精编第六章-体外标记免疫分析
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第六章免疫标记技术ppt课件
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１ ．SPA通用系统
（1）SPA的发现 （2）颗粒SPA的应用 （3）SPA的标记和应用
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（1）SPA的发现
1940 年 Verwey 发 现 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 某 些菌株，可与人正常血清在双相免疫扩 散试验中出现沉淀线。
1958 年 Jensen 用 离 子 交 换 树 脂 分 析 证 明 ， 该成分是一种细菌胞壁上不含糖的蛋白 质，命名为金黄色葡萄球菌A蛋白 (Staphylococcal Protein A，SPA)
开创了生物活性物质微量测定 技术的新时代，是微量分析方法学 上的一个突破。
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5
放射免疫技术
优点：
① 特异性强，即抗原抗体的特异性反应；
② 灵敏度高，结果精确，检测范围10-910-12g；
③ 操作流程简单易行，加样程序简单，测量和
数据处理自动化；
④ 样品用量少、一般无需复杂的提纯步骤；
(direct labeling)
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direct ELISA—for Ag
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67
direct ELISA—for Ab
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（2）间接标记法
（indirect labeling）
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70
（3）夹心法 （sandwich assay）
⑤ 应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。
缺点：
需要昂贵的检测仪精选器课件；ppt 同位素污染。
6
放射免疫技术的原理
是建立在标记抗原（或配体） 和待测抗原（或配体）对有限量的 特异性抗体（或受体）的竞争性抑 制反应基础上的，最终形成的放射 性标记复合物与被测配体（或抗原） 呈负相关，因而亦称竞争性放射免 疫技术。
标记免疫分析的临床应用
免疫分析检测的浓度关系
10-12 pg/mL 免疫分析 治疗药物 甲状腺激素 性激素 心脏标志物 肿瘤标志物 感染性疾病 维他命 特殊过敏原 10 -9 10 -6 mg/mL 10 -3 mg/mL 临床生化 10-0 gm/mL
ng/mL
免疫分析的未来
过去
• 症状的处理 • 没有标准的准则
现在
③、甲状腺功能减退使泌乳素增加，也可能引起 垂体增大而诱发垂体腺瘤。如果促甲状腺素 （ TSH）水平增高，进一步的检查应安排在甲状 腺功能减退纠正后。
④、怀孕期间泌乳素水平明显增加，但泌乳素产 生的损害不常见。 ⑤、剧烈运动后，可使血清泌乳素水平升高，因 此，抽血前最好休息一定时间。
生长激素（GH）
大多数生长激素缺乏者血清 IGF-1 值偏低，但需参考试验 者的营养、心理状态及骨龄等因素。因营养不良、肝脏疾 病儿童可出现假性降低，精神性侏儒症的儿童需要家庭治 疗或改善家庭环境，而不需要生长激素治疗。体质性青春 期延迟的病人相对于他的年龄而言， IGF-1 是降低的，但 相对于其骨龄来说 IGF-1 正常。除 IGF-1 降低外， IGF-2 降 低也有助于生长激素缺乏的诊断。IGFBP-3 是生长激素依 赖性的，据说如果低于正常，诊断生长激素缺乏较 IGF-1 更可靠。
参考值的使用方法
熟悉实验室在确立参考值时所用的方法和 人群； 出现意外异常结果时，了解一些基本原则， 如：是否来自同一人群的样本作为参考组、 与以前的结果是否相似、病人抽血前的准 备情况等等；必要时控制预分析因素后重 复检验。 医生与实验室之间发展良好的工作关系。
人类内分泌系统
内分泌腺
检验核医学：体外标记分析技术的临床应用
91
12
13.2
ER-、PR+
10
3
30.0
ER+、PR-
125
37
29.6
ER+、PR+
118
89
75.4
__________________________________________________
ＥＲ和ＰＲ与乳腺癌化疗效果的关系(136例)
__________________________________________________
2. 血浆皮质醇(PTF) 3. 尿游离皮质醇(UFF)
四、垂体性腺轴功能测定指标
1. 促黄体生成素(LH) 2. 促卵泡生成激素(FSH) 3. 催乳素(PRL) 4. 孕酮(P) 5. 雌二醇(E2) 6. .雌三醇(E3) 7. 人绒毛膜促性腺激素(HCG) 8. 人绒毛膜促性腺激素－β亚单位(β-HCG) 9. 人胎盘催乳素(HPL)
受体状态
治疗例数
有效例数 有效率%
__________________________________________________
ER+
25
3
12.0
PR+
8
0
0
ER-
45
34
75.6
PR-
34
22
64.7
ER-、PR-
24
21
87.5
__________________________________________________
受体在医学研究中的应用--受体与疾病
疾病时受体的变化 受体数目的变化 受体亲和力的变化 受体特异性的变化 受体的自身抗体 受体-效应器偶联机理异常
最新核医学课件(本科教育第六章体外分析ppt课件
当RIA反应完成后，于反应液中加入第二抗体，第二抗 体则与含有第一抗体的免疫复合物B相结合形成第二抗体复 合物，其分子量比第一抗体复合物大，可用离心方法分离 出来，称为双抗体法（double antibody method）。
优点：B和F分离较为完全，非特异性结合低，使用方便。
缺点：分离时间长，第二抗体用量多，易受反应环境中蛋 白质及盐含量的影响。
血清的均数±标准差（x±s），画出均数线与两个标准差的
范围，将以后每次实验测定的高、中、低值标在图上，即为 质控图。
WHO要求在一次实验中有下列情况之一者，其结果应舍弃：
① 三种QCS中有一个测定值＞3 SD ； ② 三种QCS中在同一方向上有两种＞2 SD ；
③ 三种QCS均在同一方向上＞1 SD 。
本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间长 和沉淀法非特异性结合高的缺点。
活性炭吸附法(测量F)：
活性炭吸附小分子游离抗原，离心分离后，复合物留 在上清液中，游离抗原在沉淀物中，测量沉淀物中的放射 性F。
优点：本法操作简便，分离速度快，价格低廉。 缺点：易于解离，分离效果时间和温度的影响较大，非特 异性结合较高。
(一)实验室内质量控制：
是一个实验室内部实验方法的质量控制，以便在一个人 的同一批或不同批实验中，不同操作者和不同方法之间有 可比性。 零标准管结合率（B0%）：即最大结合率，指不加非标记抗 原时，标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30%～50%，该 指标主要用来反映标记物与抗体的质量是否稳定。
非特异性结合率（NSB%）：指不加抗体时标记抗原与非特 异物质的结合率，一般要求＜5%～10%。
固相分离法(测量B)： 将抗体或抗原通过特殊技术联结在固相载体上，免疫反
应在固相载体上完成，达到平衡后形成固相的Ag-Ab 复合 物，可与游离部分分离。 优点：操作简便，迅速，分离效果好，非特异性结合低。
优点：B和F分离较为完全，非特异性结合低，使用方便。
缺点：分离时间长，第二抗体用量多，易受反应环境中蛋 白质及盐含量的影响。
血清的均数±标准差（x±s），画出均数线与两个标准差的
范围，将以后每次实验测定的高、中、低值标在图上，即为 质控图。
WHO要求在一次实验中有下列情况之一者，其结果应舍弃：
① 三种QCS中有一个测定值＞3 SD ； ② 三种QCS中在同一方向上有两种＞2 SD ；
③ 三种QCS均在同一方向上＞1 SD 。
本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间长 和沉淀法非特异性结合高的缺点。
活性炭吸附法(测量F)：
活性炭吸附小分子游离抗原，离心分离后，复合物留 在上清液中，游离抗原在沉淀物中，测量沉淀物中的放射 性F。
优点：本法操作简便，分离速度快，价格低廉。 缺点：易于解离，分离效果时间和温度的影响较大，非特 异性结合较高。
(一)实验室内质量控制：
是一个实验室内部实验方法的质量控制，以便在一个人 的同一批或不同批实验中，不同操作者和不同方法之间有 可比性。 零标准管结合率（B0%）：即最大结合率，指不加非标记抗 原时，标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30%～50%，该 指标主要用来反映标记物与抗体的质量是否稳定。
非特异性结合率（NSB%）：指不加抗体时标记抗原与非特 异物质的结合率，一般要求＜5%～10%。
固相分离法(测量B)： 将抗体或抗原通过特殊技术联结在固相载体上，免疫反
应在固相载体上完成，达到平衡后形成固相的Ag-Ab 复合 物，可与游离部分分离。 优点：操作简便，迅速，分离效果好，非特异性结合低。
8、标记免疫分析
（三）、标准品（calibration standard）
标准品是样品定量的基础，它的质和量 的变化会直接影响样品的测定值。 对标准品 的要求包括： （1）标准品与待测物质应属同一物质； （2）在与结合剂发生反应时，应与待测配体 有相等的活性和亲和力； （3）高度纯化，不含影响分析的杂质； （4）标准品的定量一定要准确。
k1和k2分别代表结合速度常数和解离速度常 数，[Ag]、[Ab]、[AgAb]分别代表游离抗原、游 离抗体和抗原抗体复合物的浓度。假设Ab0和Ag0 分别代表抗原、抗体的初始浓度，B和F分别代表 反应平衡时结合和游离抗原的%，（以分数表示， B+F=1），可以推导出B的函数式，
由上式可看出是以B为函数的一元二次方程。 对每一特定的RIA系统，[ Ab0]和KA是固定的， [*Ag0]也是固定的，所以B在直角坐标上随非标记 [ Ag0]呈双曲线走向。
3）亲和力和亲和常数测定：亲和力表 示特定的抗原、抗体之间的结合能力， 常用亲和常数KA来表示。KA越大，表 示抗原、抗体之间结合能力越强，B/F 值大，方法的灵敏度高。 随着单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）技术的发展，提高 了现代体外分析技术的特异性和亲和力。
（二）、放射性标记物 放射性标记物是体外放射分析的测 量依据，常用的标记核素有125I和3H。 对标记物的质量要求包括： （1）比活度（specific activity）：体外 放射分析法的定量范围一般在10-9-1012mol水平，标记物的用量应等于或小于 被测物的最小量，以得到较好的灵敏度。 高比活度的标记物是确保分析方法灵敏 度的前提。
（2）抗血清（antiserum）的质量鉴定： 评价结合剂的主要指标有滴度、特异性和 亲和力。
标记免疫分析的临床应用
标记免疫分析的临床应用标记免疫分析（immunoassay）是一种重要的生物化学分析技术，被广泛应用于临床医学领域。
该技术基于抗原与抗体相互作用的原理，通过标记分子（通常是放射性同位素、荧光物质或酶）来检测目标物质的定性和定量。
本文将介绍标记免疫分析在临床应用中的重要性和应用领域。
一、概述标记免疫分析广泛应用于临床实验室，患者个体化治疗以及疾病筛查等方面。
它在医学诊断中具有快速、灵敏、高特异性、易操作以及适用于大规模筛查等特点，成为了不可或缺的分析工具。
二、肿瘤标志物的检测标记免疫分析在肿瘤标志物的检测中具有重要作用。
肿瘤标志物是指与肿瘤发生有关的具有特异性的生物分子，如PSA（前列腺特异性抗原）、CEA（癌胚抗原）等。
通过标记免疫分析，可以对患者体内的肿瘤标志物进行定量检测，帮助医生进行肿瘤的早期筛查和疾病监测。
三、临床药物浓度监测标记免疫分析可用于监测患者体内药物的浓度。
对于一些药物治疗密切相关的疾病，如抗癫痫药物、抗凝血药物等，通过监测药物的浓度，可以及时调整药物剂量，以达到最佳的治疗效果。
同时，通过标记免疫分析还可以评估患者对药物的反应情况，从而指导治疗方案的制定。
四、感染疾病的诊断标记免疫分析可以用于感染疾病的诊断。
患者体内的病原微生物、细菌、病毒等可通过标记免疫分析方法进行检测。
例如，HIV感染的诊断，采用标记免疫分析方法检测患者血液中的HIV抗体，可以对感染情况进行判定。
此外，标记免疫分析还可用于肠道感染诊断、呼吸道感染等，为临床医生提供指导治疗方案的依据。
五、自身免疫性疾病的诊断在自身免疫性疾病的诊断中，标记免疫分析也扮演着重要角色。
自身免疫性疾病包括风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺疾病等。
通过检测自身抗体的水平，可以对患者的免疫状态做出评估，并进行疾病的诊断和指导治疗。
六、选择合适的标记物在标记免疫分析中，选择合适的标记物非常重要。
标记物的选择要满足灵敏度高、特异性强、稳定性好等要求。
免疫分析标记技术
免疫分析标记技术摘要:较系统地综述了目前应用于免疫分析检测中的各种标记技术:放射物标记、酶标记、发光标记、荧光标记和金标记方法的原理、特点及免疫检测现状,同时对免疫分析标记技术的发展进行展望。
关键词:免疫分析,标记技术,研究进展Abstract: Various labeled technique that have been app lied immunoassay presently was introduced, including labeled radiation, labeled enzyme, labeledlum inophor, labeled fluorescein and labeled paramagnetic-particle along with their principle characteristic and actuality of immunoassay, and their prospects were also discussed in this paper.Keywords: immunoassay; labeled technique; research progress免疫分析标记技术是指以抗原抗体间的特异性反应为基础,研究标记以各种标记物(定量信号)来对某种物质进行定性或定量检测的研究。
标记免疫分析[1]一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记,这种标记物既保持了抗体或抗原的活性,也不影响标记物的活性,当它与相应抗体或抗原反应后,可以直接测定复合物中的标记物,从而直接对目标物质进行定量分析。
通过标记物的信号放大作用,可以提高免疫分析技术的敏感性。
随着全世界对食品安全问题的关注程度越来越高,食品中污染物和危害物的检测日益重要,这就需要快速、准确、灵敏、能进行多组分分析的检测技术[2]。
免疫学检测技术以其特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点,已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。
§7.3标记免疫分析
用酶标记抗原后，酶保持它的生物活性。当酶标抗 原与抗体反应后，酶的活性由于空间立体阻碍或构 象改变而被抑制（图7.7）。这种抑制随着游离抗 原浓度的增加而减弱，因而酶的活性及其催化产物 所给出的信号也就越强，利用标准曲线可测定抗原 浓度。
图7.7 酶放大免疫技术检测原理示意图
另一个均相免疫分析体系是利用磷光偏振技术， 又称荧光偏振免疫分析（FPIA）。荧光物质经一 平面的偏振光照射后，可跃入激发态，当其释放 能量回到基态时，便发出偏振荧光。荧光偏振强 度与荧光物质受激发时分子转动速度成反比。分 子越大，旋转越慢，发出的偏振光越强。荧光偏 振免疫技术中偏振光强度的变化如图7.8所示。
图7.8 FPIA原理示意图
§7. 3. 3 放射免疫分析 如前文所述，放射免疫分析（RIA）是最早 建立的标记免疫分析方法，它是将同位素标记技 术与抗原抗体反应相结合的一种微量分析方法， 广泛用于激素、药物、细胞因子、抗体、肿瘤标 志物等化合物的定量分析，检测范围可达10-9～ 10-12 ng mL-1，是灵敏、可靠的免疫分析方法之 一，现已有300多种微量物质用此法测定。
常用来标记抗原或抗体的同位素有125I，131I，3H和 35S。放射活性检测用液体闪烁计数，固相体系则 用X射线胶片显影。 在临床上将利用放射同位素标记抗原通过竞 争法原理进行测定的方法称为放射免疫分析 （RIA），而将放射性同位素标记抗体，利用夹心 法检测的方法称为免疫放射分析（IRMA）。
放射免疫分析的原理是用已知的标记抗原与标本中 可能存在的抗原竞争一定量的已知抗体，分别形成 标记的抗原抗体结合物（B）和无标记的抗原抗体 结合物（F）。然后将两者分离，并根据测得的放 射性强度，算出结合率[B/（B十F）]，它与标本中 抗原的量成反比。实验时除作标本检测外，还要以 不同浓度的已知抗原参与反应得到的数据给出竞争 抑制曲线，作为定量分析的依据。
体外分析技术(共63张PPT)
体外分析技术是结合了放射性核素的高灵 敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微 量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密 度好、应用面广、方法简便等优点。
方法学基础
结合反应
遵守可逆反应的质量作用定律：
k1, v1
[R]+[L]
[RL]
k2, v2
定量手段
➢放射性测量技术 ➢酶定量技术 ➢化学发光定量技术
待测物质浓度与检测手段
超微量
10-12
pg/mL
10-9
ng/mL
微量
常量
10-6
mg/mL
临床化学分析
10-3
10-0
mg/mL
g/L
免疫分析
Therapeutic Drugs
Thyroid Hormone
Fertility Hormone
Allergy Cancer Markers
Infectious Disease
化学发光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术
酶标记免疫分析技术
用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体 ，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。 其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ ELISA）。
是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的 高敏感性的检测技术。
ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与 IRMA相似的夹心法免疫反应，反应结束后分 离结合部分和游离部分，利用结合部分上的 酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色 ，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成 正比，而酶量又和复合物的量成正比。
Ag-Ab
※Ag-Ab
改变标记物
第一阶段
荧光 — FIA — IRMA
化学发光— CIA
酶 — EIA
第六章-体外标记免疫分析
体外标记免疫分析
鼻祖:
(Yalow,July 19, 1921 –)
美国科学家Yalow和Berson。 于1956年创建的放射免疫分析(RIA)，测定人血浆胰岛素 获得成功。树立了超微量物质体外标记免疫分析的里程碑。 1968年，Miles和Hales建立了免疫放射分析(IRMA)。
体外标记免疫分析
免疫放射分析(IRMA)原理
单位点： Ag + *Ab (Ag-*Ab) + *Ab
抗原（待测） 标记抗体 抗原标记抗体复合物
双位点： Ad-Ag + *Ab Ad-Ag-*Ab
固体抗体-抗原（待测） 标记抗体 固体抗体-抗原-标记抗体复合物
IRMA(非竟争结合)反应原理
IRMA(非竟争结合)剂量反应曲线
固相分离法 微孔滤膜法 双抗体法
分离方法
盐析法
活性炭吸附法
磁化颗粒法
第三节 体外标记免疫分析的类型
体外标记免疫分析的类型
体外标记免疫分析
放射性核素标记 免疫分析
(RIA、 IRMA)
酶标记 免疫分析
时间分辩荧光 免疫分析
发光标记 免疫分析
(化学发光标记免疫分析 化学发光酶免疫分析 电化学发光免疫分析)
RIA ＆ IRMA 的区别
方法
1.标记 2.免疫反应式 3.Ab 4.竞争 5.测量复合物
RIA
*Ag
IRMA
*Ab
Ag+*Ag+Ab *Ag-Ab+Ag 限量 竞争
*Ag-Ab
Ag+*Ab Ag-*Ab+*Ab 过量 非竞争 Ag-*Ab
6.测量物计数值与标本含量
7.标准曲线形态 8.灵敏度 9.测量范围
标记免疫分析临床意义简介-PPT精品文档98页
甲状腺机能指标评价及临床意义
二 甲状腺机能的相关激素：
１ ＴＳＨ： 理想的甲功实验与甲状腺功能失调呈一致行变化，由
于过量的甲状腺激素是ＴＳＨ分泌最重要的生理性抑制因子。因 此ＴＳＨ是甲亢最重要的实验室诊断指标之一。
2 影响ＴＨＳ水平的因素：
脉冲式分泌，禁食，疾病及手术后减低
昼夜节律周期：夜间入睡后有分泌高峰
ＴＳＨ↑ ③甲状腺疾病治疗中的监测指标 ④甲状腺疾病的筛查，包括新生儿先天性甲减的筛查 ⑤甲减用甲状腺素治疗后需４－６周才能使ＴＳＨ恢复正常 ⑥甲亢用抗甲药物治疗后需数月（２－６）或更长
甲状腺机能指标评价及临床意义
4 ＴＴ３、ＴＴ４、ＦＴ３、ＦＴ４：
⑴Ｔ４和Ｔ３的分泌与结合情况：
Ｔ４：全部由甲状腺分泌而来
取率↓：高碘甲亢或亚甲炎急性期。 ﹡FT3 TT3（一），FT4 TT4↓，TSH（一）↓或↑，垂体性
甲低症，由于垂体分泌无生物活性TSH所致。Βιβλιοθήκη 甲状腺机能指标评价及临床意义
FT3 TT3，FT4 TT4，TSH均↑：
※选择性垂体对甲状腺激素无反应：垂体前叶缺陷。使T4 转化T3不足造成TSH过量分泌，继而促使甲状腺素合成 分泌增加。临床上表现为高TSH甲亢。 ※ 垂体性甲亢—垂体TSH瘤。 ※异位TSH症候群：绒癌，葡萄胎等多种肿瘤细胞可能分 泌TSH，原发病 灶在肿瘤。 ※选择性外周组织对甲状腺激素不应症：外周组织受体 （主要是T3受体）异常使甲状腺素不能完全发生生理反 应，但垂体对T3，T4仍有负反馈反应，故血T3 T4↑
机能改变。
甲状腺机能指标评价及临床意义
临床意义：
＊大部分未经治疗的毒性弥漫性甲状腺肿（GB）患者TRAB阳性， 可能同时存在TSAB和TSBAB两种抗体,其比例变化则影响甲状腺功 能的变化。
第六章 免疫标记技术
E：酶 D1：供氢体 S：酶作用的底物 P：底物分解后的产物（有色化合物） D2：为D1的氧化型（有色化合物）
优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用 于普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位 素污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测， 且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。 缺点： 标记反应较难掌握，容易引起蛋白失活。
（1）试剂要求
①能使B和F完全分离 ②不受外界因素的干扰 ③与游离抗原的非特异性作用尽可能小 ④操作简便、分离迅速、重复性好 ⑤来③盐析法 ④层析电泳法 ⑤固相法
①双抗体法
加入第二抗体使微量抗原抗体复 合物的分子加大，从而使原来不能 用普通离心法沉淀的抗原抗体复合 物易于沉淀而分离。 本法为目前应用最广泛的分析方法
第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节免疫酶技术第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节免疫酶技术一放射免疫技术的原理二建立放射免疫技术必备的条件三放射免疫技术的基本方法一放射免疫技术的原理二建立放射免疫技术必备的条件三放射免疫技术的基本方法放射免疫技术radioimmunoassayria1977年获诺贝尔生理和医学奖特异性强即抗原抗体的特异性反应灵敏度高结果精确检测范围为1091012操作流程简单易行加样程序简单测量和数据处理自动化样品用量少一般无需复杂的提纯步骤应用范围广泛尤其是测量小分子半抗原需要昂贵的检测仪器
RIA测定原理
放射免疫技术的原理
是建立在标记抗原（或配体） 和待测抗原（或配体）对有限量的 特异性抗体（或受体）的竞争性抑 制反应基础上的，最终形成的放射 性标记复合物与被测配体（或抗原） 呈负相关，因而亦称竞争性放射免 疫技术。
优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用 于普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位 素污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测， 且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。 缺点： 标记反应较难掌握，容易引起蛋白失活。
（1）试剂要求
①能使B和F完全分离 ②不受外界因素的干扰 ③与游离抗原的非特异性作用尽可能小 ④操作简便、分离迅速、重复性好 ⑤来③盐析法 ④层析电泳法 ⑤固相法
①双抗体法
加入第二抗体使微量抗原抗体复 合物的分子加大，从而使原来不能 用普通离心法沉淀的抗原抗体复合 物易于沉淀而分离。 本法为目前应用最广泛的分析方法
第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节免疫酶技术第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节免疫酶技术一放射免疫技术的原理二建立放射免疫技术必备的条件三放射免疫技术的基本方法一放射免疫技术的原理二建立放射免疫技术必备的条件三放射免疫技术的基本方法放射免疫技术radioimmunoassayria1977年获诺贝尔生理和医学奖特异性强即抗原抗体的特异性反应灵敏度高结果精确检测范围为1091012操作流程简单易行加样程序简单测量和数据处理自动化样品用量少一般无需复杂的提纯步骤应用范围广泛尤其是测量小分子半抗原需要昂贵的检测仪器
RIA测定原理
放射免疫技术的原理
是建立在标记抗原（或配体） 和待测抗原（或配体）对有限量的 特异性抗体（或受体）的竞争性抑 制反应基础上的，最终形成的放射 性标记复合物与被测配体（或抗原） 呈负相关，因而亦称竞争性放射免 疫技术。
标记免疫分析技术1
体外分析技术
郑州大学第一附属医院核医学 阮 翘
临床核医学
临床核医学 诊断
治疗 体内检查法
功能（非显像）测定
体外分析技术
放射性核素显像
体外分析技术
体外放射分析 体外非放射分析
一.体外放射分析（in vitro radioassay）
(一）.概要： 1. 定义： 指在体外实验条件下，以结合反
（3）沉淀加双抗法
双抗体法非特异结合低，但所需时间长， 抗体用量大，PEG法操作简便快速，但非特异 结合高。 采用双抗体与 PEG 联合使用，它既兼顾了 双抗体法和沉淀法的优点，又克服了两者的缺 点，使分离更快速，非特异结合低，二抗用量 少，此方法目前已被广泛应用。
（4）固相法(solid phase method)
2. 标记抗原(labelled antigen)：
a.放射性核素的选择--125I ，3H，14C ；
b.标记抗原与未标记抗原免疫活性一致；
c.标记抗原有一定比度（比度指单位质量物质 所具有的放射性强度 KBq/ug）； d.放射化学纯度（标记抗原放射性占总放射性 的百分比）：要求大于95%。
3.特异性抗体(specific antibody)
2. 特点
（1）灵敏度高（10-9~~10-15 g) 灵敏度是指可以检测到的最小化学量。 （2）特异性强 特异性是指测量方法中所用的抗体或结合 剂对被测物质特异结合的性质，也是指它的专 一性。 （3）放射性核素不引入人体。 （4 )操作简单，样品用量少，应用范围广。
（二）.基本原理
（以放射免疫分析为例）
标记抗原(labelled antigen)；
特异性抗体(specific antibody ); 合适的分离技术(separation method).
郑州大学第一附属医院核医学 阮 翘
临床核医学
临床核医学 诊断
治疗 体内检查法
功能（非显像）测定
体外分析技术
放射性核素显像
体外分析技术
体外放射分析 体外非放射分析
一.体外放射分析（in vitro radioassay）
(一）.概要： 1. 定义： 指在体外实验条件下，以结合反
（3）沉淀加双抗法
双抗体法非特异结合低，但所需时间长， 抗体用量大，PEG法操作简便快速，但非特异 结合高。 采用双抗体与 PEG 联合使用，它既兼顾了 双抗体法和沉淀法的优点，又克服了两者的缺 点，使分离更快速，非特异结合低，二抗用量 少，此方法目前已被广泛应用。
（4）固相法(solid phase method)
2. 标记抗原(labelled antigen)：
a.放射性核素的选择--125I ，3H，14C ；
b.标记抗原与未标记抗原免疫活性一致；
c.标记抗原有一定比度（比度指单位质量物质 所具有的放射性强度 KBq/ug）； d.放射化学纯度（标记抗原放射性占总放射性 的百分比）：要求大于95%。
3.特异性抗体(specific antibody)
2. 特点
（1）灵敏度高（10-9~~10-15 g) 灵敏度是指可以检测到的最小化学量。 （2）特异性强 特异性是指测量方法中所用的抗体或结合 剂对被测物质特异结合的性质，也是指它的专 一性。 （3）放射性核素不引入人体。 （4 )操作简单，样品用量少，应用范围广。
（二）.基本原理
（以放射免疫分析为例）
标记抗原(labelled antigen)；
特异性抗体(specific antibody ); 合适的分离技术(separation method).
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放射性核素标记免疫分析
概念： 一种将放射性核素测量的高灵敏性、高精确
性和抗原抗体反应的高特异性相结合的体外测定 超微量（10-9～10-15g）物质的新技术。
IRMA(非竟争结合)反应原理
IRMA(非竟争结合)剂量反应曲线
RIA ＆ IRMA 的区别
方法
RIA
1.标记
*Ag
2.免疫反应式
Ag+*Ag+Ab *Ag-Ab+Ag
3.Ab
限量
4.竞争 5.测量复合物 6.测量物计数值与标本含量 7.标准曲线形态
竞争 *Ag-Ab 呈反比╲来自8.灵敏度较低
9.测量范围
较窄
IRMA
*Ab Ag+*Ab Ag-*Ab+*Ab
过量 非竞争 Ag-*Ab 呈正比
╱ 高 较宽
第二节 体外标记免疫分析的基本试剂和 基本技术
基本试剂和基本技术
１. 标准品、质控品 ２. 特异性抗体 ３. 示踪剂(标记品) ４. 分离技术
１. 标准品
(1)化学结构: 应与待测物具有相同的化学结构 (2)化学纯度：高度纯化 (3)化学度量： 准确 (4)稳定性：不易变质、不易降解
核医学
核医学
第六章 体外标记免疫分析
体外标记在核医学中的地位
体内诊断：脏器显像
功能测定
诊断 体外诊断：放射分析
临床核医学 治疗：131I治疗甲亢
核医学
实验核医学：利用核技术探索生命现象的本质和物
质变化规律
体外标记免疫分析
体外标记免疫分析是一门综合性学科，也是一 门边缘学科。是集基础医学、实验医学及临床应用 于一体的学科。在当前的各种免疫诊断技术中，标 记免疫分析是最活跃、发展最快的一个领域。
依所测得的复合物的放射性计数(CPM)，对比标准品剂量反应曲线，求知待测品的含量
免疫放射分析(IRMA)原理
单位点： Ag + *Ab (Ag-*Ab) + *Ab
抗原（待测） 标记抗体 抗原标记抗体复合物
双位点： Ad-Ag + *Ab Ad-Ag-*Ab
固体抗体-抗原（待测） 标记抗体 固体抗体-抗原-标记抗体复合物
固相分离法
微孔滤膜法
双抗体法
分离方法
盐析法
磁化颗粒法
活性炭吸附法
第三节 体外标记免疫分析的类型
体外标记免疫分析的类型
体外标记免疫分析
放射性核素标记 免疫分析
(RIA、 IRMA)
酶标记 免疫分析
时间分辩荧光 免疫分析
发光标记 免疫分析
(化学发光标记免疫分析 化学发光酶免疫分析 电化学发光免疫分析)
实验操作步骤： 加样（Ag，*Ag，Ab) →混匀，温育（反应达到平
衡）→分离→测量→数据处理，质量控制
测量复合物计数示意图：
测量
光子(射线能)与闪烁体的作用 ↓
闪烁体(光脉冲、光能) ↓
光电倍增管(电能) ↓
前置放大器(电脉冲) ↓
电子探测仪
（计数单位是探测器输出的电脉冲数，CPM或CPS）
RIA(竞争性结合)标准品剂量反应曲线
２. 特异性抗体
(1)亲和力大 (2)高滴度 (3)特异性强 (4)可长期保存
３. 示踪剂（标记品）
（1）高比活度 （2）生物活性与免疫活性与标记前一致 （3）化学纯度>95% （4）稳定性好：标记品不易脱落
４. 分离技术---要求
(1)结合部分与游离部分尽可能完全分开 (2)非特异性结合率（NSB%）低，小于5% (3)分离的成分便于测量 (4)分离效果不受外界环境影响 (5)分离试剂操作简便、价廉易得
体外标记免疫分析
鼻祖:
(Yalow,July 19, 1921 –)
美国科学家Yalow和Berson。 于1956年创建的放射免疫分析(RIA)，测定人血浆胰岛素 获得成功。树立了超微量物质体外标记免疫分析的里程碑。 1968年，Miles和Hales建立了免疫放射分析(IRMA)。
体外标记免疫分析
体外标记免疫分析
发展:
电化学发光免疫分析 化学发光酶免疫分析
化学发光标记免疫分析
时间分辨荧光免疫分析
酶标记免疫分析
放射受体分析
免疫放射分析
放射免疫分析
体外标记免疫分析
分类
竞争放射结合分析：标记抗原，抗体限量 非竞争放射结合分析：标记抗体，抗体过量
第一节 体外标记免疫分析的基本原理
体外标记免疫分析
获奖:
在1977年Yalow和Berson因创建了放射免疫 分析，使微量物质的测定成为可能，而荣获诺贝 尔生物医学奖 。
体外标记免疫分析
贡献: 随着基础医学和相关技术的发展，在RIA标记
抗原竞争性抑制结合、IRMA标记抗体非竞争性结 合的理论基础上，相继派生出许多其它的标记免 疫分析方法，如酶标记免疫分析、时间分辨荧光 免疫分析、化学发光免疫分析、电化学发光免疫 分析等多种形式、多种反应模式的综合性标记免 疫分析体系，并广泛应用于基础医学、临床医学 、教学及科研诸多领域，有力地推动了医学科学 的发展。
体外标记免疫分析
概念： 是利用放射分析方法或其派生的相关
非放射分析技术测定生物样品中微量生物 活性物质含量的一类分析方法。
体外标记免疫分析
特点：
利用抗原－抗体结合反应的特异性，加上 各种标记物（标记抗原或抗体）的可测量性来 达到方便敏感地检测各种体内微量生物活性物 质，包括内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、 神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、 肿瘤标志物、血药浓度等。
Ag １. *Ag:定量、足量 ２. Ab:限量、特异 ３. *Ag和Ag具有相同的免疫活性 ４. Ag+ *Ag>Ab的有效结合位点 ５. *Ag和Ag通过竞争的方式与Ab 结合，随着Ag增加， *Ag与Ab结合 形成的*AgAb复合物的量减少
Ag* Ab
C
FAg* B F B/F
放射免疫分析（RIA）
基本原理:
体 外 标 记 免 疫 分 析
竞争性(标记抗原) RIA
非竞争性(标记抗体) IRMA
放射免疫分析（RIA）原理
放射免疫技术是标记抗原与未标抗原竞争有限量 的抗体，然后通过测定标记抗原抗体复合物中放 射性强度的改变，测定出未标记抗原量。
放射免疫分析（RIA）原理 放射免疫分析（RIA）原理
Ag
待测抗原
+ *Ag + Ab *AgAb + *Ag
(标记抗原) (特异性抗体) (标记抗原抗体复合物) (游离的标记抗原)
AgAb + Ag
抗原抗体复合物
标记抗原(*Ag)和非标记原(Ag)与限量抗体(Ab)竞争结合。 *Ag和Ag具有相同的与 Ab结合的能力
RIA(竞争结合反应)原理示意图