实验三植物染色体畸变的观察
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二）、孚尔根(Feulgen)核染色法原理
• 细胞内的DNA在1mol/L HCl 60℃水解时部分地破 坏了脱氧核糖与嘌呤碱基之间的糖苷键而使嘌呤碱 基脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的 醛基暴露。 • 无色的亚硫酸品红（Schiff试剂）是由偏重亚硫酸 钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐 酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分 子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打开， 碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去 染色经酸解的细胞时，就会与染色体DNA上游离的 醛基结合，又出现了醌式结构，从而使DNA着色， 使染色体呈现出红色。
实验内容之二：
1. 学生自行设计处理方案，用化学药剂或特定污 染物处理洋葱或大蒜根尖细胞，观察细胞有丝 分裂时染色体畸变（微核、粘连、聚结、断裂 等）。
（二）、 实验步骤
内容之一 植物多倍体人工诱发及鉴定
1．根尖培养 将洋葱或大蒜刮去老根，室内水培养至新根长出 0.5～1.0cm左右。 2．多倍体诱导 当洋葱或大蒜新根长至0.5～1.0cm左右时，用含 0.01～0.05%秋水仙素的水溶液，置阴暗处培养 4h～2d，及时观察，至根尖膨大为止，再恢复生长 （学生查阅资料，自主设计秋水仙素浓度梯度和时 间梯度处理洋葱根尖）。
四、实验内容和步骤
（一）、实验内容之一：
1. 用秋水仙素诱发植物产生多倍体； 2. 通过取材、固定、解离、孚尔根染色法制片、 镜检观察。以室温酸解洋葱根尖材料与60C酸 解做对照，用醋酸洋红/改良石碳酸品红染色方 法与孚尔根染色法作对照； 3. 找出根尖细胞中期分裂相，确定诱发成功的细 胞，观察加倍根尖细胞的染色体数目。
* 孚尔根染色法的优点是制片清洁，染色体清晰， 组织软化好，易于压片。其缺点是，染色体较软， 容易缠绕，不易分散，在加强前处理使染色体缩短 的情况下，可获得较好的效果。
三）、细胞微核测试原理
• 微核(micronuclei, MCN) 是真核类生物细胞中的 一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的 作用而产生的。 • 一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断 片产生的，整条染色体或几条染色体也能形成微 核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子 细胞核所排斥便形成第三个核块。即在间期细胞 形成时，核附近出现的一到几个很小的圆形结构， 直径大约是主核1/3以下呈圆形、椭圆形或不规则 形，这就是微核（micronucleus） • 微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、 新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各 方面,是一种比较理想的方法。
三、材料及用品
1、材料 洋葱/大蒜（2n=16），刮去老根，放在小烧杯上， 加水至刚与根部接触为止，室内培养至新根长出 0.5～1.0cm左右。分2组分别用于多倍体诱发和微 核测试。 2、器具及药品 (1) 器具 恒温培养箱，电热恒温水浴槽，显微镜，磨口带 塞试管，镊子，刀片，载玻片，盖玻片，吸水纸。 (2) 药品 0.01%～0.05%的秋水仙素水溶液，卡诺氏固定 液，1mol/L HCL，希夫（Schiff）试剂，10%偏重 亚硫酸钠，1%醋酸洋红等
7． 压片 取根尖置于载玻片上，取分 生区组织长约0.5mm，压碎， 加盖玻片，覆以吸水纸压片； 必要时敲击盖玻片以利分散。 8．观察 低倍镜下寻找染色体分散良 好的分裂相，换高倍镜观察并 计数染色体数目，鉴别染色体 加倍的细胞和未加倍的细胞。
内容之二
植物细胞的微核检测
1、根尖培养：将洋葱或大蒜刮去老根，室内水培养至 新根长出0.5～1.0cm左右。 2、处理根尖：阳性检测采用 CrO3/ NaN3/ EMS，另外 自我设计1-2种测试物，对照用自来水/蒸馏水处理， 处理时间24h。（必要时测试物浓度需稀释，以免根尖腐烂） 3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次23min，洗净后在水中恢复培养24h。 4、固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后 弃去固定液，或换入70％酒精中保存。 5、酸解：弃去固定液，用清水漂洗2-3次，吸净水，加 入6 mol/L盐酸，于室温解离10min，弃去盐酸，漂 洗根尖2-3次，彻底洗净盐酸。 6、染色：截下0.5-1mm长的根尖，滴加石炭酸品红染 液，染色10min，加盖玻片，压片观察。
二、实验原理 一）、植物多倍体人工诱发原理
• 生物的染色体数目一般是相当稳定的，这是物种遗 传稳定性的重要特征之一。遗传学上把二倍体生物的 一个配子的染色体数，称为染色体组。具有两个完整 染色体组的生物体或细胞称为二倍体，自然存在的生 物多属于二倍体，核内多于两个染色体组的生物体则 称为多倍体。其中增加的染色体组来自同一物种或者 是源于染色体组加倍，称为同源多倍体。 • 自然界存在多倍体物种，此外可通过人工诱导产生 多倍体植物。如秋水仙素、对二氯苯等都可用于诱发 多倍体，其中以秋水仙素效果最好，使用最为广泛。 其主要作用原理是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使 染色体不能移向两极而被阻止在分裂中期，这样细胞 不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。
3．固定 恢复生长的根尖用蒸馏水冲洗并用卡诺氏固定液 (无水乙醇:冰醋酸=3:1) 固定2～24h备用。 4．解离 固定好的根尖，加入适量预热的1 mol/L盐酸， 60C水浴8-10分钟。同时以室温下的盐酸解离根尖 作对照。 5．染色 将解离过的材料水洗3次，吸净水分，加入希夫 试剂，盖好磨口试管塞，染色10分钟（在黑暗条件 下处理）。 以室温下酸解和1%醋酸洋红染色作对照。 6． 漂洗 希夫试剂染色后，先用蒸馏水冲洗，再用漂洗液 密封漂洗3次，每次2～5分钟，再水洗2～3次。
一、实验目的
1. 了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植 物育种上的意义，并用秋水仙素诱发植物产生多 倍体； 2. 学会利用feulgen染色方法鉴定细胞中DNA分布 及鉴别人工诱导后植物染色体数目的变化；为学 习植物遗传育种学和从事有关农作物育种工作奠 定基础。 3. 通过观察染色体压片，找出根尖细胞中期分裂相， 确定诱发成功的细胞，观察加倍根尖细胞的染色 体数目。 4．学会通过检查染色体畸变情况评价环境污染的 细胞遗传学简易方法。
二）、孚尔根(Feulgen)核染色法原理
• 细胞内的DNA在1mol/L HCl 60℃水解时部分地破 坏了脱氧核糖与嘌呤碱基之间的糖苷键而使嘌呤碱 基脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的 醛基暴露。 • 无色的亚硫酸品红（Schiff试剂）是由偏重亚硫酸 钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐 酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分 子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打开， 碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去 染色经酸解的细胞时，就会与染色体DNA上游离的 醛基结合，又出现了醌式结构，从而使DNA着色， 使染色体呈现出红色。
实验内容之二：
1. 学生自行设计处理方案，用化学药剂或特定污 染物处理洋葱或大蒜根尖细胞，观察细胞有丝 分裂时染色体畸变（微核、粘连、聚结、断裂 等）。
（二）、 实验步骤
内容之一 植物多倍体人工诱发及鉴定
1．根尖培养 将洋葱或大蒜刮去老根，室内水培养至新根长出 0.5～1.0cm左右。 2．多倍体诱导 当洋葱或大蒜新根长至0.5～1.0cm左右时，用含 0.01～0.05%秋水仙素的水溶液，置阴暗处培养 4h～2d，及时观察，至根尖膨大为止，再恢复生长 （学生查阅资料，自主设计秋水仙素浓度梯度和时 间梯度处理洋葱根尖）。
四、实验内容和步骤
（一）、实验内容之一：
1. 用秋水仙素诱发植物产生多倍体； 2. 通过取材、固定、解离、孚尔根染色法制片、 镜检观察。以室温酸解洋葱根尖材料与60C酸 解做对照，用醋酸洋红/改良石碳酸品红染色方 法与孚尔根染色法作对照； 3. 找出根尖细胞中期分裂相，确定诱发成功的细 胞，观察加倍根尖细胞的染色体数目。
* 孚尔根染色法的优点是制片清洁，染色体清晰， 组织软化好，易于压片。其缺点是，染色体较软， 容易缠绕，不易分散，在加强前处理使染色体缩短 的情况下，可获得较好的效果。
三）、细胞微核测试原理
• 微核(micronuclei, MCN) 是真核类生物细胞中的 一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的 作用而产生的。 • 一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断 片产生的，整条染色体或几条染色体也能形成微 核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子 细胞核所排斥便形成第三个核块。即在间期细胞 形成时，核附近出现的一到几个很小的圆形结构， 直径大约是主核1/3以下呈圆形、椭圆形或不规则 形，这就是微核（micronucleus） • 微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、 新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各 方面,是一种比较理想的方法。
三、材料及用品
1、材料 洋葱/大蒜（2n=16），刮去老根，放在小烧杯上， 加水至刚与根部接触为止，室内培养至新根长出 0.5～1.0cm左右。分2组分别用于多倍体诱发和微 核测试。 2、器具及药品 (1) 器具 恒温培养箱，电热恒温水浴槽，显微镜，磨口带 塞试管，镊子，刀片，载玻片，盖玻片，吸水纸。 (2) 药品 0.01%～0.05%的秋水仙素水溶液，卡诺氏固定 液，1mol/L HCL，希夫（Schiff）试剂，10%偏重 亚硫酸钠，1%醋酸洋红等
7． 压片 取根尖置于载玻片上，取分 生区组织长约0.5mm，压碎， 加盖玻片，覆以吸水纸压片； 必要时敲击盖玻片以利分散。 8．观察 低倍镜下寻找染色体分散良 好的分裂相，换高倍镜观察并 计数染色体数目，鉴别染色体 加倍的细胞和未加倍的细胞。
内容之二
植物细胞的微核检测
1、根尖培养：将洋葱或大蒜刮去老根，室内水培养至 新根长出0.5～1.0cm左右。 2、处理根尖：阳性检测采用 CrO3/ NaN3/ EMS，另外 自我设计1-2种测试物，对照用自来水/蒸馏水处理， 处理时间24h。（必要时测试物浓度需稀释，以免根尖腐烂） 3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次23min，洗净后在水中恢复培养24h。 4、固定：用甲醛：冰醋酸（3：1）固定液固定24h后 弃去固定液，或换入70％酒精中保存。 5、酸解：弃去固定液，用清水漂洗2-3次，吸净水，加 入6 mol/L盐酸，于室温解离10min，弃去盐酸，漂 洗根尖2-3次，彻底洗净盐酸。 6、染色：截下0.5-1mm长的根尖，滴加石炭酸品红染 液，染色10min，加盖玻片，压片观察。
二、实验原理 一）、植物多倍体人工诱发原理
• 生物的染色体数目一般是相当稳定的，这是物种遗 传稳定性的重要特征之一。遗传学上把二倍体生物的 一个配子的染色体数，称为染色体组。具有两个完整 染色体组的生物体或细胞称为二倍体，自然存在的生 物多属于二倍体，核内多于两个染色体组的生物体则 称为多倍体。其中增加的染色体组来自同一物种或者 是源于染色体组加倍，称为同源多倍体。 • 自然界存在多倍体物种，此外可通过人工诱导产生 多倍体植物。如秋水仙素、对二氯苯等都可用于诱发 多倍体，其中以秋水仙素效果最好，使用最为广泛。 其主要作用原理是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使 染色体不能移向两极而被阻止在分裂中期，这样细胞 不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。
3．固定 恢复生长的根尖用蒸馏水冲洗并用卡诺氏固定液 (无水乙醇:冰醋酸=3:1) 固定2～24h备用。 4．解离 固定好的根尖，加入适量预热的1 mol/L盐酸， 60C水浴8-10分钟。同时以室温下的盐酸解离根尖 作对照。 5．染色 将解离过的材料水洗3次，吸净水分，加入希夫 试剂，盖好磨口试管塞，染色10分钟（在黑暗条件 下处理）。 以室温下酸解和1%醋酸洋红染色作对照。 6． 漂洗 希夫试剂染色后，先用蒸馏水冲洗，再用漂洗液 密封漂洗3次，每次2～5分钟，再水洗2～3次。
一、实验目的
1. 了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植 物育种上的意义，并用秋水仙素诱发植物产生多 倍体； 2. 学会利用feulgen染色方法鉴定细胞中DNA分布 及鉴别人工诱导后植物染色体数目的变化；为学 习植物遗传育种学和从事有关农作物育种工作奠 定基础。 3. 通过观察染色体压片，找出根尖细胞中期分裂相， 确定诱发成功的细胞，观察加倍根尖细胞的染色 体数目。 4．学会通过检查染色体畸变情况评价环境污染的 细胞遗传学简易方法。