蚕豆根尖细胞微核实验报告

利用蚕豆根细胞微核技术检测洗发水的毒性

09生物技术宁伟王晓刚太红桥刘经源

摘要微核（micronucleus,MCN）是真核生物细胞经各种理化因子作用后引起染色体畸变，在间期细胞中的一种表现形式。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3～1/20，染色与主核一样或稍浅。一般认为微核是由无着丝粒的染色体断片或落后染色体，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即微核。[1]

蚕豆根尖细胞微核试验(Micronucleustest,MC-NT)技术是一种以染色体断裂及纺锤丝损伤为测试终点的植物微核检测方法。它是一种应用于监测环境致突变物对人体和其他生物体的遗传物质产生危害的技术,并从细胞遗传学水平上探讨植物遗传物质的改变状况与环境污染，也可以检测淡水环境的质量。[2]

关键词蚕豆根尖微核洗发水千分率

蚕豆是一种很好的细胞遗传学研究材料。它的染色体为六对相当大的染色体，而且根尖含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察。目前，蚕豆根尖微核技术在环境致突变性检测/监测方面已经形成了一套完整的体系。它的可靠性和灵敏性较高，且本底较低，这对于一种致突变性检测方法是十分重要的。此外，它的检测物谱较广。目前多数学者认为，在镜检细胞微核时，应按下列标准计数微核：

（1）凡主核大小1/3以下，与主核分离的小核；

（2）小核的着色与主核相当或稍浅；

（3）小核形态可为圆形，不规则等。[3]

1. 实验目的

掌握蚕豆根尖细胞微核检测技术的一般方法。并利用蚕豆根尖细胞微核检测技术对洗发水的毒性状况给出客观的评价，同时表明蚕豆根尖细胞MCN对胁迫很敏感，蚕豆根尖微核技术可用于洗漱用品的安全监测。

2. 材料与方法

2.1实验材料

蚕豆种子、洗发水、显微镜、镊子、培养皿、剪刀、载玻片、盖玻片、烧杯、Carnoys固定液、盐酸酒精解离液、改良苯酚品红染液、NaN3等。

2.2 毒液配制

选取所测洗发水，按平时所用比例与水混合均匀。

2.3实验方法

2.3.1 浸种

择饱满、均匀的20粒种子，洗净后用蒸馏水常规浸种24h，此期至少换水2次；待种子充分吸胀后，移入干净的培养皿内培养。2.3.2 催芽

种子吸胀后，保持湿度，在室温下催芽2天。

2.3.3 被检测液处理根尖

各取10粒，分别用蒸馏水（自来水）和毒液培养种子1天。

2.3.4 根尖细胞恢复培养

处理后的种子用蒸馏水（自来水）浸洗3次，每次2～3 min；将处理液洗净后，置于干净培养皿恢复22～24h；同时均设蒸馏水处理为空白对照组。以上各步操作温度均在25℃下进行。

2.3.5 根尖细胞固定

将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm左右长的幼根，用卡诺氏液固定5～6h。

2.3.6 酸解

用蒸馏水浸洗固定好的幼根3次，每次5min，吸净蒸馏水，加入盐酸酒精解离液60℃下酸解6～8min，幼根软化即可。

2.3.7染色

吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根3次，每次1～2分钟。最后浸于水中。制片前取出置载玻片上，截下1～2mm左右长的根尖，滴1-2滴改良苯酚品红染液染色20min，之后方可压片观察。

2.3.8 压片观察

对各种不同处理的根尖分生组织进行常规压片，每个处理各取3个根尖压片。在高倍镜下观察压片根尖分生区细胞分散良好的区域，并统计不少于1000个细胞中的微核数，然后再统计算出每个根尖的MCN‰。[4]

3. 结果

3.1标准规定[5]

对于蚕豆微核实验中微核千分率的计算可采用以下公式：

MCN‰=某测试样点（或对照组）观察到的MCN数／某测试样点（或对照组）观察到的细胞数×1000‰

对于污染指数（PI）的计算可采用以下公式：

PI=实验组MSN‰总数／对照组MSN‰总数

污染指数（PI）判断[6]

如果采用市售蚕豆种子，按规范操作标准实验条件（其对照本底为10‰以下），其监测样品污染程度的划分可采用“污染指数（PI）”判断。

根据《全国生物技术监测规范—蚕豆根尖微核技术》规定的污染指数划分标准，采用污染指数（PI）值来划分受污染程度。此方法可避免因实验条件等因素带来的MCN‰本底的波动，标准见表1 。凡数值在上、下限时定为上一级污染。

表1 污染指数PI值评价洗发水标准表

3.2结果

在对照组和实验组中均可见到一定数量的微核，也发现少量有丝分裂期微核，各种染色体畸变等。根据镜检统计结果，对3个实验组玻片以及对照组（蒸馏水）共计4个样本的MCN‰进行统计（表2）。

表2洗发水安全指数

结论：各样品MCN‰差异不大，但都和对照组相比差异较显著，表明洗发水存在一定致突变性，且对人体有危害，但不是很大。

4. 讨论

从以上的实验结果及分析可看到，洗发水使蚕豆根尖细胞产生微核。

微核试验是一种以染色体断裂及纺缍丝损伤等为测试终点的植

物微核监测方法，是监测致突变性污染的一种经济快速方法。致突变性和致癌高度相关, 致突变污染物中可能存在致癌危险物。通过实验表明，洗发水也具有一定的致癌性。

实验证明，微核试验作为一种监测方法，是非常行之有效的。5. 结语

微核技术作为一种新兴的生物科学短期测试方法，正在展示着强大的生命力。当然，蚕豆微核技术只适于测试潜在的染色体损伤因子，其获得的信息外推致突变物时任有一定的局限性。致突变物对蚕豆作用的机制在分子和超显微结构水平上还缺乏知识，以及在不同条件下出现的差异，材料选择，方法应用方面，都还有待进一步深入研究，统一认识。只有逐步做到规范化、标准化、微量化之后，才能更有效地发挥微核技术的优越性。[7]

参考文献

[1] 陈光荣，金波，李明等.蚕豆根尖微核技术.见：环境监测技术规范第四册生物（水环境部分）。国家环保局，1986,75～78.

[2] 金波、欧光鉴等，蚕豆根尖微核试验敏感品种的筛选.华中师范学院学报(自然科学版），1984，（2）：101～108.

[3] 陈光荣、金波、李明等.污染指数在微核技术监测水质污染中的应用.中国环境科学，1986，6（2）：60～63.

[4] 陈光荣、金波、李明等.蚕豆叶尖细胞威吓测定（MCNT）及其监测大气污染的研究.中国环境科学，1988，6（2）：3～8.

[5] 陈光荣、金波、李明等.蚕豆细胞微核技术监测农业土壤污染的研究.环境科学，1988，13（2）：74～77.

[6] 王永兴等.应用蚕豆根尖细胞微核技术监测太湖水质的研究.中国环境科学，1997，17（3）：252.

[7] 希媛媛.蚕豆根尖细胞微核技术监测黄河兰州段水质污染的研究.甘肃联合大学学报，2005，19（3）：51.