色谱分离度及其优化简介

色谱分离度及其优化简介黄秋鑫（学号：200728016537055）中国科学院广州地球化学研究所摘要： 本文介绍色谱分离度的含义、影响分离度因素及常用优化离子色谱分离度方法，对实际应用色谱法有一定的启发与帮助。

关键词： 色谱法 分离度 优化一、分离度的定义分离度（resolution ）又称分辨率[1]，为了判断难分离物质对在色谱柱中的分离情况，常用分离度作为柱的总分离效能指标，是全面反映两峰分离程度的参数。

分离度等于相邻两峰保留时间之差与两组分色谱峰的峰底宽度之和的一半的比值： ())()()()(21B b A b A R B R t t R ωω+-= 或 ⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛+-=)(21)(21)()(699.1)(2B A A R B R t t R γγ相邻两组分保留时间的差值反映了色谱分离的热力学性质；色谱峰的宽度则反映了色谱过程的动力学因素。

因此分离度概括了这两方面的因素，并定量地描述了混合物中相邻两组分的实际分离程度，因此用它作为色谱柱的总分离效能的指标。

当两峰等高，峰开对称且符合正态分布时，可以从理论上证明，若R=0.8时，分离程度89％；R=1.0时，4δ分离（峰间距4δ），分离度达98%；R=1.5时，6δ分离，分离度达99.87%。

一般采用R=1.5作为相邻两峰完全分离的标志。

图1从图1中可以看出，(c)中A/B 两峰完全分离。

实现分离的条件：相对保留值a 增大（组分分配比之差△K D 增大），分离的可能性增大，其峰间距也增大；柱效能n 增大，峰宽减小。

二、色谱基本分离方程式假设相邻两峰的峰底宽度相等，即ωb(1)=ωb(2)()()()⎪⎭⎫ ⎝⎛-⎪⎭⎫ ⎝⎛+=⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛-⎪⎭⎫ ⎝⎛+=-⎪⎭⎫ ⎝⎛+=⎪⎭⎫ ⎝⎛+=∴⎪⎭⎫ ⎝⎛+===∴⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛=-=-=-=-=+-=ααωωωωωωωωω1'1'411'1'411'1'41'1'41','1'4116','161''1'''''''2122,12,122,122)2()2(2)2()2(22,1)2()2()2()2(2,1)2()2()2()1()2()2()2()1()2()1()2()1()2(k k n r r k k n r k k n R k k n t k k n n n n t t n r t t r t t t t t t t t t R b R effeff eff b R b R effb R R b R b R R R R b R R b b R R 又 其中：n 为色谱柱效；k ’为分配比；α=r 1,2为相对保留值；t 为保留时间；t ’为相对保留时间；ω为峰宽。

上式称为基本分离方程式，是色谱分析中最重要的方程式之一，可以计算给定体系所能达到的分离度和达到某一分离度所需的色谱柱长。

三、影响分离度的因素从色谱基本分离方程式中可以看出，分离度R 的主要影响因素有以下：3.1 色谱柱效n随着n 增大，2n 增大，R 也随着增大。

增加n 的方法：①降低H ，制备性能优良的柱子，在最优化的条件下操作；②增加柱长：a.若系统压力不变，则必须降低流速； b. 若分析时间不变，则必须增大柱压，对设备要求提高。

3.2 相对保留值α α增大，αα1-也随着增大（但＜1），柱选择性提高，R 增大。

但由于αα1-为一指数函数，曲线变化如下：α从1.01~1.1，增加9％，R 增加9倍；α从1.5~2.0，增加33％，R 增加1.5倍；α较大时，对R 的影响小。

因此，α一般在1~2范围内改变即可。

若要达到一定的分离度，在k ’不变的情况下，α的微小增加，将使n 显著下降。

如表1所示。

改变α的方法：气相色谱中可改变其固定相和柱温；液相色谱中可改变其固定相和流动相。

表1 α/n/R 之间变化关系 1.01 1.03 1.05 1.07 1.10 1.20 1.30 1.0163000 18900 7060 3740 1940 576 301 1.5367000 42500 15900 8420 4360 1300 6773.3 分配比 k ’分离度正比于溶质在固定相中所占的分数。

即总的说，k ’增大，R 增大，如下表所示。

k’ 00.5 1.0 2.0 3.0 5.0 10 50 100 '1'k k + 0 0.33 0.5 0.67 0.75 0.85 0.91 0.98 0.99 从上表可看出：当k ’很小时，'1'k k +随k ’增大，R 迅速增大；k ’>5以后，k ’增大，R 的增加缓慢；k ’>10后，增大k ’对R 的改进不明显，反而使t R 增大。

因此，k ’的最佳变化范围是：1≤k ’≤10。

改变k ’的方法：①改变固定相；②改变柱温（GC ）或流动相（LC ）；③改变相比β（改变VS 及柱死体积Vm)。

α,n,k ’对R 的影响可用下图2表示：改变 k ’对分离产生很大的影响：➢ 若原始k ’=0.5~2，k ’减小，tR 减小，R 减小；k ’增大，R 增大，峰高降低，峰宽增大。

➢ 若柱长不变下增加n ，t R 不变，峰高增高，峰宽减小，R 增大。

➢ 增加a ，两峰发生相对位移，R 增大。

为了用量的概念讨论多组分分析，Giddings 引入'1's m sW k R k W W ∝=++Rα n 图2 影响分离度的因素了峰容量的概念。

峰容量：在给定色谱条件（柱系统，柱温，流两相）下，和一定时间内所能容纳的一定分离度的色谱峰个数。

若所有峰的分离度均等于1，以死时间开始计算色谱峰个数，最后一个峰的峰尖作为末端时间，则：提高柱效n 和最后一个组分的容量因子k ’max 均可增大峰容量，实现多组分分离。

四、常用优化离子色谱分离度方法[2]4.1 稀释样品对组成复杂的样品，若待测离子对树脂亲合力相差额大，就要作几次进样。

并用不同浓度或强度的淋洗液或梯度淋洗，对固定相亲合力差异较大的离子，增加分离度的最简单方法是稀释样品或作样品前处理，例如盐水中SO 42-和Cl -分离若直接进样，其色谱峰很宽而且拖尾，表明进样量已超过分离柱容量，在常用的分析阴离 的色谱条件下，30min 之后Cl -的洗脱仍在继续，在这种情况下，在未恢复稳定基线之前不能再进样，若将样品稀释10倍之后再进样就可得到CI -与痕量SO 42-之间的较好分离，对阴离子分析推荐的最大进样量，一般为柱容量的30%，超过这个范围就会出现大的平头峰或肩峰。

4.2 改变分离和检测方式若待测离子对固定相亲合力相近或相同，样品稀释的效果常不令人满意。

对这种情况，除了选择适当的流功相之外，还应考虑选择适当的分离方式和检测方式，例如，NO 3- 和ClO 3-，由于它们的电荷数和离子半径相似，在阳离子交换分离柱上共淋洗，但ClO 3-的疏水性大NO 3-，在离子对色谱柱上就很容易分开。

又如NO 3-与Cl -在阴离子交换分离柱上的保留时间相近． 常见样品中Cl -的浓度又远大于NO 3-，使分离更加困难． 但NO 3-有强的UV 吸收，而Cl -则很弱，因此，应改用紫外作检测器测定NO 3-，用电导检测Cl -，或将两种检测器串联。

于一次进样同时检测Cl -与NO 3-，对高浓度强酸中有机酸的分析， 若采用离子排斥。

由于强酸不被保留，在死体积排除，将不干扰有机酸的分离。

4.3 样品前处理对高浓度基体中痕量离子的测定，例如海水中阴离子的测定，最好的方法是对样品作适当的前处理，除去过量Cl -的前处弹方法有：使样品通过Ag +型前处理柱除去Cl -，或进样前加AgNO 3到样品中沉淀Cl -； 也可用阀切换授术， 其方法是使样品中弱保留的组分和90％以上的Cl -进入废液， 只让10％左右的Cl -和保留时间大于Cl -的组分进人分离柱进行分离。

对含有大的有机分子的样品，应于进样前除去有机物，较简单的方法是用Dionex 的前处理柱OnGuard 的RP 或P 柱或在线阀切换除去有机基体。

4.4 选择适当的淋洗液离子色谱分离是在于琳诜离子和样品离子之间对树脂有效交换容量的竞争，为了得到有12max 10.6lg(1')n k Φ++峰容量 ＝效的竞争，样品离子和淋洗离子应有相近的亲合力。

下面举例说明选择琳洗渡的一般原则。

用CO32--HCO3-作淋洗液时．在Cl-之前洗脱的离子是弱保留离子，包括一价无机阴离子、短碳链一元羧酸和一些弱离解的组分，如F-、甲酸、AsO2-、CN-和S2-等。

对乙酸、甲酸与F-、Cl-等的分离应选用较弱的淋洗离子，常用的弱淋洗离子有HCO3-、OH-和B4O72-由于HCO3-和OH-易吸收空气中CO2，CO2在碱性溶液中会转变成CO3-。

CO3-之淋洗强度较HCO3-和OH-大，因而不利于上述弱保留离子的分离子。

B4O72-亦为弱淋洗离子，但溶液稳定，是分离弱保留离子的推荐淋洗液，中等强度的碳酸盐淋洗液对高亲合力组分的洗脱效率低。

对离子交换树脂亲合力强的离子有两种情况：一种是离子的电荷数大．如PO43-、AsO43-和多聚磷酸盐等；一种是离子半径较大，疏水性强。

如I-、SCN-、S2O32-、苯甲酸和柠檬酸等。

对前者以增加淋洗液的浓度或选择强的淋洗离子为主，对后一种情况，推荐的方法是在淋洗液中加入有机改进剂(如甲醇、乙腈和对氰酚等)或选用亲水性的柱子。

有机改进剂的作用主要是减少样品离子与离子交换树脂之问的非离于交换作用，占据树脂的疏水性位置，减少疏水性离子在树脂上的吸附，从而缩短保留时间，减少峰的拖尾，并增加测定灵敏度。

在离子色谱中，可由加人不同的淋洗液添加剂来改善选择性，这种淋洗液添加剂只影响树脂和所测离子之间的相互作用，而不影响离子交换。

对与树脂亲合力较强的离子，如一些可极化的离子，I-和ClO4-，以及疏水性的离子，苯甲酸和三乙胺等。

在淋洗液中加入适量极性的有机溶剂如甲醇或乙腈，可缩短这此组分的保留时间并改善峰形的不对称性。

为了减少样品离子与树脂之间的非离子交换作用，减少树脂对疏水性离子的吸附，在阴离子分析中，可在淋洗液中加入对氰酚，如测定1％NaCl中痕量I-和SCN-时，加人对氰酚占据树脂对I-和SCN-的吸附位置，从而减少峰的拖尾并增加测定灵敏度，IC中，一价淋洗离子洗脱一价待测离子。

二价淋洗离子洗脱二价待测离子，淋洗液浓度的改变对二价和多价待测离子保留时间的影响大于一价待测离子。

若多价离子的保留时间太长，增加淋洗液的浓度是较好的方法。