨细胞将种植到培养皿中，添加适当的细胞培养基，并将培养皿放入细胞培养箱中进行培养。

在细胞培养过程中，需要密切观察软骨细胞的生长状态，定期更换培养基，并进行细胞传代。

此外，还需要进行细胞鉴定、纯化和分化培养等步骤，以确保所培养的细胞具有良好的生长和分化能力。

软骨细胞培养流程需要严格控制细胞生长环境的温度、湿度、气体和营养物质等条件，以确保细胞的稳定生长和繁殖。

另外，在细胞培养过程中也需要注意防止细菌、真菌和病毒的污染，保持细胞培养环境的洁净和安全。

通过细胞培养技术，研究人员可以获取大量的软骨细胞用于进一步的实验研究，以深入了解软骨细胞的生物学特性和功能，为软骨组织工程和临床治疗提供重要的基础和支持。

软骨细胞培养.doc

实验方法各种溶液的配制1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9（1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g（2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。

（3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。

（4）将酚红液（３）加入（２）中。

（5）补加水至1000ml，混匀。

（6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。

2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml（1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。

（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。

（3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。

（4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。

（5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。

3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml（1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。

（2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。

（3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

（4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。

4、配制闪烁液（1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。

（2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。

取材与培养（1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。

（2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。

（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。

（4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。

每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。

用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。

软骨细胞培养

软骨细胞培养(1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。

(2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节（保留周围肌肉，软骨不能暴露），75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软骨组织，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软骨组织被风干。

(3)PBS缓冲液充分漂洗软骨小块3次，然后用小剪刀将软骨块切碎至约lmm3大小。

(4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软骨块置入放有0.2%的Ⅱ型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37℃恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞（沉淀物），加入含10%的胎牛血清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软骨细胞混悬液。

(5)把消化所得的软骨细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2×105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。

将培养瓶放置于CO2培养箱内。

培养条件为37℃、5%CO2。

(6)未消化完的软骨小块继续用Ⅱ型胶原酶如上法消化，直至软骨块基本消失。

(7)每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照保存。

药物制备龟甲胶、鹿角胶各10克，氨基葡萄糖1.5克，分别加PBS缓冲液30ml配成10g/30ml、10g/30ml和1.5g/30ml的溶液。

然后分别取上述溶液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml放于不同的15ml离心管中，加PBS定容至10ml，各配成6管分别为2.5%、5%、10%、20%、30%、40%含药的PBS，放4℃冰箱备用。

药物组：将上述6管含药PBS分别各取1ml放于不同的15ml离心管中，加含10%胎牛血清的DMEM培养液定容至10ml，分别配成10%含药的胎牛血清DMEM培养液（避免胎牛血清的干扰），做好标记，放4℃冰箱备用。

正常人关节软骨细胞的长期培养

正常人关节软骨细胞的长期培养正常人关节软骨细胞的长期培养实验材料：1. 软骨细胞来源：20—24周自然流产胎儿的股骨和胫骨；2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1&time，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；3. 消化液Ⅰ：2mg/ml胰蛋白酶和2mg/ml胶原酶混合消化液，用液配制；4. 消化液Ⅱ：0.5mg/ml胶原酶，用培养液Ⅰ配制；5. 培养液Ⅰ：DMEM培养液，补充10%胎牛血清；6. 培养液Ⅱ：DMEM培养液中补加10%胎牛血清、青霉素1000IU/ml、链霉素1mg/ml、两性霉素2.5μg/ml、谷氨酰胺2mmol/L、1%维生素添加剂（vitamin sulements）以及维生素C 50μg/ml；7. 10% poly HEMA：称取6g多聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯（2-hydroxyet hylmethacrylate，poly HEMA），加到50ml 95%乙醇中，于37℃恒温振荡水浴箱中缓慢振荡过夜，次日将所得溶液离心（2500r/min，10mi n），除去未溶解的颗粒，此为干液。

取1ml干液与9ml 95%乙醇混合，稀释成10%（V/V）的poly HEMA溶液；8. 筛网：孔径为100μm的尼龙筛网；实验方法：1. 在无菌条件下，从20—24周自然流产胎儿的股骨头和胫骨坪切取骺软骨。

用液洗净血液。

尽量除去纤维性组织；2. 将软骨放入消化液Ⅰ中，于37℃孵育1h；3. 弃孵育液。

将软骨块充分切碎，加入消化液Ⅱ，在37℃孵育过夜；4. 用尼龙筛网过滤，滤液中加入培养液Ⅰ。

再经250g离心5min，弃上清液；5. 用培养液Ⅰ将细胞团吹散，重新悬浮细胞，离心。

重复4次。

用培养液将最后得到的细胞团制成悬液；6. 计数细胞。

从每克软骨平均可获得大约3.0&time108个软骨细胞；7. 取0.9ml 10% poly HEMA溶液铺在直径为60mm的塑料培养皿内，水平放置在通风的超净工作台上干燥（过夜）；8. 使用前将包被poly HEMA的培养皿用灭菌紫外灯照射30min；9. 将含5&time106个软骨细胞的悬液接种到已包被poly HEMA的培养皿中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养；10.每3—4d换一次液。

改良分步消化法培养原代软骨细胞

改良分步消化法培养原代软骨细胞田峰;崔学生;张帅;石玉泽;金群华【摘要】背景:胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂,容易污染,但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道.目的:采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,以获取大量纯净的软骨细胞.方法:将新西兰白兔6只随机分2组,酶消化法组运用酶消化法分两步获取原代软骨细胞,对照组用传统法进行原代软骨细胞培养.培养1周后观察两组培养的软骨细胞的生长状态,并进行细胞鉴定、计数,评估改良后的方法对细胞的影响.结果与结论:酶消化法组采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞,与对照组相比,可将6 h以上的消化时间缩短至3 h.两组原代软骨细胞培养24 h均多呈圆形,悬浮状态,48 h 后贴壁,培养1周后,两组软骨细胞可铺满培养瓶底.结果证实,采用改良分步消化法进行软骨细胞培养,在缩短了消化时间的同时其细胞生长及形态变化均无改变,可以顺利获取大量纯净的软骨细胞.%BACKGROUND: Combination of trypsin and bacterial collagenase to digest articulate cartilage matrix is widely used at home and abroad. Some studies have shown that the method steps is tedious, process is complicated, and cell is easy to pollution, but the better simple, safe and reliable method has rarely been reported.OBJECTIVE: To obtain highly purified and large amount of chondrocytes by improved stepwise digestion method. METHODS: Six 3-week-old New Zealand rabbits were divided into two groups: The experimental group was cultured by two-step enzyme digestion, and the control group was cultured by the traditional enzyme digestion method. The growth condition of chondrocytes was observed in the two group after 1 week,and cell counting and identification was performed. We estimated improved method to evaluate the influence of cells.RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the traditional method, this method spent shorter time to digest chondrocytes. After 24 hours, the primary chondrocytes in the two groups were mostly round at a suspending state. After 48 hours, the cells began to adhere. The results demonstrated that the improved method shortens digestion time, and easy to obtain a great amount of purified chondrocytes.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)020【总页数】3页(P3633-3635)【关键词】软骨细胞;关节软骨;细胞分离;原代培养;组织工程【作者】田峰;崔学生;张帅;石玉泽;金群华【作者单位】宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004;宁夏医科大学附属医院骨科三病区,宁夏回族自治区银川市,750004【正文语种】中文【中图分类】R318背景：胰蛋白酶和细菌胶原酶结合使用消化关节软骨基质获得大量纯度高的软骨细胞的方法步骤繁琐、过程复杂，容易污染，但更好的简单易行、安全可靠的方法至今少有报道。

自体软骨细胞体外培养用于法规的要求

自体软骨细胞体外培养用于法规的要求全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：自体软骨细胞是一种重要的细胞类型，具有重要的生物学功能和医学应用价值。

在现代医学领域中，利用自体软骨细胞进行体外培养已经成为一种常见的治疗手段，尤其在关节炎、软骨缺损修复等方面具有重要的临床应用前景。

为了确保自体软骨细胞的体外培养安全有效，必须遵守一系列的法规和规定。

一、生物安全规范在进行自体软骨细胞的体外培养过程中，首要保证的是生物安全。

需要遵守相关生物安全规范，确保实验室环境清洁、无菌，并采取必要的生物安全措施，避免污染和交叉感染的发生。

还需要对实验室设施进行定期检查和维护，确保实验环境符合生物安全要求。

二、细胞质量控制在进行自体软骨细胞的体外培养过程中，需要严格控制细胞的质量。

细胞来源必须合法合规，采集方式符合相关伦理规定，并确保细胞的纯度和活性。

在培养过程中，需要严格控制培养基的成分和质量，确保细胞在最适宜的环境中生长和分化。

三、质量管理体系为了确保自体软骨细胞的体外培养质量和安全，需要建立完善的质量管理体系。

这包括建立标准操作程序（SOP）、记录管理系统和质量控制流程，确保各项操作符合规范和标准。

还需要建立相关的质量标准和指标，对自体软骨细胞的培养过程进行全面监测和评估。

四、临床试验规范在进行自体软骨细胞的体外培养临床应用前，需要进行严格的临床试验。

这包括临床试验设计、试验伦理和数据分析等方面的规范，确保临床试验的结果可靠、科学和合法。

还需要遵守相关临床试验规定，如《临床试验管理办法》等，确保试验过程合规。

五、知识产权保护在利用自体软骨细胞进行体外培养时，必须遵守相关知识产权规定，保护相关技术和成果。

这包括专利申请、技术保密和合作协议等方面的保护措施，确保相关成果的合法性和可持续发展。

要保证自体软骨细胞的体外培养安全有效，必须严格遵守各项法规和规定，确保操作符合规范和标准。

只有在遵守相关法规的前提下，才能更好地保障自体软骨细胞的体外培养质量和安全，为其临床应用提供可靠保障。