实验：猪胰蛋白酶的分离纯 化
胰蛋白酶的制备
一、猪胰蛋白酶制备（一）猪胰蛋白酶原的提取∙猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。
∙加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升）。
∙加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品。
（二）胰蛋白酶原激活∙向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液。
将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计），使Ca2+与SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶液中最终仍含有0.1M CaCl2。
2．用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）轻轻搅拌，于室温下活化8～10小时，（2～3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释），测定酶活性增加的情况。
3．活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。
（三）胰蛋白酶的分离1．将已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼。
2．滤液按250克/升加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，放置数小时，抽滤，弃去滤液。
（四）胰蛋白酶的结晶1．将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解。
2．用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。
3．放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1 /5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。
胃蛋白酶
计、凝
胶成像仪、核酸蛋白质分析仪。
四、实验方法
1
．猪胰蛋白酶的分离纯化
（
1
）粗猪胰蛋白酶的提取
取猪胰脏，除去脂肪和结缔组织，切碎，称重约
50g
加入
5
倍体积预冷的
pH2.5
乙酸酸化水
用组织捣碎机捣碎
离心
10000 rpm
，
15 min
用
4
层纱布过滤得上清液（
收集约
1.5 mL
，作为留样
1
，测蛋白含量，及时
SDS
化）
将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中，
边加边搅拌均匀，
使溶液中最终
含有
0.1 mol/L CaCl
2
加入极少量猪胰蛋白酶（约
2-5mg
），轻轻搅拌均匀
用
5 mol/L NaOH
调
pH
为
8.0
于
25
℃下活化
4~6
小时（
2
小时取样一次），测定酶活性增加的情况
4
活化完成后，用
2.5 mol/L H
3
C
6
H
5
O
7
·
2
H
2
O/L
）混匀，
用酸度计检查
pH
值是否为
6.0
。
（
10
）
8
％三氯乙酸
（
11
）
10 mg/mL
酪蛋白溶液：
取酪蛋白
1g
，
加
11
M
Tris
－
HCl
缓冲液，
pH8.0
40
mL
亲和层析法纯化胰蛋白酶
3鸡卵粘蛋白的分离纯化 鸡卵粘蛋白的分离纯化 3.1 Sephadex G-25 柱脱盐 (1)溶胀 溶胀： 溶胀 称取15g Sephadex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml 蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。 (2)装柱 装柱： 装柱 取一支30×3cm 的层析柱，将溶胀好的Sephadex G-25 装柱，自然沉降。 (3) 处理 处理： 用2倍柱床体积的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍体积的 蒸馏水洗去残留的NaCl。
1.1环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联
↓活化
↓偶联
↓亲和结合
↓洗脱
1.2溴化氰活化载体 与蛋白质配基的偶联
2亲和介质合成 亲和介质合成 2.1琼脂糖凝胶层析介质(Sepharose 4B)的活化 2.1.1 琼脂糖凝胶层析介质的处理 称取10克琼脂糖凝胶层析介质，置于G-3玻璃烧结漏斗内， 用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗（少量多次），100ml 蒸 馏水抽洗，抽干后转移到100ml三角瓶中备用。
图2，鸡卵粘蛋白在 ，鸡卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱的分离 柱的分离
3.3透析及丙酮沉淀 透析及丙酮沉淀 (1) 透析： 透析： 将经DEAE-Cellulose柱分离的鸡卵粘蛋白转入透析袋内， 对蒸馏水透析，隔一段时间换一次水，直到渗出液经 BaCl2溶液检查无氯离子存在，即可。 (2) 调pH值： 值 将透析好的鸡卵粘蛋白溶液，用0.1mol/L HCl 精确调 至pH4.0（最好一次调成功），量体积。 (3)丙酮沉淀： 丙酮沉淀： 丙酮沉淀 加入3倍体积的预冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，在 冰箱内静止4小时以上或过夜。
本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的， 从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高 的胰蛋白酶。围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本 性质及相关技术进行综合训练。其中主要包括亲和层析介 质配基的制备，亲和介质的合成，蛋白质和酶的分离纯化， 酶活性的测定等内容。 通过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备的基本原理 和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键 环节，对实验中出现的问题进行科学的分析。使学生在学 习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第1页
1 内容摘要 亲和层析包含了一整套复杂底物及其配体与生物大分
子之间相互作用时所形成独特生物学特征。在亲和结合过 程中包括到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等原因 影响。
亲和层析概念能够了解为配基以共价键形式与水不溶 性固体载体共价结合， 形成含有高度专一性亲和吸附剂。 以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂混合物中有针对 性分离某一个成份。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第4页
1. 3试验流程
鸡蛋清
Spharose 4B
猪胰脏
↓
↓
↓
提取
↓ 分离纯化
活化 ↓
提取 ↓
↓ 纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液
↓ 偶联
↓ 激活
↓
↓
CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液
↓ 亲和层析
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
第2页
本试验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目标，
从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高
胰蛋白酶。围绕亲和层析试验所包括蛋白质和酶基础性质
及相关技术进行综合训练。其中主要包含亲和层析介质配
基制备，亲和介质合成，蛋白质和酶分离纯化，酶活性测
定等内容。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
经过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备基础原理和
操作，学习怎样进行试验设计，掌握试验过程中关键步骤，
对试验中出现问题进行科学分析。使学生在学习试验技术
同时，自觉培养分析问题和处理问题能力。
亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介
鸡卵粘蛋白的提取及猪胰蛋白酶的分离纯化
鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化摘要：鸡卵类粘蛋⽩是由鸡卵清中制得的⼀种糖蛋⽩，具有强烈的抑制胰蛋⽩酶的作⽤，常⽤于胰蛋⽩酶的酶学性质的研究和胰蛋⽩酶的亲和层析纯化制备。
胰蛋⽩酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋⽩酶的⼀种，EC3.4.21.4。
在脊椎动物中，作为消化酶⽽起作⽤，⽽且还能限制分解糜蛋⽩酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作⽤。
本实验以鸡蛋清为原料，提取猪胰蛋⽩酶的天然抑制剂鸡卵粘蛋⽩，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶上，制成鸡卵粘蛋⽩的亲和吸附剂，然后通过亲和层析直接从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋⽩酶。
并设计了酶活性测定以对纯化过程进⾏监测和对纯化效果进⾏评价；设计了电泳实验对制备的猪胰蛋⽩酶进⾏纯度和分⼦量的测定。
关键词：鸡卵粘蛋⽩；胰蛋⽩酶；亲和层析；分离纯化；酶活性。
鸡卵粘蛋⽩（chicken ovomucoid简称CHOM）是鸡蛋清中的⼀种糖蛋⽩，⾄今还未能获得单⼀组分，在电泳⾏为上常呈现不均⼀性。
不同来源的卵类蛋⽩末端基有很⼤差别，鸡卵类蛋⽩N-末端基为丙氨酸。
卵类粘蛋⽩在中性活酸性溶液中对热和⾼浓度的脲是相当稳定的，⽽在碱性溶液中⽐较不稳定，尤其温度较⾼是易迅速失活，在50%丙酮或10%三氯⼄酸溶液中仍有较好的溶解度。
它们的等电点有⼀定的范围，⼤致在3.9—4.5之间。
鸡卵粘蛋⽩除对⽜和猪的胰蛋⽩酶有强烈的抑制作⽤外，对枯草杆菌蛋⽩酶也有⼀定的抑制作⽤，但对胰凝乳蛋⽩酶⽆抑制作⽤，对⼈的胰蛋⽩酶也⽆明显抑制作⽤，因此常⽤于胰蛋⽩酶酶学性质的研究。
在pH7.8～8.0碱性条件下，CHOM可可逆性的结合胰蛋⽩酶，以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术对胰蛋⽩酶进⾏分离纯化。
1材料与⽅法1.1材料与试剂市售鲜鸡蛋，10%TCA，1mol/L NaOH ，5mol/L NaOH ，1mol/L HCl，5mol/L HCl，丙酮（A.R），葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25)，0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液，DEAE-52离⼦交换纤维素，离⼦交换剂（0.5mol/L HCl ，0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl ），洗脱液（0.3mol/L NaCl—0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液）,透析袋（φ2.7cm）,标准胰蛋⽩酶溶液（1mg/ml），0.05mol/L PH7. 8 Tris- HCl缓冲液，BAEE底物缓冲溶液（0.05mol/L CaCl2- 0.05mol/L PH8.0 Tris- HCl缓冲液），1mmol/L BAEE底物溶液，Sepharose 4B，0.5mol/L NaCl，2mol/L NaOH，0.2mol/L PH9.5碳酸钠缓冲液，56%1，4-⼆氧六环（V/V），环氧氯丙烷（A.R），亲和柱平衡液（0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液（0.5mol/L KCl—0.1mol/L PH2.5甲酸溶液），，⽆⽔氯化钙，亲和柱平衡液新鲜猪胰脏，PH2.5-3.0⼄酸酸化⽔，2.5mol/L H2S04（ 0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液：（0.5mol/L KCl— 0.1mol/LPH2.5甲酸溶液）等。
猪胰脏中胰酶的提取及激肽释放酶的分离纯化
９ ％乙醇直到沉淀液中的乙醇浓度为 ７ ％ （ ５ ０ 可依 据 提取液 的取 用量 ，通过 稀 释 公式 计算 应 加 ９ ％ ５ 的乙醇量） ，置冰箱 （ －５ ０ ℃）中沉淀 ２ｈ ．沉淀 后，虹吸去上清液，用布袋 吊滤 ２ ，可在常温 ０ ｈ 下进行．吊滤完后 的沉淀物在压滤机上压滤，尽 量压干乙醇，压滤时问约为 ３ ，即得粗胰酶 ． ｈ １３ 胰酶原粉的制备 ． 将粗 胰 酶 用 手 工 制 成 ５ｍ． 以 下 的小 颗 粒 。 １ Ｔ ｌ 然后将小颗粒状的粗胰酶装人纱布袋 中放人脱脂 器 中用工业乙醚脱脂 １ ．把脱脂后胰酶放人 热 ２ｈ
的双蒸水 及用 ｐ Ｈ＝７０的 Ｏ０ ｏ Ｌ磷 酸盐 缓 冲 ． ．５ａ！ ｒ ／ 液平衡处理好 的 Ｄ Ａ Ｅ Ｅ纤维素树脂 。置玻 璃容器 中 搅拌 吸附 ３ｈ ．静 置，倾 去 上清 液 ．收集 Ｅ Ｅ纤 Ａ
粗渣，后用双层纱布过滤，所有滤渣再用少量 的
２ ％酸化 乙醇 溶 液搅 拌 ，再 过 滤 １次 ．合 并 所 得 ５ 滤液 ． 静置激 活 ：将 所得 滤 液在 冰 箱 （ ０～５ ） 中 ℃ 静置激 活 １ ． ６ｈ
维素树脂．装入层析柱中，用 ０６ ｒ ／ ． ｔ Ｌ的 Ｎ ｄ ａ 溶液过柱洗脱．洗脱液容量约 １ ０ Ⅱ 收集洗脱 ０ ０ 液并将其冷却至 ０ ℃，加人 一１℃丙酮．边加边搅 ０
１２ 租胰酶的制备 ．
作 者简 介 ：汪 晓英 （９ １ ） １５ － ，女，昆明人 ，实验师， ，主要从事生物化学 实验 教学厦有关研究工作
维普资讯
１８ ０
昆 明 医 学 院 学 报
第２ ３卷
拌，直加至丙酮量达 ７ ％ （ ０ ：０７ ） ． ．然后将其 ０ 放置 冰箱 内 过夜 ，次 日进行 过滤 ，收 集 过滤 沉 淀
胰蛋白酶的纯化实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握胰蛋白酶的纯化方法。
2. 了解胰蛋白酶的理化性质和生物学功能。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于胰腺中的丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白质的能力。
本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，该方法具有操作简便、成本低廉、纯度较高等优点。
三、实验材料1. 胰蛋白酶粗品：由动物胰腺提取。
2. 硫酸铵：分析纯。
3. 氯化钠：分析纯。
4. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）：0.1 mol/L。
5. 其他试剂：三氯乙酸、硫酸、氢氧化钠等。
四、实验方法1. 胰蛋白酶粗品预处理：将胰蛋白酶粗品溶解于磷酸盐缓冲液（pH 7.0），搅拌使其充分溶解。
2. 盐析：向胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵，使其饱和，充分搅拌，室温静置过夜。
3. 沉淀收集：用布氏漏斗抽滤，收集沉淀，并用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤沉淀。
4. 脱盐：将沉淀溶于适量的水，加入适量的三氯乙酸，使蛋白质变性，去除杂质。
5. 纯化：将变性后的蛋白质溶液透析，去除三氯乙酸和硫酸铵。
6. 蛋白质复性：将透析后的蛋白质溶液加入适量的磷酸盐缓冲液（pH7.0），使蛋白质复性。
7. 检测：采用SDS-PAGE方法检测纯化后的胰蛋白酶。
五、实验结果与分析1. 盐析：在胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵后，溶液出现白色沉淀，说明胰蛋白酶已经盐析。
2. 沉淀收集：通过抽滤，收集到白色沉淀，表明胰蛋白酶已经沉淀。
3. 脱盐：加入三氯乙酸后，沉淀溶解，表明蛋白质已经变性。
4. 纯化：透析后的蛋白质溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，只有一个明显的条带，说明胰蛋白酶已经纯化。
5. 蛋白质复性：复性后的胰蛋白酶溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，蛋白条带清晰，说明蛋白质已经复性。
六、实验结论本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，成功地将胰蛋白酶从粗品中分离出来，并通过SDS-PAGE电泳检测，证明纯化后的胰蛋白酶具有较高的纯度。
胰蛋白酶的制备实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握胰蛋白酶的提取、纯化方法。
2. 了解胰蛋白酶的活性测定方法。
3. 掌握实验室操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于哺乳动物胰脏中的蛋白水解酶，具有高效、专一的特点。
本实验通过从胰脏中提取胰蛋白酶，利用其活性对蛋白质进行水解，从而实现对胰蛋白酶的制备。
三、实验材料与仪器1. 材料：新鲜猪胰脏、生理盐水、盐酸、氢氧化钠、硫酸铵、硫酸铜、Folin试剂、酪蛋白、三氯醋酸等。
2. 仪器：研钵、天平、烧杯、试管、移液管、滴定管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
四、实验步骤1. 胰蛋白酶提取（1）将新鲜猪胰脏去脂肪、去筋膜，剪成小块，用生理盐水清洗，去除杂质。
（2）将胰脏放入研钵中，加入适量的生理盐水，研磨成浆状。
（3）将研磨好的胰浆用纱布过滤，收集滤液。
2. 胰蛋白酶纯化（1）将滤液加入适量的盐酸，调节pH值为4.5，静置过夜。
（2）次日，将沉淀物用蒸馏水洗涤，去除杂质。
（3）将洗涤后的沉淀物加入适量的硫酸铵溶液，调节硫酸铵浓度为40%，搅拌，静置2小时。
（4）取沉淀物，用蒸馏水洗涤，去除杂质。
（5）将洗涤后的沉淀物用硫酸铜溶液处理，去除杂质。
3. 胰蛋白酶活性测定（1）取一定量的酶液，加入酪蛋白溶液，在40℃、pH值为7.5的条件下反应30分钟。
（2）加入三氯醋酸终止反应，离心分离。
（3）取上清液，用Folin试剂测定吸光度，计算酶活性。
五、实验结果与分析1. 胰蛋白酶提取通过研磨和过滤，从新鲜猪胰脏中成功提取出胰蛋白酶。
2. 胰蛋白酶纯化通过盐析、洗涤、硫酸铵沉淀和硫酸铜处理，成功纯化出胰蛋白酶。
3. 胰蛋白酶活性测定在最佳条件下，胰蛋白酶对酪蛋白的水解活性较高，说明成功制备出具有活性的胰蛋白酶。
六、实验结论本实验成功从猪胰脏中提取、纯化出具有活性的胰蛋白酶，为后续的实验研究提供了条件。
七、实验注意事项1. 提取过程中，需保持操作环境清洁，避免污染。
实验：猪胰蛋白酶的分离纯 化
⑤硫酸铵盐析沉淀（75%饱和度） ——计算硫酸铵用量时需扣除形成硫酸钙的 量。 （于4℃静置过夜） ⑥离心（离心10000 rpm，15 min）——取沉淀（为粗胰蛋白酶 ）
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（2）透析
将粗胰蛋白酶溶于适量预冷的0.001 mol/L HCl溶液中（用2 mol/L HCl调蒸馏水pH至3即可！）。
猪胰蛋白酶的分子量约为23.4 kDa，其等电点约为 pI=10.8，最适pH7.6～8.0， 胰蛋白酶在pH=3左右较 稳定，Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件 下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。
Trypsin Enteropeptidase
肠激酶
ValAspAspAspAspLys Ile Val Gly
在4℃下对0.001 mol/L HCl溶液透析3小时左右（每小时换 液1次 ！）
而后改用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析（至少换 液3次，第一次1小时后换液，第二次是2小时后换液，第 三次是3小时后换液，然后过夜透析 ！）
（记录样品体积，收集约1.5 mL，作为留样3，测蛋白含量，及时 SDS化）
实验方法
三、酶活力的测定
3. 需测样品
猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品1~样品5， 用来计算比活和纯化倍数； 离子交换层析过程中的分部收集样品中，蛋白 峰附近的样品。
实验方法
四、纯化效果检测
用12％ 的SDS—PAGE检测，考马斯亮蓝R-250染 色。 粗酶液留样1， 胰酶激活后样品留样2， 透析后的样品3（上柱前样品） 未吸附样品（流穿） 离子交换层析后洗脱1（留样4 ） 离子交换层析后洗脱2中活力较高样品（留样5）
半自动纯化法分离纯化成年猪胰岛细胞的实验研究
ｔ ｏ ｓｒｅ ｈ ｏｐ ｏ ｇ ｆｓ ｔ ｅｌｃｕｔ ｓ （ Ｃ ） ｏｃｕ ｔｓ ｔ ｑ ｉ ｅｔ Ｅ ｏ ｂｅｖ ｅｍ ｒｈｌ ｙｏ ｌ ｌ ｌｓ ｒ Ｉ Ｓ ，ｔ ｏ ｎ ｌ ｕｖ ｎ Ｑ，ａ ｄ ｏｄ ｔ ｔｈ ｕ ｔ ｏ ｔ ｏ ｉｅ ｃ ｓ ｅ Ｃ ｉｅｅ ａ Ｉ ｌ ｎ ｅｅ ｅｐ ｒｙ ｆ ｔ ｃｔ ｉ
Ｓｅ ｉ－ ｕｔ ｍ ａ ｉ ｓ ｌ ｔ ｏ ｎ ｍ － － ａ ｏ ｔ ｃ Ｉ ｏ ａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｐｕｒ ｆ ｃ ｔ ｏ ｏ ｕｌ ｇ Ｉ ｌ ｔ ｉ ａ ｉ ｎ ｆＡｄ ｔＰｉ ｓ ｅ ｉ
Ｃｅ ｌ ｌｓ
Ｗ ＡＮＧ ｕ ”， ＨＯＵ Ｚ ｎ Ｊｅ ｏ ｇ—ｌ ， Ｌ ｉ ｕ ｂ ｒ ｆ ｈ ｌ ｓ ｏ ｅｔ ａ （ ８ ｈ ｕ ｅ ｅｉｅ ｌ ｃｅ ｗ ｓ ４３ ７±６ ７ Ｉ Ｑ ｇｉ ｖｒｇ ｏ ａ ｃｅｓｂ ｆ ｅ ｏｔ ｓｔｃ ｌ ｄ １ ） Ｅ ／ ｎａｅａ ｅｆ ｍ ｐ ｎ ｒａ ｅｏ ｒ ｒ
ｐ ｒ ｃｔ ｎ ａ ｄ （ １２ ±７ ６ Ｉ Ｑｇ ｐ ｎ ｒａ ｆ ｒｐ ｒ ｃｔ ｎ ｈ ｖｒｇ ｕｉ ｆｉ ｅ ｅ ｓｗ ｓ ｕ ｆ ａｏ ． ｎ ｉ ｉ ｉ ３ ９ ５ ） Ｅ ／ ａｃｅｓａ ｅ ｕ ｆ ａ ｏ ．Ｔ ｅ ａｅａｅ ｐ ｒｙ ｏ ｓ ｔ ｃ ｌ ａ ｔ ｉ ｉ ｉ ｔ ｌｓ ｌ
梯度 离心进行 分离 纯化 ；采用双硫腙染色 、Ａ — Ｉ Ｏ Ｐ 染色 、胰 岛素 释放试验检测胰岛的纯度和活性 ．结果 后平均获取 的胰 岛细胞团数 量为 （ ８ ４３ ７±６ ７ ＩＱ／ 胰腺 组织 ；纯化后平 均为 １） Ｅ ｇ
猪胰脏中胰酶的提取工艺优化研究
水平
1 2 3
A 异丙醇浓度(%) 5 7.5 10
因素 B 提取时间(h)
2 4 6
C pH 2 3 4
D 壳聚糖用量(%) 0.1 0.2 0.3
处理号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
表 ２ 正交试验结果 Table 2 Results of orthogonal test
收率(%) 11.50 11.66 11.60 14.28 12.47 10.87 13.5 12.86 10.67
2. Department of Agronomy, Hexi University, Zhangye 734000, China)
Abstract：Pancreatin was extracted from pig pancreas using isopropyl alcohol as solvent and chitosan as precipitant. The effect
收稿日期：2008-12-17 基金项目：甘肃省农业生物技术研究开发项目(GNSW-2007-06) 作者简介：郭兆斌(1984 －)，男，硕士研究生，研究方向为营养与食品卫生。E-mail：guozhb007@ * 通讯作者：韩玲(19 63 －)，女，教授，博士，研究方向为食品科学与工程。E-mai l：han l@ .cn
水平最优组合 A2 B3 C3 D1 A1 B3 C1 D1 A3 B3 C2 D1 A2 B1 C3 D3
由表 3 中 3 种酶活力可知，因素 B 和 D 对前 3 个指 标的影响是一致的，以 B3D1 为最优水平，而因素 A 和 C 对这 3 个指标的影响是不一致的，都不相同，然后按 照因素 A 和因素 C 对胰蛋白酶活力和胰酶得率的影响 看，选择 A 2C 3 为最佳水平。根据上面的分析，确定 各个因素的最佳水平组合为 A2B3C3D1，即异丙醇浓度 7.5%、提取时间 6h、pH 4、壳聚糖用量 0.1%。
一种简单快速分离纯化小型猪胰岛的方法
１５ 胰 岛形 态、 量 、 ． 数 纯度 的观察
双硫腙 （ Ｔ ） Ｄ Ｚ 染
色镜下观察 细胞 的形 态并 计数 Ｄ Ｚ染 色 阳性 的胰 岛 Ｔ
细胞 团 ， 以胰 岛细胞 当量 （Ｅ ） 计算其数量 （ ＩＱ 来 每一个
Ａ器官保存液 （ 海长 征医 院） 胰腺半 自动 消化分 上 ，
１ ０ ｍ ｎ离心洗 涤 ２次 ， 将 沉 淀 与 Ｒ Ｍ 一１４ ０ｒ ｉ ５ ／ 再 Ｐ Ｉ ６０
培 养液混 匀 ， 取样镜检 。
离装置 （ 自制 ） 推 进 式 离 心 管 （ ， 自制 ） 电 子 密度 计 ，
１２ 主要 试剂和器材 ． Ｒ Ｍ 一１４ Ｐ Ｉ ６０培养基 （ ｉｃ 公 Ｇｂｏ
司 ） 胶原酶 Ｖ（ ｉ ａ 司 ） 小 牛血 清 （ ｉｃ 公 司） ， Ｓｇ 公 ｍ ， Ｇｂｏ ，
双硫腙 （ ｉ ａ 司 ）胰 岛素检测试剂 盒 （ Ｓｍ 公 ｇ ， 北京 原子高 科技应用股份有 限公司 ） Ｆｃｌ４ ０ Ｓｇ ａ 司 ） ＨＣ ，ｉ ｌ ０ （ ｉ 公 ｏ ｍ ，
南方 医科大学珠江 医院内分 泌科 （ 广州 ５ ０ ８ ） １２ ２
【 摘要 】 目的 探 索一种 简单快速分 离纯化 小型猪胰 岛的方 法。方 法
摘取 小型猪 胰腺 ， 经胰 管插 管后 注
入胶 原 酶 ｖ， 自制 的 半 自动 消化 分 离装 置 消化 ， 腺 消 化 物 经 自制 的 推 进 式 离心 管及 单 一 密度 （ ． ９ ／ Ｌ 的 用 胰 １０ ６ｇ ｍ ）
・
５ ０・ ２
广东医学
２０ ０９年 ４月 第 ３ Ｏ卷第 ４期
Ｇｕ ｎ ｄ ｎ ａ ｇ ｏ ｇＭｅｉａ ｏ ｒ ａ Ａ ｒ ０ ９， ｏ．３ ，Ｎ ．４ ｄｃ ｌ ｕｎ ｌ ｐ．２０ Ｖ １ ０ ｏ Ｊ
生物化学综合性实验的设计与实现——以亲和层析法纯化猪胰蛋白酶为例
生物化学综合性实验的设计与实现——以亲和层析法纯化猪胰蛋白酶为例黄体冉;刘悦萍;张国庆;王文平;张静【期刊名称】《实验室研究与探索》【年(卷),期】2017(036)004【摘要】生物化学实验是生命科学领域一门重要专业基础课,其所包含的实验技术在训练学生基本技能、培养实践能力和创新能力上起着至关重要的作用.围绕生物化学中蛋白质化学、酶学性质的有关内容,将鸡卵粘蛋白的制备、猪胰蛋白酶的制备、猪胰蛋白酶的纯化以及纯胰蛋白酶活性和鸡卵粘蛋白抑制活性的测定重新整合,设计了一个包括蛋白质分离纯化、蛋白质含量测定以及酶活性测定3个单元的综合性实验,并将光谱和色谱技术融入其中.最后对实验内容的综合性设计部分进行了探索性研究,以期为生物化学综合性、设计性实验开发和研究提供参考.【总页数】5页(P179-183)【作者】黄体冉;刘悦萍;张国庆;王文平;张静【作者单位】北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;农业部都市农业(北方)重点实验室,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206;北京农学院生物科学与工程学院,北京102206【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.亲和层析法纯化小鼠腹水来源的单克隆抗体的实验研究 [J], 徐颖;蒋玉平;马泓冰;胡玉敏;孙中文;张学光2.开设综合性、设计性生物化学实验的探索与实践--以河北北方学院医学检验学院生物化学实验教学改革为例 [J], 张效云;董明纲;宋桂芹;徐志伟;郝敏;辇晓峰;王文栋3.生物化学实验多媒体课件制作初探——亲和层析纯化胰蛋白酶示教片的制作 [J], 赵立青;李小菊4.亲和层析纯化猪胰蛋白酶的研究 [J], 孟国良5.亲和层析法纯化尿胰蛋白酶抑制剂及部分性质研究 [J], 胡加亮;王旻;李谦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪胰抑肽酶的分离和鉴定
猪胰抑肽酶的分离和鉴定
方林求
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】1992(000)003
【摘要】猪胰脏除分泌多种用以消化食物蛋白质的蛋白水解酶外,还分泌与蛋白酶共存的酶抑制剂,它们相互制约处于动态平衡,发挥重要的生物调节作用。
近年来报道,一些外源性蛋白酶抑制剂能抑制癌细胞蛋白酶的分泌,遏阻恶性肿瘤的生长,还可用于外科手术,减少手术的输血量等。
本文介绍采用纤维素离子交换层析从猪胰脏分离出胰蛋白酶抑制剂(商品名为抑肽酶)的方法。
一、材料与方法1.材料:新鲜猪胰脏购于市场。
CM-纤维素和DEAE-纤维素为上海试剂四厂产品。
胰蛋白酶,Difco 进口分装。
N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)
【总页数】3页(P31-33)
【作者】方林求
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】TQ464.8
【相关文献】
1.鸡胰多肽、猪胰多肽的提取、纯化和鉴定研究 [J], 赵成萍;张映
2.动物微生态制剂菌种的分离与鉴定--猪肠源乳杆菌的分离与鉴定 [J], 孟军;黄丽红;刘淑英;刘莉
3.猪胰抑肽酶的部分性质研究 [J], 方林求
4.猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定 [J], 郭茂霞
5.部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定 [J], 李海燕;于康震;辛晓光;李雁冰;蔡雪辉;杨焕良;毕英佐;王自振
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2 ＃为对照管
①精确加入37℃ 1ml预热的10 mg/mL酪蛋白溶液； ②加入3 mL 8％三氯乙酸 ，迅速摇匀； ③加1 mL稀释酶液（与样品管相同）； ④混匀，立即置于37℃水浴中，准确反应10min； ⑤离心（ 3000 r/min,5min）——取上清 ⑥测A280
实验方法
三、酶活力的测定
3. 需测样品
猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品1~样品5， 用来计算比活和纯化倍数； 离子交换层析过程中的分部收集样品中，蛋白 峰附近的样品。
实验方法
四、纯化效果检测
用12％ 的SDS—PAGE检测，考马斯亮蓝R-250染 色。 粗酶液留样1， 胰酶激活后样品留样2， 透析后的样品3（上柱前样品） 未吸附样品（流穿） 离子交换层析后洗脱1（留样4 ） 离子交换层析后洗脱2中活力较高样品（留样5）
实验原理
二、本实验采用的分离纯化方法的原理
3. 离子交换层析法
同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。 蛋白质在其等电点以下（pH<pI），带正电荷，可被阳离子交换树 脂所吸附；而蛋白质在其等电点以上（pH>pI），带负电荷，可被 阴离子交换树脂所吸附。 本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中猪胰 蛋白酶带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用CM-纤 维素离子交换树脂）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正 电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过 增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。 在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的 蛋白最先洗脱，结合力强的蛋白最后洗脱）。
⑤硫酸铵盐析沉淀（75%饱和度） ——计算硫酸铵用量时需扣除形成硫酸钙的 量。 （于4℃静置过夜） ⑥离心（离心10000 rpm，15 min）——取沉淀（为粗胰蛋白酶 ）
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（2）透析
将粗胰蛋白酶溶于适量预冷的0.001 mol/L HCl溶液中（用2 mol/L HCl调蒸馏水pH至3即可！）。
实验总体安排
第10周：
生物0911（分两组），生物0913（15人左右） 生物0912（分两组），生物0913（15人左右）
第11周：
注：每小组选两个组长，协调同学们分工、合作。 第9周，周五之前将分组同学名单、组长及每个 同学上课情况发到我邮箱： cuihongdu@
盐析沉淀法：用硫酸铵盐析法将目的蛋 白从粗提液中沉淀出来，使其得到浓缩， 并除去部分杂质（核酸、杂蛋白等）。
实验原理
二、本实验采用的分离纯化方法的原理
1. 透析法
由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差 的作用下，高分子溶液（如蛋白溶液） 中的小分子溶质（如无机盐）透向透析 液一侧，同时透析液中的缓冲液渗入蛋 白溶液一侧，经过透析液反复换液后， 即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。
①装柱
离子交换树脂
平衡
沿壁倒下
0.01 mol/L , pH5.0
柠檬酸钠缓冲液
3cm
1 ml/min
均匀 无气泡、裂纹
装柱
0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸 钠缓冲液
平衡
②上样
用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲 液透析后的粗酶液
注：需将未吸附 样品（流穿）进 行SDS-PAGE检 测！
3＃为空白管
①分别加入 3 mL 8％三氯乙酸和2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl、pH 8.0 缓冲液， ②离心（ 3000 r/min,5min）——取上清 ③用该样品作为空白，用来测定样品管（1 ＃ ）和对 照管（ 2 ＃ ）的A280。
实验方法
三、酶活力的测定
2. 胰蛋白酶活力的计算
恒流泵
③洗涤
0.01 mol/L , pH5.0 柠檬酸钠缓冲液
恒流泵
④洗脱1
0.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸 钠缓冲液
部分收集器
离子交换柱
恒流泵
⑤洗脱2
0.1 mol/L , pH6.0，柠檬 酸钠缓冲液
部分收集器
离子交换柱
恒流泵
实验方法
二、蛋白质含量的测定
方法：紫外吸收法 所测样品：
猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品1~样品5，用来 计算比活和纯化倍数；
离子交换层析过程中的分部收集样品，用来作层析 曲线（以样品管号为横坐标，以A280为纵坐标作曲 线）
实验方法
三、酶活力的测定
1. 测定方法
取3支试管按1～3编号： 1＃为样品管、 2 ＃为对 照管、 3＃为空白管 1＃为样品管
实验具体安排
星期一
粗猪胰蛋白酶的提取 硫酸铵沉淀，悬浮液放入4℃冰箱过夜 将硫酸铵沉淀离心后，取沉淀 透析 装柱→平衡 离子交换层析 蛋白含量测定 酶活测定 SDS-PAGE
①稀释酶液（根据蛋白含量测定结果，用0.1mol/L TrisHCl、pH 8.0缓冲液稀释至10～80μg/mL ）后，取 1 ml； ②精确加入1mL 37℃ 预热的10 mg/mL酪蛋白溶液； ③混匀，立即置于37℃水浴中，准确反应10min； ④加入3 mL 8％三氯乙酸 ，迅速摇匀，终止反应； ⑤离心（ 3000 r/min,5min）——取上清； ⑥测A280
实验原理
一、胰蛋白酶的基本特性 二、本实验采用的分离纯化方法的原理
1. 沉淀法 2. 透析法 3. 离子交换层析技术
三、胰蛋白酶活性测定原理
实验原理
一、胰蛋白酶的基本特性
胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中， 在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身 激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键 断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转 变为有活性的胰蛋白酶。
3．在实验中，可以采取什么方法来提高产率 和比活率？
实验报告格式
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四）
其中，前四部分内容为预习报告的内容； 第五部分（实验结果）和第六部分为实验过程中的 内容； 第五部分（实验结果与讨论）整理后与预习报告合 并为实验报告
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（3）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶
离子交换柱 恒流泵
部分收集器
离子交换流程简图
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（4）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶
①柱的平衡：用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液平衡 CM-纤维素离子交换柱 ②样品吸附：用恒流泵直接上样于CM-纤维素离子交换柱 ③洗涤：以0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液充分洗净未 吸附蛋白质 ④洗脱1：用0.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸钠缓冲液洗脱，并 分部收集样品，测定每个样品的蛋白含量，做层析曲线， 将出现一个蛋白峰（收集样品为留样4），此峰为猪胰凝乳 蛋白酶。 ⑤洗脱2：待胰凝乳蛋白酶峰过后，改用0.1 mol/L , pH6.0， 柠檬酸钠缓冲液洗脱，并分部收集样品，测定每个样品的 蛋白含量，做层析曲线，将出现一个蛋白峰（收集样品为 留样5），此峰为猪胰蛋白酶。 ⑥柱的再生
（1）粗猪胰蛋白酶的提取 （2）透析 （3）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶 实验具体操作参见《实验指导》
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
（1） 粗猪胰蛋白酶的提取
①猪胰脏去脂肪和结缔组织，切碎，称重约50 g →加入5倍体积预冷的pH2.5 乙酸酸化水 ②组织捣碎 ③提取、过滤（四层纱布）、离心（4℃下，10000 rpm，离心15 min ）—— 取上清（记录体积，收集约1.5 mL，作为留样1，测蛋白含量，及时SDS化） ④加入固体无水氯化钙粉末
实验结果
1．离子交换层析后收集各管样品的蛋白含量 及活性。 2. 以管数为横坐标、以A280及活性为纵坐标， 制作双坐标图的离子交换层析曲线。 3．测定粗酶液、胰酶激活后样品、离子交换 层析收集管中样品液的体积及酶活力，完成纯 化表格。 4．SDS-PAGE电泳结果
纯化表格
纯化步骤
胰酶激活 后样品 透析后上 柱前样品 离子交换 层析后的 洗脱2
胰蛋白酶
His 46
S
Ser 18 3
S S
S Active site
Val AspAspAspAspLys
Val Ile GlyHis Ser
S S S
S
The process of trypsinogen activation
胰蛋白酶原激活过程
实验原理
二、本实验采用的分离纯化方法的原理
1. 沉淀法
活力单位的定义：在一定条件下每分钟酶水解底物酪蛋白形成的溶液 在280nm处吸光度A280增加一个单位的酶量为一个蛋白酶活力单 位（U）。
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化 二、蛋白质含量的测定 三、酶活力的测定 四、纯化效果测定 ——SDS-PAGE电泳检测
实验方法
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
胰蛋白酶活力单位数= △A280/t
式中， △A280——样品管A280-对照管A280 t——反应时间（min）
比活力=酶活力单位/毫克蛋白质=△A280/C· t V·
式中， △A280——样品管A280-对照管A280 C——每个样品管中酶液的浓度（mg/mL） V——每个样品管中酶液体积（mL) t——反应时间（min）