病毒学- 病毒的检验PPT课件
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《病毒的检测》课件
病毒的危害
病毒可以引起各种疾病， 包括感冒、流感、艾滋病 等，对人类和动物健康造 成威胁。
病毒的分类
DNA病毒
DNA病毒以DNA为遗传物质， 感染宿主细胞后，将其DNA 插入宿主细胞的染色体中。
RNA病毒
RNA病毒以RNA为遗传物质， 感染宿主细胞后，将其RNA 整合到宿主细胞的核酸中。
逆转录病毒
快速检测法
快速检测法通过对病毒的核酸、蛋白 质或特定抗原的特异性检测，快速确 定样本中是否存在病毒。
病毒检测实验
1 实验前准备
准备实验室材料、培养 细胞、制备病毒样本， 并按照实验方案进行实 验。
2 病毒检测实验步骤
将病毒样本加入培养细 胞中，观察细胞的形态 和行为变化，以确定是 否存在病毒感染。
未来病毒检测将更加快速、准确和便捷，为疾病的预防和治疗提欢迎大家来到《病毒的检测》PPT课件。在这个课程中，我们将介绍病毒的 特征、分类和检测方法，以及进行病毒检测实验的步骤和结果分析。
概述
什么是病毒
病毒是一种微生物，由蛋 白质和核酸构成，无法独 立进行自我复制，需要感 染宿主细胞。
病毒的特征
病毒具有很小的体积和简 单的结构，可以感染各种 生物，包括人类、动物和 植物。
3 实验结果分析
根据细胞的形态和行为 变化，判断样本中是否 存在病毒，并分析病毒 的类型和浓度。
结语
病毒检测的意义
病毒检测可以帮助我们了解病毒的传播途径和危害，为疾病的预防和治疗提供依据。
病毒检测在防控疫情中的作用
病毒检测可以快速发现感染者，控制疫情的扩散，保护公共卫生安全。
未来病毒检测的发展方向
逆转录病毒包含逆转录酶， 能将自己的RNA转录成DNA， 然后将其插入宿主细胞的染 色体。
病毒检测PPT课件
胶体金结构
• 由一个基础金核（原子 金Au）及包围在外的 双离子层构成，紧连在 金核表面的是内层负离 子（AuCl2-），外层离 子层H+则分散在胶体 间溶液中，以维持胶体 金游离于溶胶间的悬液 状态。
胶体金性质
• 染色—不同粒径，不同颜色 2~5nm：橙色、10~20nm：酒红色、 30~80nm：紫红色 • 胶体的特性—充分的溶解性，良好的流动性 • 吸附能力—在不改变蛋白性质的情况下，稳 定迅速的吸附蛋白
• 快速，定性：10min中以内就可以得到 检测结果。 • 无需设备：一根检测条就能完成检测。 • 准确，灵敏：灵敏度可达到10-9数量级
胶体金免疫层析试纸条的构成
GICA反应模式
A 双抗体夹心法测抗原
B.竞争法测抗原
C.间接法测抗体（反流免疫层析法）
胶体金免疫层析技术应用
梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)
包被抗体
固相载体
牛血清白蛋白
ELISA的酶应符合以下要求：
纯度高； 催化反应的转化率高； 专一性强； 性质稳定； 来源丰富； 价格低廉； 制备成酶结合物后仍继续保留活性和催化能力； 在受检标本中不存在相同的酶； 相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定。
胶体金颗粒对蛋 白质有很强的吸附能 力，而不破坏其生物 活性，可以与蛋白质 （葡萄球菌 A 蛋白， 免疫球蛋白）等非共 价结合，形成胶体金 标记物。
胶体金免疫层析技术
以胶体金为显色媒介，利用免疫学中 抗原抗体能够特异性结合原理，在层析过 程中完成这一反应，从而达到检测的目的。
胶体金免疫层析技术特点
梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）
原理：用超声裂解的梅毒螺旋体为抗 原，致敏经醛化、鞣化的羊或禽类红细胞， 此致敏红细胞与人血清或血浆中的梅毒螺 旋体抗体结合，产生肉眼可观察的凝集反 应。
病毒学- 病毒的检验汇总
可直接用纯化的病毒核酸通过电镜观察，对 其进行鉴定。但技术要求较高。 近年来,PCR核酸测序技术的应用使得病毒核 酸型鉴定的可行性大为增加。 （观看PCR视频）
②脂溶性试验
用乙醚或氯仿处理待检病毒液,而后与未处理 者比较其TCID50的变化,以判断是否敏感。 乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等脂溶剂能破坏病 毒的脂质包膜。 有包膜的病毒对脂溶剂敏感,受脂溶剂的处理 能使病毒失去感染性;无包膜的病毒往往对脂 溶剂有抵抗力。因此,用乙醚等可以鉴定所分 离的病毒是否有包膜。
病毒粒的结构模式图
包膜子粒
包膜
包膜病毒
壳粒
衣壳
核衣壳
核心（核样物）
处理方法:
将病毒悬液2000~3000r/min离心20min,取上清液,分成 两组： 一组为试验组：按与乙醚4:1的比例振荡混合均匀,管口 密封好,4℃过夜后,2000~3000r/min离心20min。此时液 体分为两层,上层为乙醚,下层为病毒液。吸取下层部分, 避免混有乙醚。 另一组为对照组：不加乙醚,处理方法同试验组。 将两组的病毒液同时测定病毒滴度,如果试验组病毒滴 度明显降低,与对照组有明显差异,说明病毒对乙醚敏感, 属于有膜病毒。如果两组的病毒滴度没有显著差异,说 明病毒对乙醚有抵抗力,属于无膜病毒。
(2)病毒的生物学特性 ①细胞病变效应
哪三种现象？
病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。 不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细 胞病变效应。 例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上,出现细胞融合, 产生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、 肾综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到 WI-38或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨 大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使 细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病 毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。
病毒学-病毒的检验-医学课件
病毒的进化与变异
02
病毒检验的基本原理与方法
病毒检验是指通过实验室技术和方法，对病毒进行分离、鉴定、检测和计数等操作，以提供关于病毒的种类、数量、毒力等信息的过程。
病毒检验的定义
病毒检验对于诊断病毒感染、研究病毒感染的机制、流行病学调查以及疫苗研发等方面都具有非常重要的意义。
病毒检验的重要性
病毒检验的定义与重要性
谢谢您的观看
THANKS
病毒分类
病毒的定义与分类
宿主范围
每种病毒都有特定的宿主范围，包括动物、植物和微生物等。
致病性
病毒的致病性取决于其侵袭宿主细胞和免疫反应的能力，不同的病毒可以引起不同的疾病症状。
病毒的宿主范围与致病性
病毒进化
病毒在传播和繁殖过程中会发生基因突变和基因重组等进化现象。
病毒变异
病毒变异可以导致病毒的抗原性改变、毒力增强或传播途径多样化等。
要点三
预防措施
加强宣传教育，提高公众对病毒感染的防护意识；加强场所卫生管理，做好消毒和隔离措施；控制疫情传播途径，如封闭疫区、限制人员流动等。
要点一
要点二
临床治疗
病毒感染尚无特效药物，以对症治疗和支持治疗为主，同时针对不同病毒感染的特点进行特殊治疗。
疫苗接种
针对部分病毒感染，如流感病毒，接种疫苗可有效降低感染风险和减轻病情。
xx年xx月xx日
病毒学-病毒的检验-医学课件
CATALOGUE
目录
病毒学概述病毒检验的基本原理与方法病毒学应用病毒感染的诊断与防控病毒学研究的发展趋势与挑战
01
病毒学概述
病毒是一种微生物，具有遗传物质（DNA或RNA）和蛋白质外壳，通过感染宿主细胞进行复制和传播。
病毒学-病毒的检验PPT
分子生物学检验
基因测序
对病毒基因组进行测序分析，可精确 鉴定病毒种类和变异情况，为病毒溯 源和防控提供重要依据。
基因芯片技术
利用芯片上固化的探针与病毒核酸进 行杂交，实现对病毒基因组的快速检 测和分型。
免疫学检验
血清学试验
通过检测血清中的病毒抗体，了解机体对病毒的免疫应答和病毒感染状态，如抗 体效价检测、中和试验等。
病毒的纯化与鉴定
纯化方法
采用物理、化学或免疫学方法对病毒 进行纯化，以去除杂质。
鉴定方法
纯化与鉴定注意事项
确保纯化的病毒具有代表性，且无交 叉污染，同时要选择适当的鉴定方法， 以保证结果的准确性和可靠性。
通过电镜观察、免疫学检测、分子生 物学等方法对病毒进行鉴定。
04 病毒的基因组与蛋白质组 研究
免疫荧光技术
利用荧光物质标记抗体或抗原，与细胞或组织中的相应抗原或抗体结合，通过荧 光显微镜观察实现病毒的定位和定性检测。
03 病毒的分离与培养
病毒的分离
01
02
03
分离方法
根据病毒的特性，选择合 适的分离方法，如细胞培 养、鸡胚接种、动物接种 等。
分离过程
将病毒从感染的细胞、组 织或动物中分离出来，并 进行初步的纯化。
病毒基因组的结构与功能
病毒基因组的结构
病毒基因组通常由单链或双链DNA或RNA构成，具有特定的 基因排列顺序。
病毒基因组的功能
病毒基因组通过编码蛋白质和调控蛋白来行使复制、转录、 翻译等功能，以实现病毒的增殖和感染过程。
病毒蛋白质的结构与功能
病毒蛋白质的结构
病毒蛋白质具有特定的空间构象和氨 基酸序列，决定了其生物学功能。
病毒培养
将病毒接种在敏感细胞或动物中 ，观察病毒的繁殖过程和细胞病 变，是形态学检验的重要手段。
病毒学(全套课件180页)
具有反转录过程的病毒
反转录病毒科（Retroviridae)
RNA病毒
嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)
DNA病毒，感染人。
反录病毒科Retroviridae
甲型反转录病毒属 禽白血病病毒 乙型反转录病毒属 小鼠乳腺瘤病毒 丙型反转录病毒属小鼠白血病病毒 猫白血病病毒 丁型反转录病毒属 牛白血病病毒 戊型反转录病毒属 大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒 慢病毒属 人免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒、 泡沫病毒属 牛泡沫病毒
laryngotracheitis virus)
鸭瘟病毒(Duck plague virus)
1. 伪狂犬病病毒 Pseudorabies virus
引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为 主要特征的一种疾病。
猪作为本病毒的原始宿主和 储存宿主在病毒的保存和传 播中起着重要作用。
仅1个血清型。
三、复制
◇□→□□ + ◇◇ →□□ □□ →
注：◇表示PrPc ，□表示PrPsc
四、致病机制
致病的基本条件是必须同时具备朊病毒和朊病毒蛋白 PrPsc大量聚集，形成痒病相关纤维（SAF），在脑组
织中形成空斑
痒病相关纤维
五、致病性
病理变化: 海绵状脑病。脑组织空泡变性，淀粉样蛋白
斑块，神经胶质细胞增生等。
牛海绵状脑病
bovine spongiform encephalopathy, BSE
俗称“疯牛病”，表现突然发作、运动失调、性情暴躁 等
致病性：病变仅见于脑，神经元变性、空泡化；无炎症反应和
免疫反应，无宿主特异性。
诊断：
（1）脑组织病理组织学检查 （2）免疫酶组化 （3）免疫转印
防制：严格检疫，一经发现，坚决销毁
反转录病毒科（Retroviridae)
RNA病毒
嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)
DNA病毒，感染人。
反录病毒科Retroviridae
甲型反转录病毒属 禽白血病病毒 乙型反转录病毒属 小鼠乳腺瘤病毒 丙型反转录病毒属小鼠白血病病毒 猫白血病病毒 丁型反转录病毒属 牛白血病病毒 戊型反转录病毒属 大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒 慢病毒属 人免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒、 泡沫病毒属 牛泡沫病毒
laryngotracheitis virus)
鸭瘟病毒(Duck plague virus)
1. 伪狂犬病病毒 Pseudorabies virus
引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为 主要特征的一种疾病。
猪作为本病毒的原始宿主和 储存宿主在病毒的保存和传 播中起着重要作用。
仅1个血清型。
三、复制
◇□→□□ + ◇◇ →□□ □□ →
注：◇表示PrPc ，□表示PrPsc
四、致病机制
致病的基本条件是必须同时具备朊病毒和朊病毒蛋白 PrPsc大量聚集，形成痒病相关纤维（SAF），在脑组
织中形成空斑
痒病相关纤维
五、致病性
病理变化: 海绵状脑病。脑组织空泡变性，淀粉样蛋白
斑块，神经胶质细胞增生等。
牛海绵状脑病
bovine spongiform encephalopathy, BSE
俗称“疯牛病”，表现突然发作、运动失调、性情暴躁 等
致病性：病变仅见于脑，神经元变性、空泡化；无炎症反应和
免疫反应，无宿主特异性。
诊断：
（1）脑组织病理组织学检查 （2）免疫酶组化 （3）免疫转印
防制：严格检疫，一经发现，坚决销毁
病毒学PPT课件
3. 抗生素、中草药
思考题
▪ 病毒的特点？病毒的结构组成及功能？
▪ 病毒的增殖过程？
第十六章 病毒的感染与免疫p151
病毒的感染 一、病毒的传播方式与途径
（一）水平传播（horizontal transmission) 含义：病毒在人群个体间的传播
1. 通过黏膜表面传播： 呼吸道、口腔消 途径 化道、泌尿道
2. 亚病毒
(1) 卫星病毒（salelletes）----单链RNA
一类可编码自身的衣壳蛋白 一类需利用辅助病毒的蛋白衣壳，曾被称拟病毒
(2) 类病毒（viroids）
单链环状RNA分子，不含蛋白质，无包膜和衣壳
(3) 朊粒（prion）
由一种耐蛋白酶K的蛋白分子组成，具有感染性，没有 核酸 。
三. 病毒的增殖
方式：主要是复制 周期: 吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装、释放
1. 吸附和穿入（absorption and penetration）
吸附 : 病毒表面结构和与靶细胞膜特异受体结合 穿入 : 膜融合—有膜病毒 胞饮——无膜病毒
其他方式
HIV吸附宿主细胞
HIV
三. 病毒的增殖 2.脱壳（uncoating）
天花病毒
天花病人
美本土发现首例疯牛病 以色列养鸡场受禽流感袭击
SARS流行
第十五章 病毒的基本性状
一、病毒的大小与形态
病毒体(virion)：是指结构完整，成熟的、 具 有感染性的病毒颗粒。
1. 病毒大小 测量病毒大小的单位 : nm 2. 病毒形态 多数呈球形或近似球形.
小RNA病毒
当缺陷病毒与其他病毒共同感染细胞时，若后者能为前者提供所 缺乏的物质，就能使缺陷病毒完成正常增殖，这种有辅助作用的病 毒称辅助病毒。
思考题
▪ 病毒的特点？病毒的结构组成及功能？
▪ 病毒的增殖过程？
第十六章 病毒的感染与免疫p151
病毒的感染 一、病毒的传播方式与途径
（一）水平传播（horizontal transmission) 含义：病毒在人群个体间的传播
1. 通过黏膜表面传播： 呼吸道、口腔消 途径 化道、泌尿道
2. 亚病毒
(1) 卫星病毒（salelletes）----单链RNA
一类可编码自身的衣壳蛋白 一类需利用辅助病毒的蛋白衣壳，曾被称拟病毒
(2) 类病毒（viroids）
单链环状RNA分子，不含蛋白质，无包膜和衣壳
(3) 朊粒（prion）
由一种耐蛋白酶K的蛋白分子组成，具有感染性，没有 核酸 。
三. 病毒的增殖
方式：主要是复制 周期: 吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装、释放
1. 吸附和穿入（absorption and penetration）
吸附 : 病毒表面结构和与靶细胞膜特异受体结合 穿入 : 膜融合—有膜病毒 胞饮——无膜病毒
其他方式
HIV吸附宿主细胞
HIV
三. 病毒的增殖 2.脱壳（uncoating）
天花病毒
天花病人
美本土发现首例疯牛病 以色列养鸡场受禽流感袭击
SARS流行
第十五章 病毒的基本性状
一、病毒的大小与形态
病毒体(virion)：是指结构完整，成熟的、 具 有感染性的病毒颗粒。
1. 病毒大小 测量病毒大小的单位 : nm 2. 病毒形态 多数呈球形或近似球形.
小RNA病毒
当缺陷病毒与其他病毒共同感染细胞时，若后者能为前者提供所 缺乏的物质，就能使缺陷病毒完成正常增殖，这种有辅助作用的病 毒称辅助病毒。
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病毒学- 病毒的检验
常用的病毒检验方法包括：
一、病毒的分离鉴定 二、病毒感染性的检测 三、病毒颗粒检测 四、病毒的血清学检查 五、病毒的分子(蛋白和核酸)检测
一、病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直 接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学 研究提供材料。 病毒的分离和鉴定（含义）：指从病人、带 毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理, 采用一系列物理、化学、生物学等手段,将病 毒从标本中分离出来,并通过有关特异性方法 鉴定属于何种病毒,这一方法称为病毒的分离 与鉴定。
（2）鸡胚培养法
鸡胚对多种病毒敏感。 不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异 很大,因此选择适当的接种途径是病毒分离成 功的关键。 一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类 不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位， 最常用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、绒毛尿 囊膜、卵黄囊和羊膜腔等。
（3）细胞培养 (cell culture)法或 组织培养法 (tissue culture)
病毒的分离与鉴定包括：
1病毒的形态学观察→4、 病毒的理化特性测定→5、病毒的血清
学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本
过程。
（一）标本的采取与送检
病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。 一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌 物或粪便等,主要因动物及病毒的种类而异, 例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻 幼犬或犊牛的粪便;
标本处理：
采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适 当的处理,以保证病毒分离的成功几率。 采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴 结等,可取一小块进行充分研磨,加入含青、链霉素的 Hanks液,离心取上清液作为接种物; 鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入 高浓度的抗生素,充分混匀后,置4℃冰箱内处理2~4h 或过夜,离心后取上清做接种用; 咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%小牛血 清和一定浓度的青、链霉素的Hanks液中,充分刷洗 棉拭子,反复冻融3~5次,离心后取上清液作为接种材料。
P36
常见人类病毒的敏感细胞
P36
（4）分子生物学技术
对体外培养的细胞、鸡胚、动物不敏感的病 毒,可采用现代分子生物学技术,如基因克隆技 术,对病毒的全基因进行克隆,构建表达载体, 并能表达出病毒样颗粒。
（三）病毒的鉴定
步骤： 1、初步鉴定
2、接种动物的观察
3、最终鉴定
1、初步鉴定
(1)根据临床表现、流行病学特征与标本来源。 初步判定属于哪一类病毒 脑炎患者→脑脊液→ 乙型脑炎病毒 秋季腹泻病人→粪便→轮状病毒 发烧小孩（下肢麻痹）→粪便→脊髓灰质炎 病毒
(2)病毒的生物学特性 ①细胞病变效应
哪三种现象？
病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。 不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细 胞病变效应。 例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上,出现细胞融合, 产生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、 肾综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到 WI-38或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨 大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使 细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病 毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。
（二）病毒的分离与培养
细胞培养、鸡胚和实验动物可用于病毒的分离与培养, 其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。 用于病毒分离与培养的细胞有原代细胞、二倍体细胞 株和传代细胞系,一般说来,本动物的原代细胞最为敏 感,但不如传代细胞方便易得. 例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原 代或二倍体细胞,但该细胞生长缓慢,通常用PD5(猪甲 状腺细胞系)取代。 培养方法常用的有静置培养和旋转培养,有的病毒如 轮状病毒,初次分离时旋转培养的成功率较静置培养 高。
1、病毒的分离
不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主 要取决于目的病毒的生物学特性。 主要有细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种 法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物 模型的病毒,可采用基因克隆的方法。
（1）动物接种法
是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类 不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜 神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内， 痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。 动物的接种途径要根据病毒种类、实验动物 种类、接种材料等选择合适的接种途径。动 物接种途径的选择正确与否对提高病毒分离 成功率也起到重要作用。
怀疑为口蹄疫的猪或牛,则应采其水疱液及水疱 皮送检。
应注意下列原则：
1.对本身带有杂菌 (如咽喉拭子、粪便) 或易 受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应 使用抗生素。 2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低温 保存并尽快送检。 3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病 后2～3w内各取1份血清，以便对比双份血清 抗体效价的动态变化。
是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培 养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用 的基本方法。
一般选择生长旺盛的敏感细胞用于病毒分离。 少数病毒例外,例如犬、猪等的细小病毒,病毒 的复制有赖于分裂旺盛的细胞,因此需将病毒 接种与细胞培养同步进行。 细胞培养技术在病毒发现、病毒研究、疫苗 研制、抗病毒药物筛选等病毒学发展的历程 中发挥着重要作用。
常见病毒常用实验动物及接种途径
P37
实验动物采血
在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特 异性抗体。 实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。
致死性采血是指尽量采集动物血,直至动物死亡。
非致死性采血是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。 对采血动物,应在禁食24h后采血。采血应无菌操作。 不同动物采用不同的采血方法。常用的有心脏采血法、 眼眶采血法、颈静脉采血法、颈动脉采血法、耳静脉采 血法等。根据实验动物和实验条件灵活选用。
常用的病毒检验方法包括：
一、病毒的分离鉴定 二、病毒感染性的检测 三、病毒颗粒检测 四、病毒的血清学检查 五、病毒的分子(蛋白和核酸)检测
一、病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直 接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学 研究提供材料。 病毒的分离和鉴定（含义）：指从病人、带 毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理, 采用一系列物理、化学、生物学等手段,将病 毒从标本中分离出来,并通过有关特异性方法 鉴定属于何种病毒,这一方法称为病毒的分离 与鉴定。
（2）鸡胚培养法
鸡胚对多种病毒敏感。 不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异 很大,因此选择适当的接种途径是病毒分离成 功的关键。 一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类 不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位， 最常用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、绒毛尿 囊膜、卵黄囊和羊膜腔等。
（3）细胞培养 (cell culture)法或 组织培养法 (tissue culture)
病毒的分离与鉴定包括：
1病毒的形态学观察→4、 病毒的理化特性测定→5、病毒的血清
学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本
过程。
（一）标本的采取与送检
病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。 一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌 物或粪便等,主要因动物及病毒的种类而异, 例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻 幼犬或犊牛的粪便;
标本处理：
采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适 当的处理,以保证病毒分离的成功几率。 采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴 结等,可取一小块进行充分研磨,加入含青、链霉素的 Hanks液,离心取上清液作为接种物; 鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入 高浓度的抗生素,充分混匀后,置4℃冰箱内处理2~4h 或过夜,离心后取上清做接种用; 咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%小牛血 清和一定浓度的青、链霉素的Hanks液中,充分刷洗 棉拭子,反复冻融3~5次,离心后取上清液作为接种材料。
P36
常见人类病毒的敏感细胞
P36
（4）分子生物学技术
对体外培养的细胞、鸡胚、动物不敏感的病 毒,可采用现代分子生物学技术,如基因克隆技 术,对病毒的全基因进行克隆,构建表达载体, 并能表达出病毒样颗粒。
（三）病毒的鉴定
步骤： 1、初步鉴定
2、接种动物的观察
3、最终鉴定
1、初步鉴定
(1)根据临床表现、流行病学特征与标本来源。 初步判定属于哪一类病毒 脑炎患者→脑脊液→ 乙型脑炎病毒 秋季腹泻病人→粪便→轮状病毒 发烧小孩（下肢麻痹）→粪便→脊髓灰质炎 病毒
(2)病毒的生物学特性 ①细胞病变效应
哪三种现象？
病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。 不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细 胞病变效应。 例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上,出现细胞融合, 产生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、 肾综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到 WI-38或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨 大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使 细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病 毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。
（二）病毒的分离与培养
细胞培养、鸡胚和实验动物可用于病毒的分离与培养, 其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。 用于病毒分离与培养的细胞有原代细胞、二倍体细胞 株和传代细胞系,一般说来,本动物的原代细胞最为敏 感,但不如传代细胞方便易得. 例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原 代或二倍体细胞,但该细胞生长缓慢,通常用PD5(猪甲 状腺细胞系)取代。 培养方法常用的有静置培养和旋转培养,有的病毒如 轮状病毒,初次分离时旋转培养的成功率较静置培养 高。
1、病毒的分离
不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主 要取决于目的病毒的生物学特性。 主要有细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种 法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物 模型的病毒,可采用基因克隆的方法。
（1）动物接种法
是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类 不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜 神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内， 痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。 动物的接种途径要根据病毒种类、实验动物 种类、接种材料等选择合适的接种途径。动 物接种途径的选择正确与否对提高病毒分离 成功率也起到重要作用。
怀疑为口蹄疫的猪或牛,则应采其水疱液及水疱 皮送检。
应注意下列原则：
1.对本身带有杂菌 (如咽喉拭子、粪便) 或易 受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应 使用抗生素。 2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低温 保存并尽快送检。 3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病 后2～3w内各取1份血清，以便对比双份血清 抗体效价的动态变化。
是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培 养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用 的基本方法。
一般选择生长旺盛的敏感细胞用于病毒分离。 少数病毒例外,例如犬、猪等的细小病毒,病毒 的复制有赖于分裂旺盛的细胞,因此需将病毒 接种与细胞培养同步进行。 细胞培养技术在病毒发现、病毒研究、疫苗 研制、抗病毒药物筛选等病毒学发展的历程 中发挥着重要作用。
常见病毒常用实验动物及接种途径
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实验动物采血
在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特 异性抗体。 实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。
致死性采血是指尽量采集动物血,直至动物死亡。
非致死性采血是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。 对采血动物,应在禁食24h后采血。采血应无菌操作。 不同动物采用不同的采血方法。常用的有心脏采血法、 眼眶采血法、颈静脉采血法、颈动脉采血法、耳静脉采 血法等。根据实验动物和实验条件灵活选用。