病毒载体吴小兵培训课件
人教版八年级上册五单元 第五章 病毒 课件(共25张PPT)
通过阅读下文《病毒的发现》，你 发现了有关病毒的什么信息？
100年前，科学家们在研究烟草花叶病的 病因时，将患花叶病的烟草榨出汁液，通过 细菌过滤器将细菌滤去，再用过滤后的汁液 去感染正常的烟草，结果发现烟草仍然患病。 于是，他们认为烟草花叶病是由一种比细菌 还小的生物引起的，但人们仍然不认识它的 “庐山真面目”，直到20世纪30年代，科学 家发明了电子显微镜，才看到了它的真面目， 并把这种生物叫做“滤过性病毒”，这就是 我们所说的病毒。
3、病毒没有细胞结构，只有寄生在活细胞
里才能进行生命活动。
（√）
填空题：
病毒是由 （蛋白质构成的外壳）和 （ 内部的遗传物质 ）构成，必须生活 在 （ 活）细胞内
选择题：
1下列生物中不具有细胞结构的是（C ）。
A、细菌；
B、水螅；
C、烟草花叶病毒；
D、蚯蚓。
2．下列哪一项不是人类利用病毒为人类服务的实例（B ）。 A、无脊椎动物病毒制成杀虫剂； B、给高烧病人注射青霉素； C、用噬菌体治疗烧伤病人的化脓性感染； D、给健康人注射流行性乙型脑炎疫苗
一、病毒的发现
伊万诺夫斯基的实验过程：
过滤
汁
汁
液
液
二、病毒的形态
球状 杆状 蝌蚪状
1、病毒的大小：
病毒个体十分微小，三万个拼接 起来才有一个细菌大小。所以病 毒只能用电子显微镜才能看见。 2、病毒的形状：
球状（流感病毒），杆状（烟草花 叶病毒），蝌蚪状（噬菌体）等
烟 草 花 叶 病
流 感 病 毒
小结
病毒
发现 形态 结构
生命活动
伊万诺夫斯基，烟花草 叶病毒实验
小，球状、杆状、蝌蚪状
简单，无细胞结构，蛋白 质外壳+遗传物质
腺病毒载体介导密码子优化型HPV_省略_胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配_周玉柏
腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配周玉柏,周玲,吴小兵,曾毅(传染病预防控制国家重点实验室 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所,北京100052)摘要:为研究重组腺病毒载体作为HPV 16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16L 1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究。
首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV 16L1基因进行改造并合成优化基因,命名为mod 1HPV 16L1。
将mod 1H PV16L 1基因克隆到穿梭质粒PDC316上,与骨架质粒共转染293细胞,在细胞内包装重组腺病毒rA d -mod 1HP V16L1。
用免疫印迹法检测病毒感染的293T 细胞中HPV 16L1蛋白的表达。
通过Optipr ep 密度梯度超速离心法纯化HPV 16L1病毒样颗粒(V LPs)。
用磷钨酸负染,在电子显微镜下观察HP V16L 1蛋白自我装配形成的V L Ps 。
结果显示,重组腺病毒载体可介导mod 1H PV16L1基因在哺乳动物细胞内的高效表达,L 1蛋白可自我装配形成V LPs 。
关键词:腺病毒;人乳头瘤病毒16型;密码子优化;病毒样颗粒中图分类号:R373 文献标识码:A 文章编号:1000-8721(2006)02-0101-06收稿日期:2005-09-13;修回日期:2005-10-31基金项目:国家高技术/8630计划资助项目(2001AA215221)国家/9730资助项目(2004C9818806)作者简介:周玉柏(1976-),男,湖北武汉人,在读博士研究生,主要从事肿瘤病毒学研究。
通讯作者:周玲,研究员,E -mai l:zhouli ng@doctor 1com 1cn人乳头瘤病毒属乳多空病毒科,是无包膜的闭环双链DNA 病毒,具有上皮细胞嗜性,迄今已分离到超过100种基因型[1,2]。
网络安全培训教材 ppt课件
警示一、弱密码不可取，未修改初始密码更易被攻击 警示二、系统的相对封闭是系统安全运行的首要保障
一、网络安全业界事件及形势—常见的威胁
黑客
病毒
蠕虫
网络钓鱼
客户网络承载数
木马
网络钓鱼
垃圾邮件
僵尸网络 D-DOS
类别
目的及威胁
主要攻击方式
信息窃取类
主要以盗取机密信息、个人数据、敏感数据为目的，隐蔽性强，威胁国家保密信息、公司商业机密，个人隐 木马、网络钓鱼、垃圾邮件、
网络安全关键岗位是指各业务流程和活动中可能利用职务之便植入篡改处理客户产品网络信息客户网络中所承载的客户或用户的通信内容个人数据及隐私对网络安全会产生重大影响或后果的岗位序号网络安全关键岗位1来料检验员iqc存储类2测试工艺工程师生产软件管理含技术员3制造it工程师软件服务器与测试网络管理含技术员4软件烧录员5手工测试员含无线模块测试ft及整机测试6物料员贵重物料管理poc直发网络安全管理要求概要保障产品在供应链中的完整性真实性可追溯性防止产品被篡改植入伪造等网络安全风险并通过对供应过程的可追溯来达到供应链风险的有效管理
• 所有人的电脑密码专人专用，定期更改，不得转借他人，不得泄露， 人员离开电脑时，电脑必须锁住，不得让其他人打开。
• 网络使用者发送电子邮件内容由本人操作负责, 未经允许，不得利用 公司网络、邮件等向外发送、传递信息。
• 所有人不得将与项目业务相关的信息发送到其他部门，如：华为项目 部的业务相关的邮件不得发给中兴、酷派、PPTV部门的人员。
网络安全管理要求-红线
• 网络安全红线来源于政府要求、法律法规、客户要求以及业界规范等， 其目标是保障产品在供应环节的完整性、真实性及对客户数据的保护.
病毒载体概述
病毒载体概述引言基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。
本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。
用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体不致病。
然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。
因此需要对其进行改造后才能用于人体。
原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。
但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。
近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。
第一节病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。
研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。
病毒基因组可分为编码区和非编码区。
编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。
非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。
一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。
最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。
比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。
病毒载体PPT课件
• 而且，这些新技术也带来新的问题，主要是由辅 助病毒污染及载体的不稳定性所引起。
• 构建载体的一个因素是需要维持载体的正常大小 才能完成有效地DNA的包装。这个问题可以通过 “填充”DNA来完成，尽管这些填充DNA片段的 性能可以影响转基因的表达。
• 已经明确E4基因的部分保留有利于宿主细胞战胜 T细胞免疫反应从而有利于病毒生存，因此改造载 体时可以保留部分E4基因。
• 外源基因的容量增加了：14kb • 外源基因的表达时间比第一代病毒载体有所延长，
但仍然不能长期持续表达。 • 宿主的免疫反应仍然是影响外源基因持久表达的
主要障碍，特别是在发生重复感染的时候这种作 用尤其明显。
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第三代重组腺病毒载体
第三代腺病毒载体的构建是将病毒的其他基因全部或接 近全部删除。这就是所谓的“空肠病毒”载体，它仅保留了 ITR和包装信号序列，因此需要辅助病毒和适当的包装细胞 用于病毒的繁殖，病毒的获得需要仔细的纯化。
生化中学习过核苷酸密码子，AAA编码 赖氨酸
AAA
lysine
7
1972年Berg等在一系列的研究中发展了第一 种建立在SV40基础上的重组病毒载体，并将λ噬 菌体部分DNA片段和大肠杆菌半乳糖操纵子连接 到 SV40 DNA中。
1976年，带有λ噬菌体DNA的重组SV40载体 在猴肾体用于基因治疗有以下优点： • 转移效率较高 • 在转化的细胞中将外源基因整合到染色体上或作
为染色体外的遗传物质进行表达，两种途径可供 选择 • 有可能将外源治疗基因置于病毒调节信号的控制 下进行表达 • 能够将外源基因作为病毒微染色体的一部分，并 能进行分离
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病毒载体作为基因治疗的工具存在的问题： 尽管病毒载体介导的基因转移在临床上已经取
病毒载体--吴小兵ppt课件
ESTRADIOL
GAL4 ER VP16
合成的转录因子
RXR
EcR VP16
RU486
GAL4 PR VP16
Diphenol indene
GAL4 ER p65
muristerone
ZFHD-1 FKB12
FRAP P65
最新课件
rapamycin 11
自 我 扩 增 型 载 体 （ s e lf-a m p lify in g v e c to r ）：
舞 （ K irn D e t a l. 1 9 9 8 ）， 已 进 入 III 期 临 床 试 验 ， 从 此 ， 许 多 人 工 改
造的腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研究中。
嵌 合 型 病 毒 载 体 （ h y b r id v ir a l v e c to r ）：
指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺
单 纯 疱 疹 病 毒 扩 增 子 与 A A V 病 毒 杂 合 载 体 （ J o h n s to n K M e t a l. 1 9 9 7 ）、
腺 病 毒 与 E B 病 毒 复 制 子 杂 合 载 体 （ T a n B T e t a l. 1 9 9 9 ） 腺 病 毒 与 反 转
图2 腺病毒包装最系新统课示件意图
6
多因素生产系统 (multi-component system)
Helper virus
rep cap Helper plasmid
host cell
Vector plasmid
多因素系统
图3 腺病毒伴随病毒包装系统示意图
双因素系统
Helper virus +helper plasmid
腺病毒载体构建ppt课件
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞
基因组外游离状态下表整达理版，课整件合突变致癌可能性小。
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几种病毒载体的区别
整理版课件
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整理版课件
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整理版课件
5
腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础
整理版课件
重组系统由2种质粒 构成：一、包含全
部（或右侧大部分） 腺病毒基因组DNA 的大质粒，即骨架 质粒
6
二、小的穿梭质粒，其带有
目的基因的表达盒以及表达
盒两侧的与大质粒上的目的
基因拟插入部位同源序列
（左右臂）
整理版课件
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整理版课件
包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
E2蛋白涉及AdDNA复制
E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统
E4蛋白调节有效的晚期基因转录
整理版课件
4
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
•腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒 症状、呼吸系统不适等。
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1/28/2021
生物学特性
适用范围
可感染分裂细胞； 整合到染色体中； 表达时间较长； 有致癌的危险； 可感染分裂和非分裂细胞； 不整合到染色体中； 外源基因表达水平高； 表达时间较短； 免疫原性强； 可感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因； 在骨骼肌、心肌、肝脏、视 网膜等组织中表达较高；
基 础 的 。用 目 的 基 因 代 替 病 毒 的 外 壳 蛋 白 编 码 序 列 ，导 入 靶 细 胞 中 ，
双因素系统
Helper virus +helper plasmid
Host cell +vector DNA
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病毒载体吴小兵
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rep cap
Recombinant helper virus (rHSV-repcap)
proviral cell
图4 双因素系统生产重组AAV病毒示意图
无病毒基因的病毒载体
2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒）
3、被包装的DNA/RNA
包含顺式作用元件
单因素生产系统（one-component system)
gag pol env
LTR
LTR
图1 反转录病毒包装系统示意图
双因素生产系统 (two-component system)
Ad Shuttle
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E1a,b 病毒载体吴小兵
神经系统疾病的基 因治疗； 肿瘤的基因治疗。
3
病毒载体研究方向
1、病毒包装系统 2、无病毒基因的病毒载体
3、靶向性病毒载体
4、可调控表达的病毒载体 5、嵌合型病毒载体
6、自我扩增型病毒载体
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病毒载体吴小7、兵 条件增殖型病毒载4 体
8、新病毒载体
病毒载体包装系统
组成：1、宿主细胞
HRE
MVM P4 B19 promoter HBV JCV EBV
P1 P1
tetOp
MDR1 1/28/2021
ESTRADIOL
病毒载体吴小兵
合成的转录因子
tTA tTA tTA
GAL4 ER VP16
RXR
tetOp gene tetOp gene
tetOp gene
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EcR VP16
RU486
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病毒载体吴小兵
1
用途：基因转移和表达
1、基因治疗 2、疫苗 3、器官移植 4、组织工程 5、转基因动物 6、基因功能研究
病毒载体概述（2）
优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；
2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。
存在的问题：1、安全性
组
肿
织
瘤
特 选 1/28/2021
异
择
性
性
启
启
动
动
子
子
细
肿
胞
瘤
周病毒载体吴小兵血
期
管
调
内
控
皮
启
导
动
向
子
启
动
子
双
病
特
毒
异
9增
性
殖
启
的
动
特
子
异
性
转
录
调
控
可调控表达的病毒载体
细胞的调控元件 病毒的调控元件 人工合成的调控元件
细胞特异性转录
四环素调控
细胞启动子 病毒启动子
albumin Tyrosinase or TRP-1 PSA MBP MCK GFAP NSE KDR/flt-1 AFP CEA erbB2
7
单纯疱疹病毒载体：
gene
gene
gene
pac
ori
gene
gene
无辅助病毒包装系统
adenovirus
Helper plasmid: E2a E4orf6 VA
aav vector plasmid
ITR
ITR
gene
E1a,b
293细胞
图5 重组AAV无辅毒包装系统
ITR
ITR
gene
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GAL4 PR VP16
Diphenol indene
GAL4 ER p65
muristerone
ZFHD-1 FKB12
FRAP P65
rapamycin
自 我 扩 增 型 载 体 （ s e lf-a m p lify in g v e c to r ）：
这 类 载 体 是 以 正 链 R N A 病 毒 S in d b is 病 毒 和 S em lik i F o rest 病 毒 为
293 cell
E1a,b
5
293 cell
JM17
图2 腺病毒包装系统示意图
多因素生产系统 (multi-component system)
Helper virus
rep cap Helper plasmid
host cell
Vector plasmid
多因素系统
图3 腺病毒伴随病毒包装系统示意图
病毒载体概述（1）
要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒
2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病
容量：自身基因组大小的105%~110%
类型：1、重组型病毒载体
可复制型 复制缺陷型
2、无病毒基因的病毒载体 复制缺陷型
组成：1、病毒复制和包装元件
2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜
被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和 包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病 毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。
腺伴随病毒载体：
ITR
反转录病毒载体：
ITR
gene
pA
LTR
gene
LTR
腺病毒载体：
ITR
ITR
gene
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病毒载体p吴A小兵
2、靶向性
细胞毒性 染色体毒性 免疫毒性
转导靶向性 转录靶向性
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3、有效性
转导效率 靶向性
基因表达水平和持续时间
表达的可调控性
病毒载体吴小兵
2
常用的病毒载体的特点：
病毒载体
反转录病毒载体 单 链 RNA 病 毒 8~10kb
腺病毒载体 双 链 DNA 病 毒 36kb
A AV 病 毒 载 体 单 链 DNA 病 毒 ~5kb
E x v iv o 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗。
In v iv o 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗； 疫苗。
In v iv o 基 因 治 疗； E x v iv o 基 因 治 疗 ； 遗传病基因治疗； 获得性慢性疾病的 基因治疗。
具有嗜神经性；可逆轴突传 递； 可潜伏感染； 容 量 大病；毒载体吴小兵 可感染分裂和非分裂细胞；
病毒载体吴小兵
creh packaging signal flanked by loxP
图6 mini-adnovirus无辅毒包装系统
靶向性病毒载体
转导靶向性
改造病毒外壳/外膜
连接靶向性结合分子
Modified adenovirus
cell
转录靶向性（特异性）