羊口疮病毒F1L蛋白二级结构分析与表位预测

羊口疮病毒F1L蛋白二级结构分析与表位预测
王光祥;尚佑军;吕占禄;张克山;田宏;刘湘涛
【摘要】The network platform SOPM A server was used to predict the secondary structure of ORFV F 1L protein . On the basis of the DNAStar prediction results (hydrophilicity , accessibility , flexibility and antigenicity ) , the B cell epitopes of ORFV F1L protein was predicted by screening the secondary structure and followed by verification using ABC prod program . The cytotoxic T cell (CTL) epitopes of ORFV F1L protein were predicted by combination of quantitative matrix (QM ) and artificial neural network (ANN) . T helper (Th) epitopes of ORFV F1L protein were predicted by an online server for the prediction of M HC class II-peptide binding affinity . The result showed that ORFV F1L protein had alpha helixes (34 .71% ) , random coils (40.59% ), β-sheet (18.82% ) and β-turn (5.88% ). No signal peptide was found, while 7 B-cell epitopes, 2 CTL epitopes and 3 Th epitopes of ORFV F1L protein were predicted . These findings would provide theoretical basis for establishment of ORFV diagnosis method , preparation of monoclonal antibody and development of vaccine .%目的利用软件预测羊口疮病毒(ORFV)F1L蛋白的二级结构和细胞表位.方法利用SOPMA 服务器预测ORFV F1L蛋白的二级结构,以DNAStar软件单参数(二级结构、亲水性、可及性、柔韧性及抗原性)预测结果为基础,通过二级结构预测初步筛选,并以ABCpred方案作为最终验证,预测羊口疮病毒(ORFV) F1L蛋白的B细胞表位;运用神经网络+量化矩阵法(ANNs+QM法)预测ORFV F1L蛋白的CTL细胞表位;使用MHC-II类分子结合肽在线程序预测ORFV F1L蛋白的Th细胞表位.结果 ORFV
F1L蛋白含有α-螺旋34.71%、β-片层18.82%、β-转角5.88%、无规则卷曲40.59%;没有信号肽,可能存在7个B细胞表位, 2个CTL表位,3个Th细胞表位.结论该研究结果将为建立ORFV诊断方法、制备单克隆抗体及合成肽疫苗提供理论依据.
【期刊名称】《中国人兽共患病学报》
【年(卷),期】2012(028)012
【总页数】6页(P1185-1190)
【关键词】羊口疮病毒;F1L基因;二级结构;细胞表位;预测
【作者】王光祥;尚佑军;吕占禄;张克山;田宏;刘湘涛
【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰
州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰
州,730046
【正文语种】中文
【中图分类】R373
羊口疮（Orf）是由羊口疮病毒（Orf vir us，ORFV）引起反刍动物，主要以引起绵羊和山羊感染为主的一种急性、高度接触性人兽共患传染病［1－2］。

ORFV
主要感染羔羊和幼羊，主要以口唇、舌、鼻等部位形成丘疹、水疱、脓疱和痂皮为特征，羔羊常因继发感染而死亡，给养羊业造成巨大的经济损失，并对人类健康构成威胁［2－5］。

ORFV属于痘病毒科副痘病毒属，病毒粒子长220～250 n m，宽125～200 n m，表面结构为管状条索斜形交叉“8”字形缠绕线团状。

ORFV基因组为线性双股DNA，全长130～150 kb，病毒基因组中间是一个长的中心编码区，两头是相同
的反向末端重复序列［6－7］。

现在大多数学者公认CPDV有16个开放性阅读
框架（ORF），130个基因，在127个双股线性基因中，有88个基因是高度保守的。

可变区大多数位于基因的末端，中间基因相对保守［6－8］。

包括末端基因
区和中间核心区。

F1L基因位于病毒基因组中部，其编码产生的39 k Da蛋白是
病毒表面微管的组成成分之一，并且能诱导宿主产生中和抗体［9］。

此外，该蛋白具有肝素结合活性，能够与表达于大多数哺乳动物细胞表面的硫酸乙酰肝素（Heparansulfate，HS）受体结合，因此该蛋白被认为在病毒吸附和侵入过程中起到重要作用［10］。

Gallina等［11］研究证实F1L蛋白能够刺激机体中和抗体的产生，同时也能介导细胞免疫，因而该蛋白被认为是刺激机体产生免疫应答的主要免疫原蛋白，同时也被认为是ORFV亚单位疫苗研制的候选抗原。

因此，研究
F1L蛋白对羊口疮的诊断和免疫具有重要意义。

现代生物信息学的迅猛发展，为我们提供了一种高效、快速预测表位的方法，但以往表位预测多采用单参数预测，有其局限性，随着生物信息学的发展及其网络数据库的扩展，多参数综合预测已成为当前表位预测的主流［12］，可大大提高预测
的准确性。

本研究以ORFV F1L靶抗原，预测其二级结构、信号肽、优势的B细
胞表位和T细胞表位为ORFV后续的诊断和免疫研究提供理论依据。

1 材料与方法
1．1 氨基酸序列选取ORFV F1L蛋白全长共340个氨基酸（氨基酸序列来自本
实验室测序），序列如下：MDPPEITAYIIGVAEGRGTKEVFPTLP YLVGLADDPPKPQPAPAPSPAPAPAPAPAPS PAPAPAPKPSPPAPHPKGDHVLKAVEWKDV DSKDYPHFFTDMCKSTCPKEMQRRAAH HLN L WESISAGTVSTKYSDNDFILVVDNDMTFRKP EMVKPLIEA MKTNGWY MAQLKETY MTGAL ATNVPGTGDPEL MVYPGGYDVSLDAYITNV GGMKKLYDAIIKDGGLRGGLLTEVFTLEKRL SLARVVLSGAEQVVYPEYYIQVKTRLGGAP SL WSLLAT WLARF WPGAIYFLTTPLFSFMG LFDVDVVDVFILAYLLVLVLLLPNSRLL WFIA GLLVTAIV。

1．2 方法应用生物信息学相关软件和生物信息学网站，分析ORFV F1L蛋白的功能基序、表位类型、功能定位、信号肽二级结构等；所用生物信息学网站有：蛋白二级结构预测网站：http：／／npsapbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa＿auto mat．pl？page＝／；信号肽预测网站：http：／／www．cbs．dt u．dk／ser v－ices／Signal P／；B细胞表位预测网站：http：／／www．i mtech．res．in／raghava／abcpred；细胞毒性 T 细胞（CTL）表位预测网站http：／／www．i mtech．res．in／raghava／nhlapred；辅助T细胞（Th）抗原表位的预测网站：http：／／www．i mtech．res．in／raghava／pr opred／；生物信息学软件有：DNAStar Laser gene7程序包的Pr otean软件，在线软件Signal P 4．0。

2 结果
2．1 ORFV F1L蛋白的二级结构用SOPMA［13］服务器预测ORFV F1L蛋白的
二级结构结果如图1所示，ORFV F1L蛋白的二级结构主要包括α－螺旋、β－转角、无规则卷曲和β－片层4种类型，分别为α－螺旋34．71%、β－片层18．82%、β－转角5．88%%、无规则卷曲40．59%。

整个结构中α－螺旋区
域和无规则卷曲区域出现的较多，这有利于维持病毒膜蛋白的稳定性。

β转角及无规则卷曲是比较松散的柔性结构，该区域常含有B细胞的优势表位［14］。

F1L
蛋白的无规则卷曲和β转角即功能区主要位于第1—5、14—27、33—77、86—93、104—106、125—136、143—149、162—165、177—190、195—201、222—229、248—150、255—258、264—265、267—269、282—287、292—294、300—304、322—326位氨基酸（图1）。

图1 ORFV F1L蛋白二级结构预测结果h：α－螺旋，t：β－转角，c：无规则卷曲，e：β－片层Fig．1 Secondary structure prediction oforFV F1L protein h：Alpha helix；t：Beta turn；c：Random coil；e：Extended strand．
2．2 ORFV F1L蛋白信号肽预测使用在线软件Signal P 4．0，利用神经网络法（Neural net wor k，NN）［14］预测ORFV F1L蛋白序列中是否存在潜在
的信号肽。

在线软件Signal P 4．0预测结果显示ORFV F1L蛋白没有信号肽，预测结果如图2。

图2 F1L蛋白信号肽预测结果Fig．2 The signal peptide analysis of F1L
2．3 ORFV F1L蛋白B细胞表位多参数预测使用DNAStar Lasergene7程序包
的Protean软件提供的模块对ORFV F1L蛋白进行多参数预测，选择Kyte－Doolittle法预测蛋白的亲水性；Emini法预测蛋白的表面可及性；用Karplus－Eisenberg法分析蛋白的柔韧性；用Jameson－Wolf法预测蛋白的抗原指数见图3。

将ORFV F1L蛋白单参数预测结果进行综合分析后发现，同时有3种或以上参数预测的表位肽段：1—4、16—19、34—49、55—78、129—134、143—152、169—174、186—188、210—214位氨基酸可能存在的B细胞表位（表1）。

最后将单参数预测综合分析结果采用ABCpred［13］方案（窗口长度16，阈值0．51）进行筛选、验证，发现ORFV F1L蛋白的 9—24、30—45、54—69、128—143、136—151、167—182和207—222等区段可能存在优势B细胞表
位（表2）。

表1 不同方案预测ORFV F1L蛋白B细胞表位的肽段位置Tab．1 B cell epitopes for ORFV F1Lpredicted by various methodsPrediction method Outcome of prediction Secondary structure prediction 1－5，14－27，33－77，86－93，104－106，125－136，143－149，162－165，177－190，195－201，222－229，248－150，255－258，264－265，267－269，282－287，292－294，300－304，322－326 Hydrophilicity 1－6，16－24，34－51，53－99，128－135，144－153，158－175，184－192，197－201，210－215，223－225，210－215，239－241，252－255，259－267 Surface accessibility 1－4，16－19，21－22，34－48，55－60，63－76，86－93，107－133，129－134，143－152，168－174，186－188，213－215，236－239，256－258 Flexible regions 15－22，34－49，55－78，86－93，102－111，123－136，142－145，148－198，209－214，221－230，248－251，263－271，322－326 Antigenicity 1－6，13－22，32－49，55－81，83－94，99－114，123－136，142－153，166－163，169－174，183－190，201－216，219－229，235－242，247－251，262－271，323－325 Parameter analysis 1－4，16－19，34－49，55－78，129－134，143－152，169－174，186－188，210－214
表2 ABCpred方案预测初筛肽段的结果Tab．2 The score of the peptides obtained by preliminary prediction with ABCpred programThe peptide segment position 9－24 30－45 54－69 128－43 136－151 167－182
207－222 Score 0．84 0．82 0．73 0．82 0．66 0．79 0．79
图3 F1L亲水性分析Fig．3 Hydrophilicity analysis of F1L
图4 F1L表面可及性区域Fig．4 Surface probability regions of F1L
图5 F1L柔韧性区域Fig．5 Flexible regions of F1L
图6 F1L抗原指数分析Fig．6 Antigenic index of F1L
2．3 ORFV F1L蛋白T细胞表位预测
2．3．1 ORFV F1L蛋白CTL表位预测在网络平台输入ORFV F1L蛋白序列，运用ANNs＋QM法（神经网络＋量化矩阵法）［16］分别预测 HLA－A2、HLA－A＊0201、HLA－A＊0202、HLA－A＊0203、HLA－A＊0205的分子结合肽，阈值设为0．5，结果见表3所示。

综合分析ORFV F1L 228—236位的GLLTEVFTL，310—318 位的 FILAYLLVL 为ORFV F1L蛋白的CTL表位。

表3 CTL抗原表位预测Tab．3 Prediction for CTL epitopes oforFV F1LAllele Peptide rank Start position Sequence HLA－A2 12345678 2 24 228 254 296 310 311 314 320 GLRGGLLTE GLLTEVFTL VYPEYYIQV FSFMGLFDV FILAYLLVL ILAYLLVLV YLLVLVLLL LLLPNSRLL HLA－A＊0201 1234567891 0 201 228 239 254 298 311 314 319 320 326 SLDAYITNV GLLTEVFTL RLSLARVVL VYPEYYIQV FMGLFDVDV ILAYLLVL YLLVLVLL VLLLPNSRL LLLPNSRLL RLL WFIAGL HLA－A＊0202 12345 201 228 246 271 310 SLDAYITNV GLLTEVFTL VLSGAEQVV SL WSLLAT W ILAYLLVLV HLA－A＊0203 123 279 310 330 WLARF WPGA ILAYLLVLV FIAGLLVTA HLA－A＊0205 123 2 28 310 330 GLLTEVFTL ILAYLLVLV FIAGLLVTA
2．3．2 ORFV F1L蛋白Th表位的预测使用在线程序，对ORFV F1L蛋白的Th 表位进行预测［17］，预测 DRB1＿0101、DRB1＿0102 、DRB1＿0301 3种不同类型，预测结果见表5。

综合分析0RFV F1L的51段3类结合肽，有3段结合
肽为3类结合肽等位基因所共有，即317—325位的 VLIQTTAEA、318—326位的 VLLLPNSRL和308—316位的VFILAYLLV为ORFV F1L的Th表位。

3 讨论
本研究借助于计算机网络技术和生物学软件对ORFV F1L蛋白的二级结构，信号肽和潜在的T、B淋巴细胞抗原表位进行了预测和分析。

分析结果表明该蛋白形成α螺旋结构的能力较强，β折叠较少，这可能与该蛋白的氨基酸组成有关。

蛋白二级结构中的α－螺旋、β折叠的化学键能较高，能较牢固地维持蛋白的高级结构，但很难较好地与抗体嵌合，且经常处于蛋白质内部，因而很少成为抗原表位。

但是该蛋白具有较多的β转角和无规则卷曲结构单元，这些结构易于扭曲、盘旋并展示在蛋白表面，有利于抗体嵌合，常含有B细胞优势抗原表位［15，18］。

信号肽为分泌蛋白在通过膜时N末端所含作为信号的氨基酸序列，常由15～25个氨基酸构成，N端含少量的碱性氨基酸，主要含不携带电荷的疏水性氨基酸，在蛋白成熟后信号肽序列将被剪切、去掉。

通过预测信号肽可以避免预测出的表位落在信号肽区，预测结果显示ORFV F1L蛋白没有信号肽。

目前，已有几十种预测B细胞抗原表位的算法，其中，亲水性、可及性、柔韧性及抗原性方案的预测效果相对较好［18］。

基于人工神经网络算法的ABCpred方案，预测准确率最高可达65．9%［15］。

本文综合这些方法对ORFV F1L蛋白潜在的B细胞抗原表位进行预测和分析。

ABCpred方案预测ORFV F1L蛋白中的B细胞表位分值的范围在0．66～0．84之间，用单参数和二级结构筛选出的肽段在用该方法的预测结果中均可找到相对应的片段。

本研究推测ORFV F1L蛋白最可能的B细胞优势抗原表位分别位于其N端氨基酸残基第9—24、30—45、54—69、128—143、136—151、167—182和207—222等区段。

表4 Th表位的预测Tab．4 Prediction for Th cell epitopes oforFV F1LDRB1＿0101 DRB1＿0102 DRB1＿0301 Peptide Rank Start Position Sequence
Peptide Rank Start Position Sequence Peptide Rank Start Position Sequence 1 317 LVLLLPNSR 1 317 LVLLLPNSR 1 138 LVVDNDMTF 2
313 YLLVLVLLL 2 244 VVLSGAEQV 2 287 IYFLTTPLF 3 244 VVLSGAEQV
3 318 VLLLPNSRL 3 317 LVLLLPNSR
4 318 VLLLPNSRL 4 308 VFILAYLLV
4 244 VVLSGAEQV
5 257 YYIQVKTRL 5 271 L WSLLAT WL 5 31
6 VLVLLLPNS 6 309 FILAYLLVL 6 191 MVYPGGYDV 6 218 IIKDGGLRG
7 30
8 VFILAYLLV 7 327 L WFIAGLLV 7 224 LRGGLLTEV 8 288 YFLTTPLFS 8 311 LAYLLVLVL 8 23
9 LSLARVVLS 9 271 L WSLLAT WL 9 287 IYFLTTPLF
9 318 VLLLPNSRL 10 317 MVYPGGYDV 10 309 FILAYLLVL 10 308 VFILAYLLV 11 297 FMGLFDVDV 11 330 IAGLLVTAI 11 140 VDNDMTFRK 12 327 L WFIAGLLV 12 21 VFPTLPYLV 12 257 YYIQVKTRL 13 311 LAYLLVLVL 13 313 YLLVLVLLL 13 8 YIIGVAEGR 14 328 WFIAGLLVT 14
10 IGVAEGRGT 14 313 YLLVLVLLL 15 272 WSLLAT WLA 15 174 MTGALATNV 15 232 VFTLEKRLS 16 8 YIIGVAEGR 16 297 FMGLFDVDV 16 259 IQVKTRLGG 17 287 IYFLTTPLF 17 326 LL WFIAGLL 17 311 LAYLLVLVL
CTL表位是经抗原提呈细胞处理提呈的一种抗原蛋白，它与MHC－I类分子结合，被T细胞抗原受体（TCR）特异性识别从而诱导相应的CTL发生免疫应答的短肽，它一般含8～10个连续氨基酸，活化并决定了CTL特异性杀伤效应［16，19］。

预测CTL表位，常用结合基序法、人工神经网络法和蛋白酶体矩阵法，本研究采
用最为高效、准确的人工神经网络法结合量化矩阵法，选择HLA－A2、HLA－A
＊0201、HLA－A＊0202、HLA－A＊0203、HLA－A＊0205 5类31段结合肽，来综合预测ORFV F1L蛋白的CTL表位。

结果显示ORFV F1L蛋白的228—236
位的 GLLTEVFTL，310—318位的FILAYLLVL两段结合肽为各类所共同预测。

该
肽段可与MHCI类分子结合形成复合物呈递给免疫细胞，进而调控激活CTL细胞
的细胞毒作用。

Th表位是识别外源蛋白（如细菌、病毒抗原和免疫接种的蛋白等）经加工后与MHC II类分子结合的抗原表位（外源性抗原T细胞表位）。

外源蛋白被APC捕
获送入溶酶体裂解成一定肽段后，在HLA－DM分子帮助下，消除由Ii链引导进
入溶酶体的MHCII类分子上的Ⅱ类分子Ii链相关肽（CLIP），使得肽段中的T细胞表位进入MHC II类分子凹槽与之结合形成抗原肽－MHC II类分子复合体，再
易位至APC表面，被CD4＋Th细胞识别，激活Th细胞以辅助B细胞产生抗体。

活化的细胞还产生一些细胞因子，介导NK细胞等免疫细胞产生细胞免疫应答。

MHC－Ⅱ类分子呈异源双体，包括α、β两条链，分别有α1、α2和β1、β2结
构域，其中α1和β1组成与两端开放的抗原肽结合深槽。

MHC－Ⅱ类分子结合槽底部呈微小锯齿形排列，形成9个“小袋”样结构，可与相应结合肽上的氨基酸
结合［20］。

相对应的结合肽两端的氨基、羧基可有一定的延长，从13～34个
氨基酸不等。

本研究利用MHC－II类分子结合肽在线程序，预测了ORFV F1L蛋白的DRB1＿0101、DRB1＿0102、DRB1＿03013种不同等位基因的Th表位。

预测结果显示0RFV F1L的51段3类结合肽，有3段结合肽为3类结合肽等位基因所共有，即317—325位的 VLIQTTAEA、318—326位的 VLLLPNSRL和308—316位的VFILAYLLV氨基酸短肽。

它们可与MHCII类分子结合，被抗原递呈细胞转运至细胞表面与T细胞受体识别结合，起到协调体液免疫和细胞免疫应
答的作用。

［17，20］。

本研究依靠生物信息学网络平台和生物软件分析了ORFV F1L的二级结构，预测
了B细胞抗原、HLA抗原肽、MHC结合肽等。

为该蛋白的体外表达及用于ORFV 的免疫诊断和疫苗研制提供理论依据。

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