EV疫苗质量控制和评价技术要点

EV71疫苗质量控制和评价技术要点2016年11月16日发布引言手足口病（Hand-foot-mouth disease, HFMD）是婴幼儿人群常见的急性传染病，主要表现为发热和手、足和口等部位的皮疹或疱疹，可并发无菌性脑膜炎、脑炎及急性弛缓性麻痹等中枢神经系统症状，甚至死亡。

多种肠道病毒感染可引起HFMD，肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）为引起世界范围内HFMD爆发的主要病原体（1）。

HFMD中约90%的死亡病例由EV71感染引起（2），EV71引起的HFMD已成为我国的重大公共卫生问题之一。

20 15年，我国自主研发的EV71灭活疫苗获批上市（3）。

研究制定EV71疫苗质量控制和评价技术技术要点，对规范并提高我国EV71疫苗的质控标准和生产一致性，保证上市疫苗安全、有效和质量可控具有重要意义。

本技术要点中EV71疫苗是指采用传代细胞生产的全病毒灭活疫苗，或采用重组DNA技术将具有免疫保护性的抗原基因克隆到表达载体上，转化相应的宿主中表达的EV71抗原蛋白，经过纯化等工艺制备的EV71疫苗。

本技术要点中凡涉及生物制品质量控制的通用要求，均应按现行版《中华人民共和国药典》三部有关规定执行（4）；有关生产设施的要求应参照国家食品药品监督管理总局（CFDA）2010版《药品生产质量管理规范》执行（5）。

本技术要点仅为对EV71疫苗进行质控和评价技术要求的指导性文件，需根据技术的发展和实际需要进行适当的更新。

一般考虑EV71属于小RNA病毒科，肠道病毒属，为无包膜病毒。

EV71颗粒为20面体的对称结构，直径约24-30纳米，由60个亚单位组成。

病毒基因组为单股正链RNA，7400核苷酸左右，包含有5’-UTR区和3’-PolyA尾。

EV71的衣壳蛋白主要由VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中，VP1、VP2和VP3位于病毒衣壳外部，VP4位于病毒衣壳内部。

VP1是EV71主要的抗原表位。

EV71只有一个血清型，依据VP1区序列可分为A、B 和 C 3个基因型以及11个基因亚型。

我国台湾、香港以及其他国家或地区近年来流行的主要基因型包括B4、B5、C2、C4和C5等亚型（6），我国大陆流行的EV71主要为C4亚型。

5岁以下儿童和婴幼儿为EV71易感人群（7）。

在后脊髓灰质炎时代，EV71已成为对人类健康危害最大的肠道病毒（8）。

多个国家或地区的企业和研究机构开展了EV71疫苗的研发，疫苗种类包括全病毒灭活疫苗、基因工程重组蛋白疫苗、减毒活疫苗和多肽疫苗等（9）。

其中，我国3家企业研发的EV71全病毒灭活疫苗对EV71感染所致HFMD的保护效果分别为%，%和%（10-12）。

2015年12月，CFDA批准中国医学科学院医学生物学研究所和北京科兴生物制品有限公司生产的EV71全病毒灭活疫苗上市（3），为我国及世界范围控制EV71感染相关的疾病，特别是严重HFMD的爆发和流行提供了手段。

近年来HFMD流行病原谱发生改变，柯萨奇病毒A组6型、A组10型病毒感染引起HFMD的流行呈增长趋势，提出了研发防控HMFD多价疫苗的需求（1 3,14）。

基因工程重组蛋白疫苗中的病毒样颗粒（VLP）疫苗具有易工业化规模生产的优势，且在动物试验上显示良好的保护效果，显示了研发EV71 VLP疫苗的可行性（15,16）。

本技术要点重点关注EV71疫苗生产的质控和评价，强调生产过程的一致性，同时对研发阶段的疫苗也提出相关标准和要求，以保证研发和生产阶段中疫苗质控和评价方法及标准的衔接。

1. 临床前质控和评价应依据世界卫生组织（WHO）相关文件以及CFDA《预防用疫苗临床前研究技术技术要点》等技术文件进行EV71疫苗临床前质控和评价研究（17-19）。

新研发疫苗的质量标准整体上应达到或高于上市疫苗的标准，动物保护试验中疫苗免疫诱导的中和抗体水平和保护效果应与上市疫苗具有可比性。

灭活疫苗毒株和细胞基质疫苗生产用毒株的筛选和确定是灭活疫苗研发成功的关键。

应选择主要流行基因型的毒株（目前我国为C4型）作为疫苗候选株进行筛选，重点关注不同毒株的交叉保护能力和遗传稳定性。

采用目前世界范围流行的毒株（B4、B5、C2、C4和C5等）及国内不同地区的流行毒株，和/或构建不同基因亚型的假病毒进行保护能力比较，选择中和能力强且中和范围广的2~3个毒株作为EV71候选疫苗株。

挑选主要免疫原性区域（VP1）核苷酸序列一致的毒株进行克隆纯化，并规定代次，建立主种子批和工作种子批。

进行扩大培养、发酵、收获、纯化及灭活工艺等适应性研究，选择工艺适应性和免疫原性较好的候选疫苗株作为疫苗生产株。

检定项目应包括鉴别试验、病毒滴定、免疫原性、无菌检查、外源因子和遗传稳定性等项，各级种子批VP1区核苷酸序列不应发生改变，同时具有相近的病毒滴度和免疫原性。

应依据现行版《中国药典》中的要求，建立符合规定的细胞库用于生产。

基因工程重组蛋白疫苗菌毒株和细胞库应选择EV71保护性抗原的基因序列作为目的基因，构建基因工程重组蛋白疫苗的工程菌毒株（即生产用菌毒株）。

目前，已报道应用于研发EV71疫苗的表达系统包括酿酒酵母、汉逊酵母、毕赤酵母以及昆虫细胞杆状病毒等。

构建过程中应筛选目的基因完全正确，表达量高且遗传稳定性好的克隆作为疫苗生产用菌毒株，建立三级种子系统。

应规定主种子批和工作种子批的代次，进行鉴别试验、无菌检查、遗传稳定性、抗原表达水平和免疫原性等项检定。

其中，汉逊酵母等表达体系应测定整合拷贝数；酿酒酵母表达系统需测定质粒保有率；表达产物应鉴别为目的蛋白，建立表达量测定方法和标准。

对昆虫细胞，除应符合常规传代细胞系的要求外，还应考虑对昆虫细胞敏感的和可能引入的特殊污染病毒或外源因子（如螺原体），建立检测方法和质控指标。

重组蛋白疫苗诱导的中和抗体与主要流行毒株和/或假毒株的中和交叉能力与灭活疫苗应具有可比性。

疫苗有效性评价有研究提出EV71全病毒灭活疫苗免疫诱导的中和抗体水平可作为人体免疫保护的替代指标（10,11）。

应探讨疫苗免疫不同品系动物后诱导的中和抗体应答，确定适宜的动物模型，开展疫苗免疫原性验证研究，获得疫苗诱导的中和抗体应答数据，包括1剂免疫后不同时间的抗体转归，2、3剂加强后的抗体应答和转归，以及疫苗的剂量效应关系。

中和抗体测定常采用经典的细胞病变法（C PE）或其他经验证的方法，假病毒方法可在经过验证及相关性分析后采用（20）。

中和抗体水平可采用效价（Titer）表示，推荐采用国家标准品单位（U）或WH O单位（IU）作为中和抗体水平单位进行标化。

免疫原性和保护效果评价可选择乳鼠、小鼠及猕猴等作为模型动物。

攻毒和免疫方式包括免疫母体后的母传抗体攻毒保护法、抗体被动保护攻毒实验动物法等。

应在先确定攻毒株的半数致死剂量（LD50）的基础上，研究获得疫苗动物保护的半数有效剂量（ED50）。

可选用上市疫苗作为对照，也可比对报道的疫苗乳鼠保护ED50，综合评定疫苗保护效果（21）。

在进行评价时应考虑方法的标准化和规范化，如标准毒株、标准物质以及标准化的动物模型等。

疫苗质量特性研究和规程制定应依据现行版《中国药典》三部中人用疫苗总论、基因重组产品总论以及相关技术要点等要求，结合自身生产工艺特点等，进行EV71疫苗质量特性研究。

内容应包括理化结构确证、杂质及纯度分析、生物活性研究等。

在进行全面质量特性研究的基础上建立疫苗的质量标准。

EV71的中和表位主要包括3个区域，位于病毒的5次对称轴附近：VP1的G-H环、H-I环和VP2的E-F环等（22）。

对灭活疫苗，需重点关注与已上市疫苗结构和活性的一致性，包括疫苗中实心（F）和空心（E）颗粒的比例、比活、诱导中和抗体能力以及动物保护效果等指标；对于基因重组VLP疫苗，应对V LP蛋白结构进行鉴别和分析，包括SDS-PAGE或N-末端测序等方法进行VLP 分子量和构成测定，采用特异的多抗或单克隆抗体鉴别VP1等抗原基因表达的目标蛋白，氨基酸序列分析、肽图等方法鉴别VLP的一级结构；采用原子力和透射电子显微镜，以及动态光散射等方法测定EV71 VLP的聚集性；应用结构生物学或免疫学手段分析VLP保护性结构位点，研究不同条件下抗原结构改变引起免疫原性的降低等。

应分析VLP疫苗与灭活疫苗中E颗粒结构以及免疫原性的相似性，探讨保护位点与灭活疫苗抗原的差异，比对相同蛋白含量或相同活性单位时免疫原性包括交叉保护能力的差异。

灭活疫苗标准应不低于已上市疫苗，如主种子批和工作种子批VP1区核苷酸序列应与原始种子一致，EV71抗原颗粒特异性峰按面积归一化法计算纯度（高效液相色谱法，HPLC）应在%以上，Vero细胞宿主蛋白和残余DNA每剂不超过设定的标准等。

EV71疫苗原液的F、E颗粒与疫苗免疫原性有关，Ｆ颗粒具有更好的免疫原性（23），研发灭活疫苗时建议考虑建立相应的检测方法，制定F及E 颗粒比例的质控标准。

在工艺相关杂质控制方面，当应用DNA酶去除残留宿主细胞DNA时，除应关注残留DNA酶的质控外，应考虑小片段DNA的生物学效应及对免疫的影响，必要时应研究相应的检测方法和标准（24）。

应考虑建立VLP疫苗菌株或细胞表达目的蛋白的鉴别、表达量和遗传稳定性质控标准。

结构鉴别是VLP疫苗质控的重点，需在系统鉴别VLP抗原的基础上，选择确定科学、可行的结构鉴别方法和标准，如定期N-末端测序方法等。

建立并验证检测残留菌株细胞蛋白、核酸成分、添加的有机溶剂、疫苗纯度以及效力等指标的方法，并初步制定相应的标准。

应探讨国家EV71疫苗抗原含量和效力测定标准品是否适宜于所研发的制品，必要时应建立相应的参考品或对照品。

此外，应参考已上市的重组类疫苗及重组类治疗用生物制品的相关要求进行质量控制。

疫苗研发时应关注过程控制，在完成工艺优化和验证后，可将EV71疫苗抗原含量或比活作为一致性监测的主要指标，收集不同批次检测数据，拟定疫苗生产中关键质控点的抗原含量或比活的一致性可接受范围。

标准物质研究和应用疫苗质量评价与标准物质密不可分，只有采用统一的标示方式，不同国家或地区的疫苗管理、研发、生产及使用者在比较疫苗的关键质量指标，如活性或效力时才能具有可比性。

因此，在疫苗研发阶段即应重视建立及应用疫苗标准物质，以保证质量的一致性和检测结果的准确性。

用于评价与临床免疫保护效果相关的疫苗关键质量属性，如活性或效力测定时所用标准物质，原则上应来自可溯源至临床试验时具有确切保护效果的原料批次。

企业应采用已建立国家的EV71疫苗抗原标准品、中和抗体标准品、效力标准品进行疫苗的质控和评价。

在完成工艺优化后，可考虑制备一批EV71疫苗抗原作为疫苗工作对照品，用于对其后研制批次疫苗的质量比对。

对企业自建的检测方法，应考虑建立相应的工作参考品或对照品。