SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量解析

• 4．电渗：液体在电场中对于固体支持介质 的相对移动称为电渗。由于支持介质表面 存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基， 琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支 持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的 离子在电场作用下向电极方向移动，形成 介质表面溶液的流动。 • 当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳 速度；当电渗方向与电泳方向相反时，则 降低电泳速度。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量 • 丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方 法称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶 是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、 化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小（1～ 100 μg）、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或与 交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶。可用于蛋白质、 核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析；还 可结合解离剂十二烷基硫酸钠（SDS）以测定蛋白质亚基 的相对分子质量。 • 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）与交联剂甲撑双丙 烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，经过聚合交联形成含有 亲水性酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲撑 桥交联起来的三维网状结构的凝胶。
• 5．支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小 对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影 响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之 则泳动速度慢。
电泳技术的分类
• 1. 根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳： ①自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。②区带 电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维 薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置 形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘 状电泳、毛细管电脉等。 • 2.根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：①高 压电泳使用的电压在500～1000V，这类电泳分离速度快， 但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化 合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500 V以下， 电位梯度为2～10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢，但 对电泳设备要求简单。
【操作步骤】
一、准备与点样 • 1．将醋酸纤维薄膜切成2.5 cm×8 cm的小片。在薄膜 无光泽面距一端1.5 cm处用铅笔轻轻划一线，表示点样位 置。 • 2．将醋酸纤维薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲 溶液面上（缓冲溶液盛于培养皿中），使膜条自然下沉。 • 3．将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出， 将薄膜无光泽面向上，平放在干净滤纸上，用干净滤纸吸 去薄膜上多余的缓冲溶液。 • 4．将膜条（无光泽面向上）放于一干净滤纸上，用宽1 cm的有机玻片在盛有血清的小烧杯中蘸一下，使软片下 端粘上薄层血清，然后按在薄膜点样线上，让血清渗入膜 内，移开软片。
电泳示踪剂
• 电泳常用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。 示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液， 蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增 加，以确保样品均匀沉入加样孔内。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质
【基本原理】 • 本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清 蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5，在 pH=8.6的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷，在电 场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电 点不一，所带净电荷有差异，所以它们的泳动速 率也不同。将微量血清点于薄膜上，通电电泳后， 将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，可将血 清蛋白质分成5条区带，从正极端起分别为白蛋白、 α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。
• 3．根据电泳系统pH是否连续分为连续pＨ电泳和不连续p Ｈ电泳：①连续pH电泳是指电泳全过程中pH保持不变， ②不连续pH电泳是指电极缓冲液和电泳支持介质中的pH 不同，甚至电泳支持介质不同区段的pH也不相同，如聚 丙烯酰胺凝胶电泳。 • 4．根据工作目的和分离样品的数量多少分为分析电泳和 制备电泳。 • 5．根据结合配套的技术种类不同分为免疫电泳、层析电 泳、等电聚焦电泳、转移电泳、双相电泳、脉冲梯度电场 凝胶电泳和相互垂直交替电场凝胶电泳等。 • 6．根据电泳物质类别不同分为细胞电泳、核酸电泳、蛋 白质电泳等
• 3．电场强度：电场强度指每单位介质长度 的电位梯度（又称电位差或电位降）。一 般而言，电场强度越大，电泳速度越快。 但随着电场强度的增大会引起通过介质的 电流强度增大，从而造成电泳过程产生的 热量增多，最终导致介质温度升高。降低 电流强度，可以减少产热，但会延长电泳 时间，引起生物大分子扩散增加，同样影 响分离效果。所以电泳实验中要选择适当 的电场强度。
影响带电粒子在电场中泳动的因素
• 1．生物大分子的性质：待分离生物大分子所带电 荷的多少、分子大小和性质都会对电泳产生明显 影响。 • 2．缓冲液：缓冲液pH值直接影响生物大分子的 解离程度和带电性质，溶液pH值距离等电点愈远， 生物大分子所带净电荷就越多，电泳时速度就越 快。当缓冲液pH大于等电点时，生物大分子带负 电荷，电泳时向正极移动；当缓冲液pH小于等电 点时，生物大分子带正电荷，电泳时向负极移动。
二、电泳 • 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面 （即点样面）向下，点样端置于阴极（切勿弄错）。槽架 上四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸桥需贴紧并拉直，中间不 能下垂。如一电泳槽中同时安放多张薄膜，则薄膜之间应 相隔几毫米。盖上电泳槽盖，待平衡5分钟后通电，电压 为10 V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度），电流为0.4～ 0.6 mA/cm宽，电泳时间约1小时左右。 三、染色 • 通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑 10B的染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的 培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸 干薄膜。
实验二 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
来自百度文库
• 电泳（electrophoresis）是指带电颗粒在电场中 的泳动。许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、 蛋白质、核苷酸、核酸等都含有可电离基团，在 非等电点条件下带有电荷，在电场力的作用下， 它们向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳技 术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、 形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而 对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。 可用于样品的制备、 纯度鉴定、分子量测定等。