实验 细胞骨架的显示及观察

实验4 细胞骨架的显示及观察

姓名：李思露

学号：131140040

一、实验目的

1.掌握用考马斯亮蓝R250染色观察动物和植物细胞骨架的原理和方法。

2.了解免疫荧光法检测细胞成分的原理和方法。

二、实验原理

1.细胞骨架：指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、

细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微

管（microtubule，MT）、微丝（microfilament，MF）、中间纤维（intermediated

filament，IF）。

2.微管微管是细胞内由微管蛋白形成的直径约

呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细

胞器的位置和作为膜泡运输的导管。微管蛋

白有α和β两种。αβ异二聚体沿纵向聚

合成丝，原丝成环状排列形成微管的壁。微管

不稳定，对低温（冷冻）、高压等物理因素及

秋水仙素（微管断裂剂）等化学因素敏感。紫

杉醇可以和微管蛋白多聚体结合，抑制微管解

聚。

3.微丝：真核细胞内是主要由肌动蛋白（actin）组

成的直径为5～7nm的骨架纤丝。主要分布在细胞

质膜的内侧，作用是确定细胞表面特征、并与细胞

运动、收缩、内吞等功能有关。脊椎动物肌动蛋白

分为α、β和γ三种类型，不同种类细胞中肌动蛋

白组成不同。肌动蛋白单体为球形，依次连接成链，

两串肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝。细胞松

弛素B为微丝断裂剂。

4.中间纤维：直径介于微丝和微管之间（7~11nm）、由多种不同蛋白组成的细胞骨架

（1）了解细胞骨架与细胞各种功能行使之间的关系。

（2）了解理化因素是否通过影响细胞骨架对细胞功能产生影响，以便趋利避害。 （3）鉴定发育中的细胞及肿瘤的来源。

6. 显示细胞骨架的常用方法：考马氏亮蓝染色法、免疫荧光染色法、鬼笔环肽标记法。 （1）考马斯亮蓝染色法原理及特点

原理：用去垢剂Triton X-100处理细胞适宜

时间，可以溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解，剩下的纤维状细胞骨架蛋白比较稳定而不被溶解，然后用蛋白染料

考马斯亮蓝染色即可显示其结构。 特点：非特异蛋白染色，不能区分微管、微丝、中间纤维

（2）免疫荧光染色法原理及特点 原理：用TritonX-100处理固定处理过

的细胞，可增加细胞膜通透性，使抗体 能够进入细胞内与细胞骨架蛋白结合。接 着用荧光素标记的抗骨架蛋白抗体便可通 过直接免疫荧光法或间接免疫荧光法显示 骨架。

特点：特异显示各种骨架蛋白 （3）鬼笔环肽标记法原理及特点

原理：鬼笔环肽可特异性地结合肌动蛋白，因此，用荧光素标记的鬼笔环肽可以显示微丝。

特点：灵敏，能特异显示微丝。

三、 实验材料、试剂及用品

（一） 材料： 洋葱 （二） 试剂

（1）M-缓冲液。

（2）6mM 磷酸盐缓冲液（pH6.8）。 （3）含1%TritonX-100的M-缓冲液。 （4）用M-缓冲液配制的3.0%戊二醛。

（5）0.2%考马斯亮蓝R250染液。

（6）0.9%氯化钠生理盐水。

（三）用品

普通光学显微镜、荧光显微镜、水浴箱（ 37 ℃）

小剪刀、镊子、5mL一次性塑料注射器、胶头吸管、1.5mLEP管、1.5mL试管架四、实验操作

考马斯亮蓝染色法显示洋葱鳞茎内表皮细胞骨架

（1）材料准备：撕取洋葱鳞茎内表皮，裁成大小0.5cm×０.５ｃｍ的小片。

（2）PBS平衡：放入盛有1mL 6mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）的EP管中，静置使材料下沉（完全浸透）；然后用胶头滴管吸弃液体。

（3）TritonX-100处理：加1mL 1% TritonX-100溶液处理20min，然后用胶头滴管吸弃液体。

（4）洗涤：用M-缓冲液洗涤3次，每次加1.5mL溶液浸泡5min，然后用胶头滴管吸弃液体。

（5）固定：加1mL 3.0%戊二醛固定30min,然后用胶头滴管吸弃液体。

（6）洗涤：用PBS洗涤3次，每次浸泡5min,然后用胶头滴管吸弃液体。

（7）染色：用0.5~1.0mL 0.2%考马斯蓝R250染液染色10min。

（8）洗涤：用蒸馏水洗涤数遍。

（9）制备装片：给载玻片中央加1滴水，用镊子夹取样品在其中展开，然后加盖玻片。

（10）显微观察：在普通光学显微镜下，洋葱细胞骨架为布满细胞的蓝色网状结构。

（11）对照样品：①省去步骤（3），不用TritonX-100处理；②省去步骤（4）,用TritonX-100处理后不用M-缓冲液洗涤。

五、实验结果及结论

1.实验样品

图1洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（400倍）

实验样品的细胞骨架分布细密均匀，视野中只剩下细胞骨架的蛋白质，被考马斯亮蓝染成蓝色。在视野的上半部分，细胞的背景呈现蓝紫色，是由于最后洗涤不彻底所致。

2.对照样品①：不用TritonX-100处理

图2不用TritonX-100处理的洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（400倍）不用TritonX-100处理的对照样品①的细胞中除了细胞骨架还有很多膜泡结构，细胞中还有蓝色的细胞核。不用TritonX-100处理，使得视野中有很多非骨架蛋白，这些非骨架蛋白被考马斯亮蓝染成蓝色，影响对细胞骨架的观察。

3.对照样品②：用TritonX-100处理后不用M-缓冲液洗涤

图3用TritonX-100处理后不用M-缓冲液洗涤的洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（400倍）图3和图2的情况类似，视野中没有均匀细密的细胞骨架，这是由于M-缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂，EGTA 和EDTA螯合钙离子，溶液并提供镁离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。

用TritonX-100处理后虽然可以溶解膜脂和非细胞骨架蛋白，但是保留下来的骨架蛋白在没有M-缓冲液的作用下，其结构仍无法保持稳定，影响观察结果。

六、作业与思考题

1.比较用与不用1%TritonX-100处理的实验结果。

答：见五、实验结果与结论部分1、2。

2．查阅资料说明M-缓冲液中咪唑、MgCl2、EGTA、EDTA、巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）在稳定细胞骨架中的作用。

答：在M-缓冲液中，咪唑是缓冲剂，MgCl2提供Mg2+,EGTA 和EDTA螯合Ca2+，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察；巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）可以在二硫键被打开后使蛋白质的四级或三级结构被破坏，由于巯基乙醇能够打开蛋白质的结构，它常常被用于蛋白质分析，且巯基乙醇也常常被用于保护蛋白质