SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量解析
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。
下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。
SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。
相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。
蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。
通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。
这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。
SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。
（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。
这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。
（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。
随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。
（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。
目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。
SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。
其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。
通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。
二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。
它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。
通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
三、实验步骤1.准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。
2.制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。
3.制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。
4.制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。
5.电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。
打开电源，调整电流和电压，开始电泳。
6.染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。
7.相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。
四、结果分析通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。
通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。
此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。
5 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
实验SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量一、目的了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。
二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。
本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。
三、试剂和器材（一）试剂1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。
2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。
18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。
3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。
6gTris,少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。
4. 10%SDS，室温保存。
5. 两类样品缓冲液：2倍还原缓冲液（2×reducing buffer）0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml甘油 2.0 ml质量浓度10%SDS 4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇 1.0 ml总体积10 ml6. 电极缓冲液，pH8.3。
Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
SDS与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。蛋白 质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中 的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复 合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的 大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁 移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒 的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下 端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配 制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶 模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还 原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并 结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质），形成蛋白质-SDS复合物。由 于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电 荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差异。
剥胶示意图
七、染色和脱色
倾出固定液，加入染色液。染色过夜。 染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。数小时 换一次脱色液，直至背景清晰，约需一昼夜。
八、Mr的计算
量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mr：
蛋白质样品迁移距离(cm) 相对迁移率mr = 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量
实验 6 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的学习并掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法；掌握垂直板电泳的操作方法；运用SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。
实验原理1、在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。
根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。
2、在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质-SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3、当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：㏒10Mr = －b·m R+ K（式中：Mr为蛋白质分子量，m R为相对迁移率，b为斜率，K为截距。
在条件一定时，b 和K均为常数。
）若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
实验步骤1.装板：将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。
将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上。
（夹子离梳子底边约2mm）2. 制备分离胶：在烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。
项目分离胶的配制（10ml）30% 丙烯酰胺（ml） 3.4分离胶缓冲液，pH8.8（ml） 2.4H2O （ml） 4.110% 过硫酸铵（ml）0.1TEMED（μl）10凝胶液的灌注和聚合：将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，然后加乙醇。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种经常使用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合进程由自由基催化完成。
的经常使用方式有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以(TEMED)为加速剂。
在聚合进程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维。
PAGE依照其有无浓缩效应，分为持续系统和不持续系统两大类，持续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，要紧靠电荷和。
不持续系统中由于离子成份，pH，凝胶浓度及电位梯度的不持续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因此其分离条带清楚度及分辨率均较前者佳。
不持续体系由电极缓冲液、浓缩胶及所组成。
浓缩胶是由AP 而成的大孔胶，凝胶缓冲液为的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为Tris-HCl。
电极缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH 值使不持续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成份的不持续性，这是样品浓缩的要紧因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的断裂。
在和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，如此就排除不同分子间的电荷不同和结构不同。
SDS-PAGE一样采纳的是不持续缓冲系统，与持续缓冲系统相较，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，通过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭小的区带。
SDSPAGE测量蛋白质分子量解析
10%Ap
150µl
TEMED
500µl
浓缩胶(5% 5ml)
3.2ml
0.85ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.65ml
50µl
50µl
200µl
3.样品及MW标准参照物溶液的制备
样品溶液和上样缓冲液混匀，使用前在100℃水浴 1min，以除去可能出现的亚稳态聚合物。
Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最 后用蒸馏水容至100ml。
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+
溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.3TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘 氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加 蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
4.上样。 15μl/孔
5.电泳
上槽接负极，下槽接正极，打开电泳仪开关，开始时 将电流调至10mA，待样品进入分离胶时，将电流调 至20-30mA。待指示剂染料靠迁移至下沿1～1.5cm 处停止电泳，需2～3h。
6.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，将凝胶放入0.05% 考马斯亮蓝R250（内含20％磺基水杨酸）染色液中，
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。
在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
【实验原理】
当蛋白质的分子量在15,000～200,000之间时， 蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质相对分子 质量的对数呈线性关系：
lgMr = K - bm 将已知相对分子质量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳迁移率对Mr的对数作图，即可得到一条标 准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件 下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下 端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配 制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶 模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图， 得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线 上查出其相对分子质量。标准蛋白质相对分子质量从大到 小依次为116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4 KDa。
【注意事项】
1、再用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子 质量时，每次测定样品必须同时作标准曲线， 而不能用上一次电泳的标准曲线；
浓缩胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 浓缩胶缓冲液(pH6.8)
10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 总体积
4%(ml) 3.05 0.65 1.25 0.05 0.03 0.05 5ml
二、凝胶的制备
2、浓缩胶的制备 按表配制浓缩胶，混匀后用细长头的滴管将凝 胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至距短玻璃 片上缘1 cm处，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内 （插入“梳子” 的目的是使胶液聚合后，在凝胶 顶部形成数个相互隔开的凹槽）。约30 min后凝 胶聚合，再放置30 min。小心拔去“梳子”，用 窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
CH2=CH C=O NH2
CH2=CH
丙烯酰胺
C=O NH CH2
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH C=O C=O C=O NH2 NH NH2 CH2 NH C=O CH2-CH
NH C=O CH2=CH N, N’-甲叉 N’双丙烯酰胺
( CH2-CH )nCH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH
当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 蛋 17,000 之间时 白质-SDS复合物 复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 数呈线性关系： 数呈线性关系：
lgMW = K - bm
C=O NH2 C=O NH2
化学性质稳定， PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变 机械强度好 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得 不同孔径的凝胶。 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。 浓度或Acr 的比例可以得到 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。 连续系统电 PAGE 分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统 电 分为连续系统和不连续系统两大类 泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同. 泳体系中 缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场 缓冲液 pH 值与凝胶中的相同 作用下，主要靠电荷和分子筛效应 不连续系统中带电 靠电荷和分子筛效应。 作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电 颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应， 颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具 有浓缩效应， 有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者 佳。
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS测定蛋白质相对分子质量一、实验目的：通过SDS-技术测定蛋白质的相对分子质量。
二、实验原理：SDS-是一种常用的蛋白质电泳分离技术。
在该技术中，蛋白质样品与SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂混合后，加热可以使蛋白质完全还原并且与SDS结合，形成具有负电荷的复合物。
这些复合物在电场中按照其分子质量大小被分离。
蛋白质样品在SDS-中首先经过堆胶，即在样品中添加聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质被沿着凝胶的宽度扩散，形成连续的蛋白质稜。
然后，电泳阶段开始，电场通过凝胶，带动带电的蛋白质稜向阳极迁移。
三、实验步骤：1.准备SDS-电泳胶液：根据使用说明配制3种浓度的聚丙烯酰胺凝胶胶液，即5%堆胶胶液、12%分离胶液和4%扩散胶液。
2. 准备样品：取相应的蛋白质样品，如细胞裂解液，将其与试剂R （含有30%甘油和2%β-巯基乙醇酰胺）和Laemmli试剂混合，以加热破坏蛋白质的二级结构。
3.堆胶：将堆胶胶液慢慢注入电泳槽中，留出足够的空间来注入分离胶液。
4.加载样品：在样品孔中加入相应数量的样品、分子量标记和模板。
5.电泳：将电泳槽连接到电源，调节电压，使电流保持稳定。
首先进行堆胶阶段，然后切换到电泳阶段，直至蛋白质移动到凝胶底部。
6. 凝胶染色：取下凝胶，用凝胶染色剂对凝胶进行染色。
一般常用染色剂有银染和Coomassie蓝染。
四、实验结果：根据实验步骤描述的方法进行实验后，我们观察到在凝胶上出现了多条蛋白质条带，每条条带代表一个蛋白质。
条带的颜色越深，表示其含量越多。
通过与分子量标记的对照，可以确定蛋白质的相对分子质量。
五、实验讨论与分析：根据实验结果，我们可以推断蛋白质的相对分子质量。
相对分子质量可以通过标准曲线法来计算，即通过已知相对分子质量的蛋白质标准品的移动距离与其相对分子质量之间的线性关系来推断未知蛋白质的相对分子质量。
通过SDS-技术测定蛋白质相对分子质量具有许多优点：能够同时分离多个蛋白质；能够对蛋白质进行集中分析；精确测量蛋白质的相对分子质量以及群体分子质量等。
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量
SDS—PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量实验目的了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术.学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
实验原理SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,.1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少.2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下,大多数蛋白质与SDS的结合比为1。
4gSDS/1g蛋白质）,使各种蛋白质-SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时,电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程:1gMr =K―bm R式中:Mr为蛋白质的分子量;K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。
在条件一定时，b和K均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图,可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
仪器、原料和试剂仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源;50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅,染色槽;烧杯;吸量管；常头滴管等。
原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5～1mg·ml-1样品溶解液配制。
可配制成单一蛋白质标准液,也可配成混合蛋白质标准液。
试剂:(1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8。
9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36。
3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（2）浓缩胶缓冲液(Tris—HCl缓冲液PH6.7)：取1mol/L盐酸48mL，Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100mL.(3)30％分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺(Acr）30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0。
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析技术，用于测定蛋白质的相对分子质量。
SDS-PAGE原理基于以下几个关键步骤：
1. 蛋白样品的准备：将待测蛋白样品与SDS（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质表面被负电荷包裹。
2. 样品加载和电泳过程：将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）中的孔洞中。
通常采用垂直电泳方式进行，将正电极和负电极连接至凝胶两端，通过电场使蛋白质向电泳方向迁移。
3. 分子分离：在电泳过程中，由于SDS的存在，样品中的蛋白质被完全解聚并带负电荷，使每个蛋白质分子的移动速率只与其相对分子质量成正比。
较小的蛋白质能够在凝胶中更快地迁移，较大的蛋白质则移动速率较慢。
4. 染色和可视化：电泳结束后，使用染色剂（如Coomassie蓝染色剂）将蛋白质染色，使其可见。
通过测量蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以估计蛋白质的相对分子质量。
总结：SDS-PAGE利用SDS使蛋白质解聚并带负电荷，在电泳过程中按照相对分子质量的大小分离蛋白质，通过染色和测量蛋白质的迁移距离来估计其相对分子质量。
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• 5．支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小 对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影 响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之 则泳动速度慢。
电泳技术的分类
• 1. 根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳： ①自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。②区带 电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维 薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置 形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘 状电泳、毛细管电脉等。 • 2.根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：①高 压电泳使用的电压在500～1000V，这类电泳分离速度快， 但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化 合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500 V以下， 电位梯度为2～10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢，但 对电泳设备要求简单。
• 4．电渗：液体在电场中对于固体支持介质 的相对移动称为电渗。由于支持介质表面 存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基， 琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支 持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的 离子在电场作用下向电极方向移动，形成 介质表面溶液的流动。 • 当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳 速度；当电渗方向与电用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。 示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液， 蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增 加，以确保样品均匀沉入加样孔内。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质
【基本原理】 • 本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清 蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5，在 pH=8.6的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷，在电 场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电 点不一，所带净电荷有差异，所以它们的泳动速 率也不同。将微量血清点于薄膜上，通电电泳后， 将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，可将血 清蛋白质分成5条区带，从正极端起分别为白蛋白、 α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。
【操作步骤】
一、准备与点样 • 1．将醋酸纤维薄膜切成2.5 cm×8 cm的小片。在薄膜 无光泽面距一端1.5 cm处用铅笔轻轻划一线，表示点样位 置。 • 2．将醋酸纤维薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲 溶液面上（缓冲溶液盛于培养皿中），使膜条自然下沉。 • 3．将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出， 将薄膜无光泽面向上，平放在干净滤纸上，用干净滤纸吸 去薄膜上多余的缓冲溶液。 • 4．将膜条（无光泽面向上）放于一干净滤纸上，用宽1 cm的有机玻片在盛有血清的小烧杯中蘸一下，使软片下 端粘上薄层血清，然后按在薄膜点样线上，让血清渗入膜 内，移开软片。
• 3．根据电泳系统pH是否连续分为连续pＨ电泳和不连续p Ｈ电泳：①连续pH电泳是指电泳全过程中pH保持不变， ②不连续pH电泳是指电极缓冲液和电泳支持介质中的pH 不同，甚至电泳支持介质不同区段的pH也不相同，如聚 丙烯酰胺凝胶电泳。 • 4．根据工作目的和分离样品的数量多少分为分析电泳和 制备电泳。 • 5．根据结合配套的技术种类不同分为免疫电泳、层析电 泳、等电聚焦电泳、转移电泳、双相电泳、脉冲梯度电场 凝胶电泳和相互垂直交替电场凝胶电泳等。 • 6．根据电泳物质类别不同分为细胞电泳、核酸电泳、蛋 白质电泳等
影响带电粒子在电场中泳动的因素
• 1．生物大分子的性质：待分离生物大分子所带电 荷的多少、分子大小和性质都会对电泳产生明显 影响。 • 2．缓冲液：缓冲液pH值直接影响生物大分子的 解离程度和带电性质，溶液pH值距离等电点愈远， 生物大分子所带净电荷就越多，电泳时速度就越 快。当缓冲液pH大于等电点时，生物大分子带负 电荷，电泳时向正极移动；当缓冲液pH小于等电 点时，生物大分子带正电荷，电泳时向负极移动。
实验二 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
• 电泳（electrophoresis）是指带电颗粒在电场中 的泳动。许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、 蛋白质、核苷酸、核酸等都含有可电离基团，在 非等电点条件下带有电荷，在电场力的作用下， 它们向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳技 术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、 形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而 对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。 可用于样品的制备、 纯度鉴定、分子量测定等。
• 3．电场强度：电场强度指每单位介质长度 的电位梯度（又称电位差或电位降）。一 般而言，电场强度越大，电泳速度越快。 但随着电场强度的增大会引起通过介质的 电流强度增大，从而造成电泳过程产生的 热量增多，最终导致介质温度升高。降低 电流强度，可以减少产热，但会延长电泳 时间，引起生物大分子扩散增加，同样影 响分离效果。所以电泳实验中要选择适当 的电场强度。
二、电泳 • 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面 （即点样面）向下，点样端置于阴极（切勿弄错）。槽架 上四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸桥需贴紧并拉直，中间不 能下垂。如一电泳槽中同时安放多张薄膜，则薄膜之间应 相隔几毫米。盖上电泳槽盖，待平衡5分钟后通电，电压 为10 V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度），电流为0.4～ 0.6 mA/cm宽，电泳时间约1小时左右。 三、染色 • 通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑 10B的染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的 培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸 干薄膜。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量 • 丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方 法称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶 是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、 化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小（1～ 100 μg）、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或与 交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶。可用于蛋白质、 核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析；还 可结合解离剂十二烷基硫酸钠（SDS）以测定蛋白质亚基 的相对分子质量。 • 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）与交联剂甲撑双丙 烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，经过聚合交联形成含有 亲水性酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲撑 桥交联起来的三维网状结构的凝胶。