血红蛋白的提取和分离
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3.类型琼: 脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与 其所带电荷相反的电极移动
琼脂糖凝胶电泳示意图
4、聚丙稀酰胺凝胶电泳
（1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰
胺和交联剂N,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂 和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网 状结构的凝胶。
（2）原理：
3、缓冲溶液的配制
通常由（ 1－2 ）种缓冲剂溶解于水中
配制而成。调节缓冲剂的（ 使用比例 ）
就可以制得（ 在不同PH范围内
）
使用的缓冲液。
4、在本课题中使用的缓冲液？
磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和 功能，便于观察(红色)和科学研究其(活性)
思考：说出人体血液中缓冲液。
NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3
二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
知识回顾
1. 血液有哪些成分？
水分
血浆
血
其他物质： 血浆蛋白、无机ห้องสมุดไป่ตู้、磷脂、葡萄糖等
液 血细 胞
白细胞 血小板
红细胞
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链
（最多） （90％） 四个亚铁红素基团
2. 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好 哪种血液来提取血红蛋白？为什么？
④ 装填悬浮液 一次性缓慢倒入；轻轻敲打
⑤
缓冲液洗涤 平衡
立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h
装配好的凝胶柱
3、样品加入与洗脱---调节缓冲液面→加入蛋白质样
品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质
（1）调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓
慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
（2）滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶
红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→ 滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明 液体。
4、透析：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）
装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。
分离血红蛋白溶液
有机溶剂 无色透明的甲苯层 脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液 红色透明液体 红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物
3、原理：
一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理
分子量 直径大小
运动方式 运动速度 运动路径 洗脱次序
大 大于凝胶颗粒空 隙直径，被阻挡 在颗粒的外面
垂直向下移动
较快 较短 先从凝胶柱洗脱 出来
小
小于凝胶颗粒空 隙直径，可以进 入颗粒内部
垂直向下移动， 无规则扩散进入 颗粒内部
较慢
较长
后从凝胶柱洗脱 出来
端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意 不要破坏凝胶面。
（3）样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品
渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
（4）洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到
适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
（5）收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管
透析过程动画演示
二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）凝胶色谱操作---纯化
1、凝胶色谱柱的制作：
色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞 →安装色谱柱
2、凝胶色谱柱的装填
步骤
操作要求
① 操作要求
色谱柱垂直固定在支架上
②
计算称量凝 胶
根据色谱柱体积计算凝胶用量
③
配制悬浮液
凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴
收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中， 如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
（6）注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。
2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
收集得到的纯化后的蛋白
（三） 电泳：
1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
2.原理①：许多重要的生物大分子，如多肽、
核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这 些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下， 这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移 动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性 质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使 带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中 各种分子的分离。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取 决于它所带净电荷的多少以及分子的大 小等因素。 为了消除净电荷对迁移率的影响，可以 在凝胶中加入SDS。
4、聚丙稀酰胺凝胶电泳
（3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽 链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会 解聚成单条肽链，因此测定的结果只是 单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质 形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电 荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷 量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷 差别，使电泳迁移率完全取决于分子的 大小。
二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血 红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红 蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂 质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量 较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶 电泳鉴定。
一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理 4、具体过程
㈡ 缓冲溶液：
1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少 量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发 生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓 冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用： 能够抵制（ 外界的酸或碱 ）对溶液 （ pH值 ）的影响，维持PH基本不变。
血红蛋白的提取和分离 课题3 血红蛋白的提取和分离
主要内容： 一、基础知识 二、实验操作
一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理
㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）
1、凝胶： 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通 道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖） 2、概念： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的 有效方法
二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 （一）样品处理
1、红细胞的洗涤：
血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍 体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液 →反复洗涤直至上清液无黄色
2、血红蛋白的释放：
在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放
3、分离血红蛋白溶液：
在电场的作用下，这些带电分子会向着与 其所带电荷相反的电极移动
琼脂糖凝胶电泳示意图
4、聚丙稀酰胺凝胶电泳
（1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰
胺和交联剂N,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂 和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网 状结构的凝胶。
（2）原理：
3、缓冲溶液的配制
通常由（ 1－2 ）种缓冲剂溶解于水中
配制而成。调节缓冲剂的（ 使用比例 ）
就可以制得（ 在不同PH范围内
）
使用的缓冲液。
4、在本课题中使用的缓冲液？
磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和 功能，便于观察(红色)和科学研究其(活性)
思考：说出人体血液中缓冲液。
NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3
二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
知识回顾
1. 血液有哪些成分？
水分
血浆
血
其他物质： 血浆蛋白、无机ห้องสมุดไป่ตู้、磷脂、葡萄糖等
液 血细 胞
白细胞 血小板
红细胞
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链
（最多） （90％） 四个亚铁红素基团
2. 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好 哪种血液来提取血红蛋白？为什么？
④ 装填悬浮液 一次性缓慢倒入；轻轻敲打
⑤
缓冲液洗涤 平衡
立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h
装配好的凝胶柱
3、样品加入与洗脱---调节缓冲液面→加入蛋白质样
品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质
（1）调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓
慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
（2）滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶
红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→ 滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明 液体。
4、透析：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）
装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。
分离血红蛋白溶液
有机溶剂 无色透明的甲苯层 脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液 红色透明液体 红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物
3、原理：
一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理
分子量 直径大小
运动方式 运动速度 运动路径 洗脱次序
大 大于凝胶颗粒空 隙直径，被阻挡 在颗粒的外面
垂直向下移动
较快 较短 先从凝胶柱洗脱 出来
小
小于凝胶颗粒空 隙直径，可以进 入颗粒内部
垂直向下移动， 无规则扩散进入 颗粒内部
较慢
较长
后从凝胶柱洗脱 出来
端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意 不要破坏凝胶面。
（3）样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品
渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
（4）洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到
适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
（5）收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管
透析过程动画演示
二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）凝胶色谱操作---纯化
1、凝胶色谱柱的制作：
色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞 →安装色谱柱
2、凝胶色谱柱的装填
步骤
操作要求
① 操作要求
色谱柱垂直固定在支架上
②
计算称量凝 胶
根据色谱柱体积计算凝胶用量
③
配制悬浮液
凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴
收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中， 如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
（6）注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。
2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
收集得到的纯化后的蛋白
（三） 电泳：
1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
2.原理①：许多重要的生物大分子，如多肽、
核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这 些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下， 这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移 动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性 质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使 带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中 各种分子的分离。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取 决于它所带净电荷的多少以及分子的大 小等因素。 为了消除净电荷对迁移率的影响，可以 在凝胶中加入SDS。
4、聚丙稀酰胺凝胶电泳
（3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽 链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会 解聚成单条肽链，因此测定的结果只是 单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质 形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电 荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷 量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷 差别，使电泳迁移率完全取决于分子的 大小。
二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血 红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红 蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂 质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量 较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶 电泳鉴定。
一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理 4、具体过程
㈡ 缓冲溶液：
1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少 量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发 生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓 冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用： 能够抵制（ 外界的酸或碱 ）对溶液 （ pH值 ）的影响，维持PH基本不变。
血红蛋白的提取和分离 课题3 血红蛋白的提取和分离
主要内容： 一、基础知识 二、实验操作
一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理
㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）
1、凝胶： 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通 道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖） 2、概念： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的 有效方法
二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 （一）样品处理
1、红细胞的洗涤：
血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍 体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液 →反复洗涤直至上清液无黄色
2、血红蛋白的释放：
在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放
3、分离血红蛋白溶液：