实验：猪胰蛋白酶的分离纯 化
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恒流泵
③洗涤
0.01 mol/L , pH5.0 柠檬酸钠缓冲液
恒流泵
④洗脱1
0.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸 钠缓冲液
部分收集器
离子交换柱
恒流泵
⑤洗脱2
0.1 mol/L , pH6.0，柠檬 酸钠缓冲液
部分收集器
离子交换柱
恒流泵
实验方法
二、蛋白质含量的测定
方法：紫外吸收法 所测样品：
总蛋白量 （mg）
总酶活 （U）
比活 收率（％） 纯化倍数 （U/mg）
100 80 20
50 48 40
0.5 0.6 2.0
100 96 80
1.0 1.2 4.0
SDS-PAGE电泳结果
思考题
1．提取制备猪胰蛋白酶的过程中，应特别注 意哪些主要环节和影响因素？ 2. 胰蛋白酶活力的测定方法还有哪些？
⑤硫酸铵盐析沉淀（75%饱和度） ——计算硫酸铵用量时需扣除形成硫酸钙的 量。 （于4℃静置过夜） ⑥离心（离心10000 rpm，15 min）——取沉淀（为粗胰蛋白酶 ）
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（2）透析
将粗胰蛋白酶溶于适量预冷的0.001 mol/L HCl溶液中（用2 mol/L HCl调蒸馏水pH至3即可！）。
2 ＃为对照管
①精确加入37℃ 1ml预热的10 mg/mL酪蛋白溶液； ②加入3 mL 8％三氯乙酸 ，迅速摇匀； ③加1 mL稀释酶液（与样品管相同）； ④混匀，立即置于37℃水浴中，准确反应10min； ⑤离心（ 3000 r/min,5min）——取上清 ⑥测A280
胰蛋白酶活力单位数= △A280/t
式中， △A280——样品管A280-对照管A280 t——反应时间（min）
比活力=酶活力单位/毫克蛋白质=△A280/C· t V·
式中， △A280——样品管A280-对照管A280 C——每个样品管中酶液的浓度（mg/mL） V——每个样品管中酶液体积（mL) t——反应时间（min）
3＃为空白管
①分别加入 3 mL 8％三氯乙酸和2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl、pH 8.0 缓冲液， ②离心（ 3000 r/min,5min）——取上清 ③用该样品作为空白，用来测定样品管（1 ＃ ）和对 照管（ 2 ＃ ）的A280。
实验方法
三、酶活力的测定
2. 胰蛋白酶活力的计算
实验结果
1．离子交换层析后收集各管样品的蛋白含量 及活性。 2. 以管数为横坐标、以A280及活性为纵坐标， 制作双坐标图的离子交换层析曲线。 3．测定粗酶液、胰酶激活后样品、离子交换 层析收集管中样品液的体积及酶活力，完成纯 化表格。 4．SDS-PAGE电泳结果
纯化表格
纯化步骤
胰酶激活 后样品 透析后上 柱前样品 离子交换 层析后的 洗脱2
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（3）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶
离子交换柱 恒流泵
部分收集器
离子交换流程简图
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（4）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶
①柱的平衡：用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液平衡 CM-纤维素离子交换柱 ②样品吸附：用恒流泵直接上样于CM-纤维素离子交换柱 ③洗涤：以0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液充分洗净未 吸附蛋白质 ④洗脱1：用0.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸钠缓冲液洗脱，并 分部收集样品，测定每个样品的蛋白含量，做层析曲线， 将出现一个蛋白峰（收集样品为留样4），此峰为猪胰凝乳 蛋白酶。 ⑤洗脱2：待胰凝乳蛋白酶峰过后，改用0.1 mol/L , pH6.0， 柠檬酸钠缓冲液洗脱，并分部收集样品，测定每个样品的 蛋白含量，做层析曲线，将出现一个蛋白峰（收集样品为 留样5），此峰为猪胰蛋白酶。 ⑥柱的再生
实验原理
二、本实验采用的分离纯化方法的原理
3. 离子交换层析法
同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。 蛋白质在其等电点以下（pH<pI），带正电荷，可被阳离子交换树 脂所吸附；而蛋白质在其等电点以上（pH>pI），带负电荷，可被 阴离子交换树脂所吸附。 本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中猪胰 蛋白酶带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用CM-纤 维素离子交换树脂）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正 电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过 增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。 在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的 蛋白最先洗脱，结合力强的蛋白最后洗脱）。
猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品1~样品5，用来 计算比活和纯化倍数；
离子交换层析过程中的分部收集样品，用来作层析 曲线（以样品管号为横坐标，以A280为纵坐标作曲 线）
实验方法
三、酶活力的测定
1. 测定方法
取3支试管按1～3编号： 1＃为样品管、 2 ＃为对 照管、 3＃为空白管 1＃为样品管
在4℃下对0.001 mol/L HCl溶液透析3小时左右（每小时换 液1次 ！）
而后改用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析（至少换 液3次，第一次1小时后换液，第二次是2小时后换液，第 三次是3小时后换液，然后过夜透析 ！）
（记录样品体积，收集约1.5 mL，作为留样3，测蛋白含量，及时 SDS化）
《生化工程》课程实验
猪胰蛋白酶的分离纯化 与检测
主要内容
实验内容 实验目的 实验原理 实验方法 实验结果 实验报告格式
实验内容
一、猪胰蛋白酶的分离纯化 二、蛋白质含量的测定 三、酶活力的测定 四、纯化效果检测 ——SDS-PAGE电泳检测
实验目的
1、掌握盐析沉淀法、透析法及离子交换层析 的原理和操作过程； 2、熟悉胰蛋白酶分离纯化的一般过程； 3、掌握胰蛋白酶活力测定方法及SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳技术。
胰蛋白酶
His 46
S
Ser 18 3
S S
S Active site
Val AspAspAspAspLys
Val Ile GlyHis Ser
S S S
S
The process of trypsinogen activation
胰蛋白酶原激活过程
实验原理
二、本实验采用的分离纯化方法的原理
1. 沉淀法
实验总体安排
第10周：
生物0911（分两组），生物0913（15人左右） 生物0912（分两组），生物0913（15人左右）
第11周：
注：每小组选两个组长，协调同学们分工、合作。 第9周，周五之前将分组同学名单、组长及每个 同学上课情况发到我邮箱： cuihongdu@jmu.edu.cn
①装柱
离子交换树脂
平衡
沿壁倒下
0.01 mol/L , pH5.0
柠檬酸钠缓冲液
3cm
1 ml/min
均匀 无气泡、裂纹
装柱
0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸 钠缓冲液
平衡
②上样
用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲 液透析后的粗酶液
注：需将未吸附 样品（流穿）进 行SDS-PAGE检 测！
（1）粗猪胰蛋白酶的提取 （2）透析 （3）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶 实验具体操作参见《实验指导》
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（1） 粗猪胰蛋白酶的提取
①猪胰脏去脂肪和结缔组织，切碎，称重约50 g →加入5倍体积预冷的pH2.5 乙酸酸化水 ②组织捣碎 ③提取、过滤（四层纱布）、离心（4℃下，10000 rpm，离心15 min ）—— 取上清（记录体积，收集约1.5 mL，作为留样1，测蛋白含量，及时SDS化） ④加入固体无水氯化钙粉末
实验具体安排
星期一
Байду номын сангаас
粗猪胰蛋白酶的提取 硫酸铵沉淀，悬浮液放入4℃冰箱过夜 将硫酸铵沉淀离心后，取沉淀 透析 装柱→平衡 离子交换层析 蛋白含量测定 酶活测定 SDS-PAGE
实验原理
一、胰蛋白酶的基本特性 二、本实验采用的分离纯化方法的原理
1. 沉淀法 2. 透析法 3. 离子交换层析技术
三、胰蛋白酶活性测定原理
实验原理
一、胰蛋白酶的基本特性
胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中， 在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身 激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键 断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转 变为有活性的胰蛋白酶。
活力单位的定义：在一定条件下每分钟酶水解底物酪蛋白形成的溶液 在280nm处吸光度A280增加一个单位的酶量为一个蛋白酶活力单 位（U）。
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化 二、蛋白质含量的测定 三、酶活力的测定 四、纯化效果测定 ——SDS-PAGE电泳检测
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
通过以上离子交换层析法，即可将目的蛋白和杂蛋白分 开，从而得到纯化。
实验原理
三、胰蛋白酶活性测定原理
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如 精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所组成的 肽键具有专一性。特别表现在对碱性氨基酸羧基一侧的 选择性。 本实验以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活力，其 主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。 胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的 小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内酶的水解滤液 在波长280nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成 正比。
猪胰蛋白酶的分子量约为23.4 kDa，其等电点约为 pI=10.8，最适pH7.6～8.0， 胰蛋白酶在pH=3左右较 稳定，Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件 下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。
Trypsin Enteropeptidase
肠激酶
ValAspAspAspAspLys Ile Val Gly
①稀释酶液（根据蛋白含量测定结果，用0.1mol/L TrisHCl、pH 8.0缓冲液稀释至10～80μg/mL ）后，取 1 ml； ②精确加入1mL 37℃ 预热的10 mg/mL酪蛋白溶液； ③混匀，立即置于37℃水浴中，准确反应10min； ④加入3 mL 8％三氯乙酸 ，迅速摇匀，终止反应； ⑤离心（ 3000 r/min,5min）——取上清； ⑥测A280
3．在实验中，可以采取什么方法来提高产率 和比活率？
实验报告格式
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验操作步骤 五、实验结果与讨论 六、附录（实验记录）
其中，前四部分内容为预习报告的内容； 第五部分（实验结果）和第六部分为实验过程中的 内容； 第五部分（实验结果与讨论）整理后与预习报告合 并为实验报告
为猪胰蛋白酶原的激活提供Ca2+（含有0.1 mol/L CaCl2 ）——需计算CaCl2的用量。
⑤加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）
调pH为 8.0 、于25℃下活化4~6小时，（1小时取样一次，并用0.001mol/L HCl稀 释），测定酶活性增加的情况； 比活约3500～4000单位时，活化完成。 用2.5 mol/L H2SO4调pH至2.5～3.0(收集约1.5 mL，作为留样2，测蛋白含量，及 时SDS化 )
盐析沉淀法：用硫酸铵盐析法将目的蛋 白从粗提液中沉淀出来，使其得到浓缩， 并除去部分杂质（核酸、杂蛋白等）。
实验原理
二、本实验采用的分离纯化方法的原理
1. 透析法
由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差 的作用下，高分子溶液（如蛋白溶液） 中的小分子溶质（如无机盐）透向透析 液一侧，同时透析液中的缓冲液渗入蛋 白溶液一侧，经过透析液反复换液后， 即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。
实验方法
三、酶活力的测定
3. 需测样品
猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品1~样品5， 用来计算比活和纯化倍数； 离子交换层析过程中的分部收集样品中，蛋白 峰附近的样品。
实验方法
四、纯化效果检测
用12％ 的SDS—PAGE检测，考马斯亮蓝R-250染 色。 粗酶液留样1， 胰酶激活后样品留样2， 透析后的样品3（上柱前样品） 未吸附样品（流穿） 离子交换层析后洗脱1（留样4 ） 离子交换层析后洗脱2中活力较高样品（留样5）
③洗涤
0.01 mol/L , pH5.0 柠檬酸钠缓冲液
恒流泵
④洗脱1
0.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸 钠缓冲液
部分收集器
离子交换柱
恒流泵
⑤洗脱2
0.1 mol/L , pH6.0，柠檬 酸钠缓冲液
部分收集器
离子交换柱
恒流泵
实验方法
二、蛋白质含量的测定
方法：紫外吸收法 所测样品：
总蛋白量 （mg）
总酶活 （U）
比活 收率（％） 纯化倍数 （U/mg）
100 80 20
50 48 40
0.5 0.6 2.0
100 96 80
1.0 1.2 4.0
SDS-PAGE电泳结果
思考题
1．提取制备猪胰蛋白酶的过程中，应特别注 意哪些主要环节和影响因素？ 2. 胰蛋白酶活力的测定方法还有哪些？
⑤硫酸铵盐析沉淀（75%饱和度） ——计算硫酸铵用量时需扣除形成硫酸钙的 量。 （于4℃静置过夜） ⑥离心（离心10000 rpm，15 min）——取沉淀（为粗胰蛋白酶 ）
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（2）透析
将粗胰蛋白酶溶于适量预冷的0.001 mol/L HCl溶液中（用2 mol/L HCl调蒸馏水pH至3即可！）。
2 ＃为对照管
①精确加入37℃ 1ml预热的10 mg/mL酪蛋白溶液； ②加入3 mL 8％三氯乙酸 ，迅速摇匀； ③加1 mL稀释酶液（与样品管相同）； ④混匀，立即置于37℃水浴中，准确反应10min； ⑤离心（ 3000 r/min,5min）——取上清 ⑥测A280
胰蛋白酶活力单位数= △A280/t
式中， △A280——样品管A280-对照管A280 t——反应时间（min）
比活力=酶活力单位/毫克蛋白质=△A280/C· t V·
式中， △A280——样品管A280-对照管A280 C——每个样品管中酶液的浓度（mg/mL） V——每个样品管中酶液体积（mL) t——反应时间（min）
3＃为空白管
①分别加入 3 mL 8％三氯乙酸和2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl、pH 8.0 缓冲液， ②离心（ 3000 r/min,5min）——取上清 ③用该样品作为空白，用来测定样品管（1 ＃ ）和对 照管（ 2 ＃ ）的A280。
实验方法
三、酶活力的测定
2. 胰蛋白酶活力的计算
实验结果
1．离子交换层析后收集各管样品的蛋白含量 及活性。 2. 以管数为横坐标、以A280及活性为纵坐标， 制作双坐标图的离子交换层析曲线。 3．测定粗酶液、胰酶激活后样品、离子交换 层析收集管中样品液的体积及酶活力，完成纯 化表格。 4．SDS-PAGE电泳结果
纯化表格
纯化步骤
胰酶激活 后样品 透析后上 柱前样品 离子交换 层析后的 洗脱2
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（3）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶
离子交换柱 恒流泵
部分收集器
离子交换流程简图
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（4）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶
①柱的平衡：用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液平衡 CM-纤维素离子交换柱 ②样品吸附：用恒流泵直接上样于CM-纤维素离子交换柱 ③洗涤：以0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液充分洗净未 吸附蛋白质 ④洗脱1：用0.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸钠缓冲液洗脱，并 分部收集样品，测定每个样品的蛋白含量，做层析曲线， 将出现一个蛋白峰（收集样品为留样4），此峰为猪胰凝乳 蛋白酶。 ⑤洗脱2：待胰凝乳蛋白酶峰过后，改用0.1 mol/L , pH6.0， 柠檬酸钠缓冲液洗脱，并分部收集样品，测定每个样品的 蛋白含量，做层析曲线，将出现一个蛋白峰（收集样品为 留样5），此峰为猪胰蛋白酶。 ⑥柱的再生
实验原理
二、本实验采用的分离纯化方法的原理
3. 离子交换层析法
同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。 蛋白质在其等电点以下（pH<pI），带正电荷，可被阳离子交换树 脂所吸附；而蛋白质在其等电点以上（pH>pI），带负电荷，可被 阴离子交换树脂所吸附。 本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中猪胰 蛋白酶带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用CM-纤 维素离子交换树脂）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正 电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过 增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。 在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的 蛋白最先洗脱，结合力强的蛋白最后洗脱）。
猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品1~样品5，用来 计算比活和纯化倍数；
离子交换层析过程中的分部收集样品，用来作层析 曲线（以样品管号为横坐标，以A280为纵坐标作曲 线）
实验方法
三、酶活力的测定
1. 测定方法
取3支试管按1～3编号： 1＃为样品管、 2 ＃为对 照管、 3＃为空白管 1＃为样品管
在4℃下对0.001 mol/L HCl溶液透析3小时左右（每小时换 液1次 ！）
而后改用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析（至少换 液3次，第一次1小时后换液，第二次是2小时后换液，第 三次是3小时后换液，然后过夜透析 ！）
（记录样品体积，收集约1.5 mL，作为留样3，测蛋白含量，及时 SDS化）
《生化工程》课程实验
猪胰蛋白酶的分离纯化 与检测
主要内容
实验内容 实验目的 实验原理 实验方法 实验结果 实验报告格式
实验内容
一、猪胰蛋白酶的分离纯化 二、蛋白质含量的测定 三、酶活力的测定 四、纯化效果检测 ——SDS-PAGE电泳检测
实验目的
1、掌握盐析沉淀法、透析法及离子交换层析 的原理和操作过程； 2、熟悉胰蛋白酶分离纯化的一般过程； 3、掌握胰蛋白酶活力测定方法及SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳技术。
胰蛋白酶
His 46
S
Ser 18 3
S S
S Active site
Val AspAspAspAspLys
Val Ile GlyHis Ser
S S S
S
The process of trypsinogen activation
胰蛋白酶原激活过程
实验原理
二、本实验采用的分离纯化方法的原理
1. 沉淀法
实验总体安排
第10周：
生物0911（分两组），生物0913（15人左右） 生物0912（分两组），生物0913（15人左右）
第11周：
注：每小组选两个组长，协调同学们分工、合作。 第9周，周五之前将分组同学名单、组长及每个 同学上课情况发到我邮箱： cuihongdu@jmu.edu.cn
①装柱
离子交换树脂
平衡
沿壁倒下
0.01 mol/L , pH5.0
柠檬酸钠缓冲液
3cm
1 ml/min
均匀 无气泡、裂纹
装柱
0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸 钠缓冲液
平衡
②上样
用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲 液透析后的粗酶液
注：需将未吸附 样品（流穿）进 行SDS-PAGE检 测！
（1）粗猪胰蛋白酶的提取 （2）透析 （3）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶 实验具体操作参见《实验指导》
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（1） 粗猪胰蛋白酶的提取
①猪胰脏去脂肪和结缔组织，切碎，称重约50 g →加入5倍体积预冷的pH2.5 乙酸酸化水 ②组织捣碎 ③提取、过滤（四层纱布）、离心（4℃下，10000 rpm，离心15 min ）—— 取上清（记录体积，收集约1.5 mL，作为留样1，测蛋白含量，及时SDS化） ④加入固体无水氯化钙粉末
实验具体安排
星期一
Байду номын сангаас
粗猪胰蛋白酶的提取 硫酸铵沉淀，悬浮液放入4℃冰箱过夜 将硫酸铵沉淀离心后，取沉淀 透析 装柱→平衡 离子交换层析 蛋白含量测定 酶活测定 SDS-PAGE
实验原理
一、胰蛋白酶的基本特性 二、本实验采用的分离纯化方法的原理
1. 沉淀法 2. 透析法 3. 离子交换层析技术
三、胰蛋白酶活性测定原理
实验原理
一、胰蛋白酶的基本特性
胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中， 在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身 激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键 断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转 变为有活性的胰蛋白酶。
活力单位的定义：在一定条件下每分钟酶水解底物酪蛋白形成的溶液 在280nm处吸光度A280增加一个单位的酶量为一个蛋白酶活力单 位（U）。
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化 二、蛋白质含量的测定 三、酶活力的测定 四、纯化效果测定 ——SDS-PAGE电泳检测
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
通过以上离子交换层析法，即可将目的蛋白和杂蛋白分 开，从而得到纯化。
实验原理
三、胰蛋白酶活性测定原理
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如 精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所组成的 肽键具有专一性。特别表现在对碱性氨基酸羧基一侧的 选择性。 本实验以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活力，其 主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。 胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的 小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内酶的水解滤液 在波长280nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成 正比。
猪胰蛋白酶的分子量约为23.4 kDa，其等电点约为 pI=10.8，最适pH7.6～8.0， 胰蛋白酶在pH=3左右较 稳定，Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件 下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。
Trypsin Enteropeptidase
肠激酶
ValAspAspAspAspLys Ile Val Gly
①稀释酶液（根据蛋白含量测定结果，用0.1mol/L TrisHCl、pH 8.0缓冲液稀释至10～80μg/mL ）后，取 1 ml； ②精确加入1mL 37℃ 预热的10 mg/mL酪蛋白溶液； ③混匀，立即置于37℃水浴中，准确反应10min； ④加入3 mL 8％三氯乙酸 ，迅速摇匀，终止反应； ⑤离心（ 3000 r/min,5min）——取上清； ⑥测A280
3．在实验中，可以采取什么方法来提高产率 和比活率？
实验报告格式
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验操作步骤 五、实验结果与讨论 六、附录（实验记录）
其中，前四部分内容为预习报告的内容； 第五部分（实验结果）和第六部分为实验过程中的 内容； 第五部分（实验结果与讨论）整理后与预习报告合 并为实验报告
为猪胰蛋白酶原的激活提供Ca2+（含有0.1 mol/L CaCl2 ）——需计算CaCl2的用量。
⑤加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）
调pH为 8.0 、于25℃下活化4~6小时，（1小时取样一次，并用0.001mol/L HCl稀 释），测定酶活性增加的情况； 比活约3500～4000单位时，活化完成。 用2.5 mol/L H2SO4调pH至2.5～3.0(收集约1.5 mL，作为留样2，测蛋白含量，及 时SDS化 )
盐析沉淀法：用硫酸铵盐析法将目的蛋 白从粗提液中沉淀出来，使其得到浓缩， 并除去部分杂质（核酸、杂蛋白等）。
实验原理
二、本实验采用的分离纯化方法的原理
1. 透析法
由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差 的作用下，高分子溶液（如蛋白溶液） 中的小分子溶质（如无机盐）透向透析 液一侧，同时透析液中的缓冲液渗入蛋 白溶液一侧，经过透析液反复换液后， 即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。
实验方法
三、酶活力的测定
3. 需测样品
猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品1~样品5， 用来计算比活和纯化倍数； 离子交换层析过程中的分部收集样品中，蛋白 峰附近的样品。
实验方法
四、纯化效果检测
用12％ 的SDS—PAGE检测，考马斯亮蓝R-250染 色。 粗酶液留样1， 胰酶激活后样品留样2， 透析后的样品3（上柱前样品） 未吸附样品（流穿） 离子交换层析后洗脱1（留样4 ） 离子交换层析后洗脱2中活力较高样品（留样5）