基因工程-重组体克隆的筛选和鉴定

核糖体 小亚基
核糖体 大亚基
能翻译
不能翻译
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2. 过程
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三、杂交释放转译法 1. 原理： 在高甲酰胺溶液中的载体上克隆的 cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗 脱，释放出与它对应的mRNA，进行体 外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基 因产物（如分子量、免疫源性等）。
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2. 过程
硝 待测蛋白质 酸 纤 维 硝 素 酸 滤 纤 膜 维 素 待测蛋白质 滤 膜 能与蛋白质结 放射性标记 合的DNA序列
能与蛋白质结 放射性标记 合的DNA序列
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一般克隆与筛选策略
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第七节 几种真核生物重组基因选择方法
一、哺乳动物基因转移的选择标记 1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk） （1）TK选择原理 ①四氢叶酸的必要性 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸 提供甲基。 DHFR 二氢叶酸 四氢叶酸
Ampr上有插入位点Pst I。
2
pBR322
3
2. pBR322抗菌素标记选择 （1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸：
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
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缺点：需要电镜！
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2. Northern blotting 用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
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第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”
利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
4
3. 选择过程： （1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
5
无环丝氨酸培养基
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA
凝胶放射自显影
总mRNA 杂交
cDNA编 码的蛋白
硝酸纤 载体和插 cDNA基因的 维素滤膜 入的cDNA mRNA
电泳
cDNA编 码的蛋白
洗脱
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA cDNA基因的 mRNA
体外翻译
收集
35S标记的氨基酸
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四、DNA-蛋白质相互作用筛选法 专门设计检测能同DNA特异结合的蛋 白质因子。
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3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。
④结果 单抗blotting 结果
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第六节 转译筛选法
借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选 择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选 其产物是否符合预期。 适用于mRNA转录丰度高的外源基因。
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一、转译筛选 载体+外源DNA 转录 mRNA
翻译
二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）
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②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用 氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似 物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断 dATP、dCTP和dTTP的合成：
抑制
TTP
dUMP
dATP
氨甲喋啉 抑制 dCTP
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③次黄嘌呤的补救作用 细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。
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待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
酶
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察
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2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品
将待测样品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后 就被固定在孔底。
孔底
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（2）一抗结合 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗
8
2. 选择过程
9
-半乳糖苷酶使Xgal分解成蓝色产物。
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第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。 一、原理： 1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
受体菌： his 外源基因： + his
在不含组氨酸的 培养基中生长
蛋白
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膜
Western装置
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② Blotting 原理与ELISA相同。
PAGE胶 待测蛋白
硝酸纤 待测蛋白 一抗 二抗 维素膜 辣根过氧
化物酶 底物 辣根过氧化物酶：HRPO 产物
底片曝光
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③ Blotting过程
1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。 2）洗去未结合的一抗。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。
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② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis）
电泳buffer
在电场的作用下线性 蛋白质链在聚丙烯酰 胺凝胶介质中向正极 移动，移动的速率主 要取决于其分子量大 小（链的长短），从 而把不同分子量的肽 链分开。
电泳buffer
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④胸苷酸激酶的补救作用 TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利 用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。 T tk 抑制 TTP
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二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。
1. 原理 抗原——抗体凝集反应。 2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成 “沉淀圈”。
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对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
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三、酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay
（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
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第四节 核酸杂交检测法
一、原理： 1. 核酸杂交 2. 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 3. 识别标记 （1）放射性同位素 （2）非放射性标记
32P
重组克隆与探针杂交。
或 125I 。
荧光素
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二、核酸杂交检测方法 1. Southern blotting 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
35S标记的 35S标记的肽链
甲硫氨酸 与预期的产物 分子量相符？
比较放射性 带纹的位置
PAGE电泳 放射自显影
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二、杂交抑制转译法 1. 原理 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链 后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被 抑制）。
核糖体 小亚基
单链mRNA 核糖体 大亚基
mRNA DNA
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3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
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四、免疫印迹（western blotting）法
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。
1.原理： （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。
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3. Broome-Gilbert双位点检测法
检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
质粒基因A
插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
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固相支 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 持滤膜
固相支 抗A抗体质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体 持滤膜 发光，底片曝光
125I标记的
不同克隆的酶切结果
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筛选过程
A
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
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三、PCR扩增检测法 1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。
1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶联（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无 色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度）， 从而推测目标分子的含量。
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2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR
连接 载体 转化受 体菌 三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。 一、直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆 中分离质粒，电泳比 较其分子量。
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（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
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二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖
-半乳糖苷酶
半乳糖 半乳糖