3 蛋白质结构分级和获取
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蛋白质组学（Proteomics)
主讲人：肖飞
中心法则
Genomics
Transcriptomics
Proteomics
教学目的和要求 对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学 功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫 切需要和重要任务。 蛋白质组学（ Proteomics) 是后基因组时代演进的核 心，是从整体水平上分析一个有机体，细胞或组织 的蛋白质组成及其活动规律的科学。
以人类泪液载脂蛋白为例，具体介绍下其 在PDB数据库中结构检索和可视化过程
第一步： 输 入 关 键 字 “ HUMAN TEAR LIPOCALIN”
第二步： 选择人类泪液载脂 蛋白1XKI
第三步： 点击 Biology Assembly 面 板展示其结构图
第四步： 1XKI结构展示图
作业
（一）蛋白质晶体结构X-衍射分析
是目前分辨率最高的结构测定方法，高通量晶体 结构分析中的几大重要环节是：数据处理与分析 、重原子的定位、密度修饰、分子替换、图形整 合、模型加工和确认。 摸索蛋白质结晶条件、快速处理晶体结构数据和 减少差错是目前蛋白质晶体结构分析的两大难题 或瓶颈。
晶体结构分析的常用软件有SOLVE，RESOLVE等。
对如下给定序列进行搜索，找到其晶体结 构，并下载该.pdb文件。作如下注释： 蛋白质名称，对应的基因名，单链氨基酸 数目，几条链，二级结构如何，所属家族 、物种，功能，跟什么疾病相关。 序列： MCDRKAVIKNADMSEEMQQDSVECATQALEKYNIEKDIAA HIKKEFDKKYNPTWHCIVGRNFGSYVTHETKHFIYFYLGQV AILLFKSG
Hale Waihona Puke Baidu荐教材
D. Liebler (1999) Introduction to Proteomics: Tools for the New Biology R. Twyman (2006) Principles of Proteomics 钱小红和贺福初 （2003）《蛋白质组学理论与方 法》 陈主初和肖志强 《疾病蛋白质组学》
X-衍射晶体分析技术和NMR技术的比较
与X-衍射晶体分析技术相比较，NMR技术在蛋白质 结构测定的速度上、和研究的对象上都存在一定的 限制，成本太高，步骤繁多。但其无需制备晶体标 本，可在溶液中直接测定，也可进行固相测定，因 此利用NMR法使得某些无法获得晶体结构的蛋白质 或非液相蛋白质（如膜蛋白）的结构测定成为可能 。相对而言，NMR技术更适合小分子质量以及水溶 性较好培养晶体困难的蛋白质结构的分析，对于蛋 白质折叠、局部动力学或构象分析、蛋白-蛋白相 互作用，NMR更体现其优越性。
蛋白质的立体结构是有规律的
蛋白质结构的形成及稳定性是受物理原理控制的 蛋白质的功能与结构密切相关
蛋白质结构分析的主要目标
1. 建立研究蛋白质结构信息发掘与预测的 方法； 2. 研究参与生命活动过程的蛋白质的物理 性质、空间架构、功能片段和相互作用； 3. 探索基于蛋白质结构表征蛋白质的生物 学意义； 4. 得到新的预测性的知识。
1982年诺贝尔化学奖，克卢格（A.Klug）将Ｘ射线衍 射技术与电子显微技术结合发明显微影象重组技术， 以及在结构分子生物学方面的研究 1985年诺贝尔化学奖，豪普特曼 (H.A.Haupt-man) 和 卡尔(J.Karlc) 开发了用于X射线衍射确定物质晶体结构 的直接计算法 1991年诺贝尔化学奖，恩斯特 （R.Ernst） 发明了傅 立叶变换核磁共振分光法和二维核磁共振技术 2002年诺贝尔化学奖，库尔特· 维特里希“发明了利用 核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法”
冷冻电子显微镜技术与X衍 射晶体结构分析方法比较
由冷冻电镜技术所获得的蛋白质三维结构与X射线 晶体技术非常相似，而且其信噪比非常低，并适合 于内在膜蛋白的分析。其独特优势为：可以用不同 的方法对均一的（如膜蛋白的二维晶体，二十面体 对称的病毒等对称结构）和不均一的（如核糖体等 ）样品进行三维结构重构，同时，冷冻电子显微镜 是唯一的能研究小到蛋白质、蛋白质复合物，大到 细胞器甚至整个细胞的方法 。
蛋白质通过其特定的三维结构行使其生物学功能 。
诺贝尔奖与蛋白质结构分析
1914年诺贝尔物理学奖，劳厄(M.von Laue) 发现晶体中的X 射线衍射现象 1915年诺贝尔物理学奖，布拉格父子用X射线对晶体结构的 研究 1936年诺贝尔化学奖，德拜(P.J.W.Debye)用Ｘ射线衍射技术 探明分子中原子的排列与结合形式 1944年诺贝尔物理学奖，拉比（I.I.Rabi） 发明核磁共振法
（三）冷冻电子显微镜技术
采用高压快速液氮冷冻方法使样品包埋在玻璃 态的水环境中，使我们能够观察到生物大分子在天 然状态下的结构；同时冷冻的速度极快，把细胞在 其生理活动的某些特定时刻固定下来，显示此时的 结构特点，进而可通过不同功能状态的瞬时构象变 化来研究生物分子的功能。冷冻电镜获得的是处于 天然状态下未经染色的分子的二维投影像。将样品 进行不同角度的倾斜所获得的数据进行综合分析， 并依据样品的不同特性使用不同的重构技术获得分 子的结构，在此基础上观察多种成分的图像变化， 追踪生物大分子的装配及其动力学过程。
推荐教材
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蛋白质组学研究技术 蛋白质双向电泳技术 生物质谱鉴定蛋白质技术 蛋白质翻译后修饰 蛋白质组学的定量研究技术 蛋白质结构分析技术 互作蛋白质组相互技术 蛋白质组信息学
蛋白质的分级结构
蛋白质的组织层次
一级结构 二级结构 三级结构 四级结构
蛋白质结构分类法 Class (<10) 结构类 Folds (<1000) 折叠子 Superfamily 超家族 ——序列或结构相似 Family 家族 ——序列相似性 > 25% – 30% ——同源 Homology
3、二硫键
CYS-S-H + H-S-CYS CYS-S-S-CYS
蛋白质结构与功能
Hemoglobin (血红蛋白) 运输氧气
蛋白质结构与功能
Porin (孔蛋白) 穿透细胞膜的运输
蛋白质通过其特定的三维结构行使其生物学功能。 蛋白质结构的测定： X-射线晶体学 NMR 电镜 AFM
（二）核磁共振波谱分析
利用核磁共振原理，检测分子质量小于 60kμ的蛋白质，通过对其核磁共振谱线特征参 数的测定来分析蛋白质的结构与性质，就是将原 始资料利用傅里叶变换转换为不同的峰值，然后 采集各种不同的峰组成图谱，并利用生物信息学 方法筛选出具有特定结构特征的图谱。 常用NMRPipe和SPARKY软件处理这些过程，使 用XEASY，DYANA和GARANT等软件分析侧链或骨架 结构。
蛋白质的一级结构
20种氨基酸残基由肽键相连成的序列 AGPFSCHEDSGPFCSFPGA?..
蛋白质结构原理
1、20种标准氨基酸
疏水性Ala Val Leu Ile Phe Pro Met
带电：Arg Lys Asp Glu (His) 极性：Ser Thr Cys Asn Gln His Tyr Trp 特殊：Gly (Pro) 2、多肽链状结构
1958年诺贝尔化学奖，桑格（F.Sanger） 分离和测定一 种蛋白质--胰岛素的氨基酸结构 1962年诺贝尔化学奖，佩鲁茨(M.F.Perutz)和肯德鲁 (J.C.Kendrew) 用 Ｘ射线衍射技术测定肌红蛋白和血红 蛋白 的原子排列 1964年诺贝尔化学奖，霍奇金（D.C.Hodgkin）测定维 生素B12等复杂晶体的结构 1972年诺贝尔化学奖，安芬森 (C.B.Anfinsen) 、莫尔 (S.Moore)和斯坦 (W.H.Stein) 对核糖核酸酶的三维结构及 其 124个氨基酸顺序的研究
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教学目的和要求 对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学 功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫 切需要和重要任务。 蛋白质组学（ Proteomics) 是后基因组时代演进的核 心，是从整体水平上分析一个有机体，细胞或组织 的蛋白质组成及其活动规律的科学。
以人类泪液载脂蛋白为例，具体介绍下其 在PDB数据库中结构检索和可视化过程
第一步： 输 入 关 键 字 “ HUMAN TEAR LIPOCALIN”
第二步： 选择人类泪液载脂 蛋白1XKI
第三步： 点击 Biology Assembly 面 板展示其结构图
第四步： 1XKI结构展示图
作业
（一）蛋白质晶体结构X-衍射分析
是目前分辨率最高的结构测定方法，高通量晶体 结构分析中的几大重要环节是：数据处理与分析 、重原子的定位、密度修饰、分子替换、图形整 合、模型加工和确认。 摸索蛋白质结晶条件、快速处理晶体结构数据和 减少差错是目前蛋白质晶体结构分析的两大难题 或瓶颈。
晶体结构分析的常用软件有SOLVE，RESOLVE等。
对如下给定序列进行搜索，找到其晶体结 构，并下载该.pdb文件。作如下注释： 蛋白质名称，对应的基因名，单链氨基酸 数目，几条链，二级结构如何，所属家族 、物种，功能，跟什么疾病相关。 序列： MCDRKAVIKNADMSEEMQQDSVECATQALEKYNIEKDIAA HIKKEFDKKYNPTWHCIVGRNFGSYVTHETKHFIYFYLGQV AILLFKSG
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X-衍射晶体分析技术和NMR技术的比较
与X-衍射晶体分析技术相比较，NMR技术在蛋白质 结构测定的速度上、和研究的对象上都存在一定的 限制，成本太高，步骤繁多。但其无需制备晶体标 本，可在溶液中直接测定，也可进行固相测定，因 此利用NMR法使得某些无法获得晶体结构的蛋白质 或非液相蛋白质（如膜蛋白）的结构测定成为可能 。相对而言，NMR技术更适合小分子质量以及水溶 性较好培养晶体困难的蛋白质结构的分析，对于蛋 白质折叠、局部动力学或构象分析、蛋白-蛋白相 互作用，NMR更体现其优越性。
蛋白质的立体结构是有规律的
蛋白质结构的形成及稳定性是受物理原理控制的 蛋白质的功能与结构密切相关
蛋白质结构分析的主要目标
1. 建立研究蛋白质结构信息发掘与预测的 方法； 2. 研究参与生命活动过程的蛋白质的物理 性质、空间架构、功能片段和相互作用； 3. 探索基于蛋白质结构表征蛋白质的生物 学意义； 4. 得到新的预测性的知识。
1982年诺贝尔化学奖，克卢格（A.Klug）将Ｘ射线衍 射技术与电子显微技术结合发明显微影象重组技术， 以及在结构分子生物学方面的研究 1985年诺贝尔化学奖，豪普特曼 (H.A.Haupt-man) 和 卡尔(J.Karlc) 开发了用于X射线衍射确定物质晶体结构 的直接计算法 1991年诺贝尔化学奖，恩斯特 （R.Ernst） 发明了傅 立叶变换核磁共振分光法和二维核磁共振技术 2002年诺贝尔化学奖，库尔特· 维特里希“发明了利用 核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法”
冷冻电子显微镜技术与X衍 射晶体结构分析方法比较
由冷冻电镜技术所获得的蛋白质三维结构与X射线 晶体技术非常相似，而且其信噪比非常低，并适合 于内在膜蛋白的分析。其独特优势为：可以用不同 的方法对均一的（如膜蛋白的二维晶体，二十面体 对称的病毒等对称结构）和不均一的（如核糖体等 ）样品进行三维结构重构，同时，冷冻电子显微镜 是唯一的能研究小到蛋白质、蛋白质复合物，大到 细胞器甚至整个细胞的方法 。
蛋白质通过其特定的三维结构行使其生物学功能 。
诺贝尔奖与蛋白质结构分析
1914年诺贝尔物理学奖，劳厄(M.von Laue) 发现晶体中的X 射线衍射现象 1915年诺贝尔物理学奖，布拉格父子用X射线对晶体结构的 研究 1936年诺贝尔化学奖，德拜(P.J.W.Debye)用Ｘ射线衍射技术 探明分子中原子的排列与结合形式 1944年诺贝尔物理学奖，拉比（I.I.Rabi） 发明核磁共振法
（三）冷冻电子显微镜技术
采用高压快速液氮冷冻方法使样品包埋在玻璃 态的水环境中，使我们能够观察到生物大分子在天 然状态下的结构；同时冷冻的速度极快，把细胞在 其生理活动的某些特定时刻固定下来，显示此时的 结构特点，进而可通过不同功能状态的瞬时构象变 化来研究生物分子的功能。冷冻电镜获得的是处于 天然状态下未经染色的分子的二维投影像。将样品 进行不同角度的倾斜所获得的数据进行综合分析， 并依据样品的不同特性使用不同的重构技术获得分 子的结构，在此基础上观察多种成分的图像变化， 追踪生物大分子的装配及其动力学过程。
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蛋白质的分级结构
蛋白质的组织层次
一级结构 二级结构 三级结构 四级结构
蛋白质结构分类法 Class (<10) 结构类 Folds (<1000) 折叠子 Superfamily 超家族 ——序列或结构相似 Family 家族 ——序列相似性 > 25% – 30% ——同源 Homology
3、二硫键
CYS-S-H + H-S-CYS CYS-S-S-CYS
蛋白质结构与功能
Hemoglobin (血红蛋白) 运输氧气
蛋白质结构与功能
Porin (孔蛋白) 穿透细胞膜的运输
蛋白质通过其特定的三维结构行使其生物学功能。 蛋白质结构的测定： X-射线晶体学 NMR 电镜 AFM
（二）核磁共振波谱分析
利用核磁共振原理，检测分子质量小于 60kμ的蛋白质，通过对其核磁共振谱线特征参 数的测定来分析蛋白质的结构与性质，就是将原 始资料利用傅里叶变换转换为不同的峰值，然后 采集各种不同的峰组成图谱，并利用生物信息学 方法筛选出具有特定结构特征的图谱。 常用NMRPipe和SPARKY软件处理这些过程，使 用XEASY，DYANA和GARANT等软件分析侧链或骨架 结构。
蛋白质的一级结构
20种氨基酸残基由肽键相连成的序列 AGPFSCHEDSGPFCSFPGA?..
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1、20种标准氨基酸
疏水性Ala Val Leu Ile Phe Pro Met
带电：Arg Lys Asp Glu (His) 极性：Ser Thr Cys Asn Gln His Tyr Trp 特殊：Gly (Pro) 2、多肽链状结构
1958年诺贝尔化学奖，桑格（F.Sanger） 分离和测定一 种蛋白质--胰岛素的氨基酸结构 1962年诺贝尔化学奖，佩鲁茨(M.F.Perutz)和肯德鲁 (J.C.Kendrew) 用 Ｘ射线衍射技术测定肌红蛋白和血红 蛋白 的原子排列 1964年诺贝尔化学奖，霍奇金（D.C.Hodgkin）测定维 生素B12等复杂晶体的结构 1972年诺贝尔化学奖，安芬森 (C.B.Anfinsen) 、莫尔 (S.Moore)和斯坦 (W.H.Stein) 对核糖核酸酶的三维结构及 其 124个氨基酸顺序的研究