蛋白质反胶束萃取
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反胶束体系在蛋白质萃取中应用的研究进展
一般说来 ,两种或两种以上表面活性剂构成的 体系对蛋白质有更高的分离效率 。例如将 AO T与 二 - ( 2-乙基己基 )磷酸 (D E I- IPA )构成的混合体系 , 可萃取相对分子质量较大的牛血红蛋白 ,萃取率达 80% , AO T /DOL PA 体系 、AO T / Tween- 85体系对蛋白 质的萃取能力都优于单一的 AO T体系 。非离子表面 活性剂的加入可使反胶团变大 ,从而可萃取相对分 子质量更大的蛋白质 [ 26 ] 。
4 反胶束体系萃取蛋白质的影响因素
蛋白质在反胶束中的增溶作用 。与蛋白质的表 面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用 、蛋白质 的疏水性以及反胶束的大小等因素有关 。任何对这 些性能产生影响的因素都将对蛋白萃取产生影响 。
411 体系组成
用于蛋白质分离的反胶束体系 可以 是离 子型 的 ,也 可 以 是 非 离 子 型 的 。其 中 研 究 最 多 的 是 以 AOT为代表的阴离子微乳体系 ,主要是因为 AOT形成 反胶束时不需加助表面活性剂 。但由于它不能萃取分 子量较大的蛋白质 ,其应用受到一定的限制 ,需进行改 性或加入某些表面活性剂进行复配 。如加入具有亲和 作用的生物表面活性剂 (磷脂等 )来改善萃取性能 。
312 纯化
D ekker[18 ]等用 TOMAC /异辛烷 +非离子型表面 活性剂反胶束体系 , 使 α- 淀粉酶的浓度提高了 l7 倍 ,收率达 85 % ;王金枝 [19 ]等用十六烷基三甲基溴化 铵 ( CTAB ) /正己醇 /正辛烷反胶束体系纯化胰蛋白
酶 ,商业用酶的纯化倍数最高为 1197 倍 ,粗酶为 7115 倍 ,且粗酶纯化后比活在 200U /m g以上 。
另外 ,许多反胶束萃取的实验研究表明 ,随着表征 水池大小的参数 w0 (反胶束中水与表面活性剂摩尔浓 度之比 )的降低 ,蛋白质的萃取率也减少 ,这充分说明了 位阻效应的存在。目前常用的阴离子表面活性剂 AOT 形成的反胶束 ,由于其胶束尺寸不够大 ,直接用于相对 分子质量较大的蛋白质的萃取时 ,萃取率不高 [15] 。
4 反胶束体系萃取蛋白质的影响因素
蛋白质在反胶束中的增溶作用 。与蛋白质的表 面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用 、蛋白质 的疏水性以及反胶束的大小等因素有关 。任何对这 些性能产生影响的因素都将对蛋白萃取产生影响 。
411 体系组成
用于蛋白质分离的反胶束体系 可以 是离 子型 的 ,也 可 以 是 非 离 子 型 的 。其 中 研 究 最 多 的 是 以 AOT为代表的阴离子微乳体系 ,主要是因为 AOT形成 反胶束时不需加助表面活性剂 。但由于它不能萃取分 子量较大的蛋白质 ,其应用受到一定的限制 ,需进行改 性或加入某些表面活性剂进行复配 。如加入具有亲和 作用的生物表面活性剂 (磷脂等 )来改善萃取性能 。
312 纯化
D ekker[18 ]等用 TOMAC /异辛烷 +非离子型表面 活性剂反胶束体系 , 使 α- 淀粉酶的浓度提高了 l7 倍 ,收率达 85 % ;王金枝 [19 ]等用十六烷基三甲基溴化 铵 ( CTAB ) /正己醇 /正辛烷反胶束体系纯化胰蛋白
酶 ,商业用酶的纯化倍数最高为 1197 倍 ,粗酶为 7115 倍 ,且粗酶纯化后比活在 200U /m g以上 。
另外 ,许多反胶束萃取的实验研究表明 ,随着表征 水池大小的参数 w0 (反胶束中水与表面活性剂摩尔浓 度之比 )的降低 ,蛋白质的萃取率也减少 ,这充分说明了 位阻效应的存在。目前常用的阴离子表面活性剂 AOT 形成的反胶束 ,由于其胶束尺寸不够大 ,直接用于相对 分子质量较大的蛋白质的萃取时 ,萃取率不高 [15] 。
反胶束萃取
水相pH ， 蛋白质pI
当蛋白质与表面活性剂 电荷相反时，易溶于反 胶束，分配系数较大。 否则，蛋白质不溶于反 胶团
蛋白质在反胶 团中溶解
在两相间的分配系数
4.3.2 位阻效应 许多亲水性物质，如蛋白质、核酸及氨基酸 等生物大分子的分子较大，当反胶团直径较小 时，会对蛋白质产生空间排阻作用，从而使蛋 白质在反胶团中的溶解度降低，这种现象称为 位阻效应。 反胶团的“水池”直径受含水率W的调节， 当水溶液中盐浓度较高时，无机盐对反胶团产 生脱水作用，使W下降，反胶团尺度减小，位阻 效应加强，蛋白质的萃取率明显降低。
何谓胶团、反胶团 • 反胶团是指当油相中 表面活性剂的浓度超 过临界胶束浓度后,其 分子在非极性溶剂中 自发形成的亲水基向 内、疏水基向外的具 有极性内核(polarcore) 的多分子聚集体
反胶团萃取
• 反胶团是表面活性剂分子溶 于非极性溶剂中自发形成的 聚集体 ,其中表面活性剂的 极性头朝内而非极性头朝外 与有机溶剂接触。 • 反胶团内可溶解少量水而形 成微型水池，蛋白质进入微 水池中，可随反胶团转入有 机溶剂，但不与有机溶剂直 接接触，反胶团萃取就是利 用这一特性进行蛋白质分离 的方法，反胶团溶液是宏观 上透明均一的热力学稳定体 系。
5.2离子强度对萃取率的影响
a.离子强度增大后，反胶束内表面的双电层变薄，
减弱了蛋白质与反胶束内表面之间的静电吸引， 从而减少蛋白质的溶解度； •b.反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱了表面 活性剂极性基团之间的斥力，使反胶束变小，从 而使蛋白质不能进入其中； •c.离子强度增加时，增大了离子向反胶束内“水 池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质 从反胶束内被盐析出来； •d.盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改 变溶解性能，盐的浓度越高，其影响就越大
反胶束萃取,蛋白质,萃取
反胶束萃取,蛋白质,萃取
反胶束萃取是一种常用的蛋白质萃取方法。
胶束是稳定的胶体粒子，由Surfactant（表面活性剂）分子聚集形成的。
通常在常规的胶束萃取中，表面活性剂会用于分离或提取目标分子，例如蛋白质。
反胶束萃取则与之不同，它将胶束翻转，使表面活性剂分子的疏水区域朝外，疏水区域包裹着疏水性物质，如蛋白质。
这种方法提取的蛋白质具有好的纯度和高的活性，且不含显著的表面活性剂残留。
因此，反胶束萃取越来越被广泛应用于生物技术领域中的蛋白质分离和纯化过程。
反胶束萃取技术及应用
反胶团萃取体系
单一反胶团体系： 单一反胶团体系[1] 的表面活性剂有阴离子型、阳离子 型和非离子型。研究最多的是AOT/ 异辛烷体系, 该体 系结构简单而稳定, 反胶团体积相对较大,适用于等电 点较高、相对分子质量较小的蛋白质的分离; AOT：丁二酸- 2 - 乙基已基酯磺酸钠 常用的阳离子型表面活性剂有TOMAC、十六烷基三 甲基溴化铵(CTAB) 、二辛基二甲基氯化铵等季铵盐。
反胶束的制备
溶解法：对非水溶性的蛋白质可用此法。将含 有反胶束的有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅 拌时蛋白质进入反胶束中（需较长的时间）。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
提取胞内酶及胞外酶
Rahaman 等[5] 用AOT/ 异辛烷体系, 从发酵液中 回收了碱性蛋白酶, 酶的提取率可达50 %; Giovenco 等[6]用CTAB/ 己醇- 辛烷体系提取和纯化棕色固氮 菌的胞内脱氢酶: 完整的细胞在表面活性剂的作用下 溶解, 析出酶进入反胶团的“水池”中, 再通过选取 适当的反萃取方法, 回收高浓度的活性酶。
反胶团萃取体系
混合反胶团体系： 这是指两种或两种以上表面活性剂构成的体系。 一般说来, 混合表面活性剂反胶团体系对蛋白质有更 高的分离效率。 例如将AOT 与二- (2 - 乙基己基)磷酸(DEHPA) 构成的 混合体系, 可萃取相对分子质量较大的牛血红蛋白, 萃 取率达80 %。 非离子表面活性剂的加入可使反胶团变大, 从而可萃 取相对分子质量更大的蛋白质。
对一个由水、表面活性剂和非极性有机溶剂构 成的三元系统, 共存相可用三元相图表示。 由下页中图2是水-AOT- 异辛烷系统的相图示 例, 从图2 可知, 能用于蛋白质分离的仅是位于 底部的两相区, 在此区内的三元混合物分为平 衡的两相: 一相是含有极少量有机溶剂和表面 活性剂的水相; 另一相是作为萃取剂的反胶束 溶液。
反胶束萃取方法步骤
反胶束萃取
随着基因工程和细胞工程的发展，尽管传统的分离方法 （如溶剂萃取技术）已在抗生素等物质的生产中广泛应 用，并显示出优良的分离性能，但它却难以应用于蛋白 质的提取和分离。其主要原因有两个：一是被分离对 象—蛋白质等在40~50℃便不稳定，开始变性，而且绝大 多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂 接触，也会引起蛋白质有变性；二是萃取剂问题，蛋白 质分子表面带有许多电荷，普通手离子缔合型萃取剂很 难奏效。因此研究和开发易于工业化的、高效的系列化 物质分离方法已民为当务之急。反胶束萃取法就是在这 一背景下发型起来的一种新型分离技术。
当W0超过60（最大含水量）时，透明的反胶束溶液将 变浑浊，并发生分相。对于季铵盐形成的反胶束， W0一般小于3。在列平衡水相存在的情况下，W0可以 人为地在一定范围内调节。
9.2 反胶束萃取蛋白质的基本原理
9.2.1 三元相图及萃取蛋白质 对一个由水、表面活性剂和非极性有机
溶剂构成的三元系统，存在有多种共存 相，可用三元相图表示，如图10.5是水AOT-异辛烷系统的相图示例。
由于实验方法不同，所得的CMC值往往给于完全一致， 但是突变点总是落在一个很窄的浓度范围内，故用 CMC范围来表示更为方便。
表9.2是几种类型表面活性剂的CMC值，可以看出， CMC值与活性剂的结构有一定的联系。在非极性溶剂 中CMC值的变化范围是
1.0×10-4~1.0×10-3mol/L。
9.1.3 胶束与反胶束的形成
9.2.3 蛋白质溶入反胶束溶液的推动力与 分配特性
9.2.3.1 推动力 蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包
括表面活性剂与蛋白质的静电作用力和 位阻效应。
（1）静电作用力
在反胶束萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电 的分子，因此静电相互作用肯定是萃取过程中的一种 推动力。其中一个最直接的因素是pH值，它决定了蛋 白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电荷。
随着基因工程和细胞工程的发展，尽管传统的分离方法 （如溶剂萃取技术）已在抗生素等物质的生产中广泛应 用，并显示出优良的分离性能，但它却难以应用于蛋白 质的提取和分离。其主要原因有两个：一是被分离对 象—蛋白质等在40~50℃便不稳定，开始变性，而且绝大 多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂 接触，也会引起蛋白质有变性；二是萃取剂问题，蛋白 质分子表面带有许多电荷，普通手离子缔合型萃取剂很 难奏效。因此研究和开发易于工业化的、高效的系列化 物质分离方法已民为当务之急。反胶束萃取法就是在这 一背景下发型起来的一种新型分离技术。
当W0超过60（最大含水量）时，透明的反胶束溶液将 变浑浊，并发生分相。对于季铵盐形成的反胶束， W0一般小于3。在列平衡水相存在的情况下，W0可以 人为地在一定范围内调节。
9.2 反胶束萃取蛋白质的基本原理
9.2.1 三元相图及萃取蛋白质 对一个由水、表面活性剂和非极性有机
溶剂构成的三元系统，存在有多种共存 相，可用三元相图表示，如图10.5是水AOT-异辛烷系统的相图示例。
由于实验方法不同，所得的CMC值往往给于完全一致， 但是突变点总是落在一个很窄的浓度范围内，故用 CMC范围来表示更为方便。
表9.2是几种类型表面活性剂的CMC值，可以看出， CMC值与活性剂的结构有一定的联系。在非极性溶剂 中CMC值的变化范围是
1.0×10-4~1.0×10-3mol/L。
9.1.3 胶束与反胶束的形成
9.2.3 蛋白质溶入反胶束溶液的推动力与 分配特性
9.2.3.1 推动力 蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包
括表面活性剂与蛋白质的静电作用力和 位阻效应。
（1）静电作用力
在反胶束萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电 的分子，因此静电相互作用肯定是萃取过程中的一种 推动力。其中一个最直接的因素是pH值，它决定了蛋 白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电荷。
实验七 反胶束萃取法PH对萃取率的影响
和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。 微观上，是从主体水相向溶解于有机溶剂相中的反胶团
微水相中的分配萃取。 从原理上，可当做“液膜”分离操作的一种。 如下图所示 ：
反胶束萃取的动力来自于两方面： （1）静电作用：当溶剂所带电荷与表面活性相反时，
由于静电引力的作用，溶质易溶于反胶团，溶解 率或分配系数较大，反之，则不能溶解于反胶团 中。 （2）空间位阻作用：增大反胶束极性核的尺寸，以 减少大分子蛋白质进入胶核的阻力。
都有影响。 常用的溶剂有：烷烃类（正己烷、环己烷、正辛烷、
异辛烷等）。 有时也使用助溶剂，如醇类。可以调节溶剂体系的
极性，改变反胶团的大小，增加蛋白质的溶解度。
反胶体萃取技术的优点
(1)反胶束萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反 萃取率都很高等突出的优点。
（2）反胶束萃取还有可能解决外源蛋白的降解，即蛋白质 (胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题，而且由于构成 反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用 于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。反胶束萃取技术为蛋 白质的分离提取开辟了一条具有工业开发前景的新途径
正常胶束：
表面活性剂的极 性头朝外，疏水
水
的尾部朝内，中
间形成非极性的
“核”
非极性“尾”
非极性的“核”
极性“头” 图a
（三）反胶束
若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使 其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚 集体，这种聚集体称为反胶束，其结构示意见图b。 在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性 的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极 性核。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶 解水后，就形成了“水池”。
常用表面活性剂 表面活性剂的存在是构成反胶团的必要条件，
微水相中的分配萃取。 从原理上，可当做“液膜”分离操作的一种。 如下图所示 ：
反胶束萃取的动力来自于两方面： （1）静电作用：当溶剂所带电荷与表面活性相反时，
由于静电引力的作用，溶质易溶于反胶团，溶解 率或分配系数较大，反之，则不能溶解于反胶团 中。 （2）空间位阻作用：增大反胶束极性核的尺寸，以 减少大分子蛋白质进入胶核的阻力。
都有影响。 常用的溶剂有：烷烃类（正己烷、环己烷、正辛烷、
异辛烷等）。 有时也使用助溶剂，如醇类。可以调节溶剂体系的
极性，改变反胶团的大小，增加蛋白质的溶解度。
反胶体萃取技术的优点
(1)反胶束萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反 萃取率都很高等突出的优点。
（2）反胶束萃取还有可能解决外源蛋白的降解，即蛋白质 (胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题，而且由于构成 反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用 于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。反胶束萃取技术为蛋 白质的分离提取开辟了一条具有工业开发前景的新途径
正常胶束：
表面活性剂的极 性头朝外，疏水
水
的尾部朝内，中
间形成非极性的
“核”
非极性“尾”
非极性的“核”
极性“头” 图a
（三）反胶束
若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使 其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚 集体，这种聚集体称为反胶束，其结构示意见图b。 在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性 的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极 性核。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶 解水后，就形成了“水池”。
常用表面活性剂 表面活性剂的存在是构成反胶团的必要条件，
第八章反胶团萃取
在AOT反胶团中，水合化一分子AOT需要 6～8个水分子，而其他水分子则不受束缚， 可与普通水一样自由流动，所以当W＞16 时，“水池”中的水逐渐接近主体水相粘度， 胶团内也形成双电层。
胶团变化示意图
反胶团的制备
1.液液接触法
即将含蛋白质的水相与含表面活性剂的
有机相接触。
2.注入法
将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有
影响液膜萃取的操作参数
pH:对弱电解质，pH将影响其荷电形式
及不同电荷形式溶质的分率，从而影响 萃取率。
速度：对于支撑液膜，料液流速引起流
体力学的特性改变直接影响萃取率；对 于乳状液膜，搅拌速度影响乳化液的分 散和液膜的稳定性。
共存杂质
流动载体为离子交换萃取剂时，料液中 如果存在与目标分子带相同电荷的杂质时，由 于杂质的竞争会减小用于目标分子和供能离子 输送的载体量，引起目标分子通透性的下降。
反胶束萃取的原理： 疏
静电引力：主要是蛋白质的表面电荷
与反胶束内表面电荷（离子型表面活 性剂）之间的静电引力作用。 空间位阻作用：增大反胶束极性核的 尺寸，以减小大分子蛋白进入胶核的 传质阻力。
反胶束萃取的原理：
凡是能够引起静电引力，能够促使反
胶束尺寸增大的因素均有利于提高分 配系数。 这些因素主要是pH、离子强度、表面 活性剂种类和浓度等，通过因素优化， 实现选择性地萃取和反萃取。
液膜 料液 (W/O)/W型乳液液膜
②支撑液膜
支撑液膜是将固体膜浸在膜
溶剂(如有机溶剂中)使膜溶剂 液膜 充满膜的孔隙形成液膜。 支撑液膜分隔料液相和反萃 反 料 相,实现渗透溶质的选择性萃取。 萃 液 相 当液膜为油相时，常用的多 孔膜为聚四氟乙烯、聚乙烯和 聚丙烯等高疏水性膜。 与乳状液膜相比，支撑液膜 支撑液膜 结构简单，放大容易。
5.6反胶束萃取知识讲解
▪ 蛋白质复性
反胶团复性固态变性蛋白质示意图
Masafumi Sakono等（2004）利用非离子型表 面活性剂四甘醇十二烷基醚形成反胶束使碳酸酐 酶Ｂ复性，20h内收率达到70%以上。
反胶束萃取复性与稀释复性相比较
思考:
1、什么是正常胶束？什么是反胶束？ 各在怎样的条件下形成？ 2、反胶束萃取的基本原理是什么？
己醇/环己烷
TOMAC[三 环己烷 辛基甲基
磷脂酰胆碱 苯、庚烷
氯化氨]
用得最多的是阴离子表面活性剂 AOT（丁二酸-2-2乙基己基酯磺酸钠）。
图1 AOT的结构式
▪ 将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过
CMC时，表面活性剂就会在水溶液中聚集 在一起而形成聚集体，称为正常胶束。
▪ 若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，
图6 蛋白质相对分子量Mr与最佳pH和pI值之差的关系 （在TOMAC-正丁醇体系中萃取）
对于包含大蛋白分子的反胶束，其尺 寸远大于“空核”的反胶束，萃取时势必 要消耗较多的能量，这些能量只能通过较 强 的 静 电 相 互 作 用 得 到 补 偿 。 用 调 节 pH 的作用来增加蛋白质分子表面电荷的方法， 正是达到增强静电作用的一条途径。
极性“头”
非极性的 “核”
非极性“尾”
图2-a 正常胶束的结构示意图
反胶束
有机溶剂 极性“头”
▪ 表面活性剂的极性 头朝内，疏水的尾 部向外，中间形成 极性的“核”。
极性的“核”
非极性“尾”
图2-b 反胶束的结构示意图
反胶束的制备
相转移法
注入法
溶解法
反胶束的特性
❖ 临界浓度 大多数为0.1~1.0mmol/L；
▪ 反胶束“水池”的物理性能会影响蛋白
反胶束萃取蛋白质的研究
1997 年 4 月 第 10 卷第 2 期
烟台大学学报 ( 自然科学与工程版 )
Journal of Yantai U niversity ( N atural Science and Eng ineering)
A pr. 1997 Vol. 10 N o. 2
研究简报
反胶束萃取蛋白质的研究
张亦飞
* *
时, 随着溶剂比降低 , 溶菌酶萃取率急剧下降 . 料液中蛋白质浓度提高
和反胶束溶液中表面活性剂浓度降低, 均使临界溶剂比提高 . CP : 蛋白质浓度/ g L - 1 , I : 离子强度 / mol L- 1 , E : 蛋白质萃取率 , S : 溶 : 临界溶剂比 参
1 2 3 4 5
Abstract P rot ein ext ract ion using AOT isooct ane reverse micelle solut ions has been studied. T he ef fect of pH, ionic strengt h and protein concent rat ion in a bulk aqueous phase, of AOT concent rat ion in an organic phase and of solvent rat io on lysozyme and t ion on ex tract ion are present ed. Key words reverse m icelles, prot ein, ex tract ion, aerosol OT . ( 责任编辑 柳瑞雪) chymotrypsin ext rac
近年来, 随着生物工程的发展 , 能连续化和规模化的有效分离和浓缩蛋白质的方法越来 越受到重视 . 反胶束萃取具有传统液液萃取的优点, 且蛋白质得率高、 不易变性 , 受到国 内外研究工作者的普遍关注. 我们选用溶菌酶和 糜蛋白酶对丁二酸 ( 二) 2 乙基己基酯磺 酸钠 ( AOT ) 异辛烷反胶束溶液萃取蛋白质的性能进行了研究.
反胶束萃取
18
第二节
反胶团的形成
（1）阴离子型 在反胶束萃取蛋白质的研究 中，用得最多的是阴离子表面活 性 剂 AOT(AerosolOT) ， 其 化 学 名为丁二酸－2－乙基己基磺酸 钠（或双(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠），结 构式见下页图。
19
第二节
反胶团的形成
20
第二节
反胶团的形成
这种表面活性剂容易获得，其特 点是具有双链，极性基团较小、形 成反胶束时不需加助表面活性剂， 并且所形成的反胶束较大，半径为 170nm，有利于大分子蛋白质进入。
另外，因有机相内反胶团中微水相 体积最多仅占有机相的几个百分点， 所以它同时也是一个浓缩操作。如 后所述，只要直接添加盐类，就可 能从已和主体水相分开的有机相中 分离出含有目的物的浓稠水溶液， 操作上非常简单。
49
第三节
生理活性物质的分离浓缩
1、 三元相图及萃 取蛋白质
对一个由水、表面 活性剂和非极性有机溶 剂构成的三元系统，存 在有多种共存相，可用 三元相图表示，右图是 水－AOT－异辛烷系统 的相图示例。
34
第二节
反胶团的形成
反胶团“水池”中的水与普通的 水在性质上是有差异的。当W<6-8 时，微水相中的水分子被表面活性 剂亲水性基团强烈地束缚，其表观 粘度可增大到普通水粘度的50倍， 且疏水性非常强。
35
第二节
反胶团的形成
其冰点通常低于0℃。进一步 的研究发现，这一部分水实际上起 着使表面活性剂的亲水性基团水合 化的作用。因为这一部分水被牢固 地束缚着，所以粘度很大，流动性 很差。
36
第二节
反胶团的形成
在AOT反胶团中，水合化一分子 AOT需要6-8个水分子，而其他水分 子则不受束缚，可与普通水一样自 由流动，所以当W>16时，“水池” 中的水逐渐接近主体水相粘度，胶 团内也形成二重电荷层
第二节
反胶团的形成
（1）阴离子型 在反胶束萃取蛋白质的研究 中，用得最多的是阴离子表面活 性 剂 AOT(AerosolOT) ， 其 化 学 名为丁二酸－2－乙基己基磺酸 钠（或双(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠），结 构式见下页图。
19
第二节
反胶团的形成
20
第二节
反胶团的形成
这种表面活性剂容易获得，其特 点是具有双链，极性基团较小、形 成反胶束时不需加助表面活性剂， 并且所形成的反胶束较大，半径为 170nm，有利于大分子蛋白质进入。
另外，因有机相内反胶团中微水相 体积最多仅占有机相的几个百分点， 所以它同时也是一个浓缩操作。如 后所述，只要直接添加盐类，就可 能从已和主体水相分开的有机相中 分离出含有目的物的浓稠水溶液， 操作上非常简单。
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第三节
生理活性物质的分离浓缩
1、 三元相图及萃 取蛋白质
对一个由水、表面 活性剂和非极性有机溶 剂构成的三元系统，存 在有多种共存相，可用 三元相图表示，右图是 水－AOT－异辛烷系统 的相图示例。
34
第二节
反胶团的形成
反胶团“水池”中的水与普通的 水在性质上是有差异的。当W<6-8 时，微水相中的水分子被表面活性 剂亲水性基团强烈地束缚，其表观 粘度可增大到普通水粘度的50倍， 且疏水性非常强。
35
第二节
反胶团的形成
其冰点通常低于0℃。进一步 的研究发现，这一部分水实际上起 着使表面活性剂的亲水性基团水合 化的作用。因为这一部分水被牢固 地束缚着，所以粘度很大，流动性 很差。
36
第二节
反胶团的形成
在AOT反胶团中，水合化一分子 AOT需要6-8个水分子，而其他水分 子则不受束缚，可与普通水一样自 由流动，所以当W>16时，“水池” 中的水逐渐接近主体水相粘度，胶 团内也形成二重电荷层
第八章反胶团萃取
反胶团萃取的工艺过程
前萃取 将目的蛋白质有选择性地从发酵液中转
移到反胶团溶液中。 后萃取 再用第二种水相溶液从反胶团中将该蛋
白质萃取出来。
影响反胶团萃取的因素
溶液的pH 溶液的离子强度 表面活性剂的浓度和种类 其他（有机溶剂、助表面活性剂、温
度）
反胶团萃取的应用
纯化和分离蛋白质、氨基酸、酶、多 肽等
迅速失活的问题； ④表面活性剂往往具有细胞破壁功效，可直接
从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶； ⑤成本低，溶剂可反复使用等。
反胶团的形成
反胶团的构造
当向水溶剂中加入表面活性剂时，如表面活性剂的 浓度超过一定的数值时，形成正胶团。当向非极性 溶剂中加入一定量的表面活性剂时，会形成反胶团 或反向胶团。
蛋白质溶解方式示意图
反胶团萃取蛋白质的基本原理
是从主体水相向溶解于有机溶剂相中反 胶团微水相中的分配萃取。
同时也是一个 浓缩操作。
改变水相条件 可实现反萃取。
反胶团萃取蛋白质的示意图
“水壳”模型（water-shell mode））
蛋白质向非极性溶剂中反胶团的纳米级水池 中的溶解，如图所示的四种可能。
液膜的种类
液膜根据其结构可分为多种，但具 体有实际应用价值的主要有三种：
①乳状液膜 ②支撑液膜 ③流动液膜
液膜萃取
定义
液膜是由水溶液或有机溶剂构 成的液体薄膜。利用液膜将与之不能 互溶的液体分隔开来，使其中一侧的 液体中的溶质选择性的透过液膜进入 另一侧，实现溶质之间的分离。
液膜萃取机理
单纯迁移
液膜：通常是由溶剂、表面活性剂
和添加剂制成的。溶剂构成膜基体； 表面活性剂起乳化作用，可以促进 液膜传质速度并提高其选择性；添 加剂用于控制膜的稳定性和渗透性。
4.2反胶团萃取
2
基本性质
• 一般反胶团的含水率 不超过40. W0不超过 • 依据上式 利用 依据上式, 利用AOT 形成的水核直径一般不 超过12nm, 大致可容纳 超过 一个直径为5-10nm的 的 一个直径为 pro分子 分子. 分子 •当pro分子与反胶团直 当 分子与反胶团直 径相比大得多时(如 当 径相比大得多时 如,当 M > 100-200kD),难于溶 难于溶 解到反胶团中. 解到反胶团中
Hale Waihona Puke AOT/异辛烷系统的含水率与 AOT AOT/ 异辛烷系统的含水率与AOT 浓度无 异辛烷系统的含水率与 AOT浓度无 这是多数反胶团系统的共性. 关,这是多数反胶团系统的共性.
反胶团(reverse micelles): 反胶团(reverse micelles): • 若向有机溶剂中加入一定浓度S，并令其浓度超过 若向有机溶剂中加入一定浓度S 有机溶剂中加入一定浓度 临界胶团浓度时，表面活性剂会在有机溶剂中形 临界 胶 团浓度时 ， 表面活性剂 会在有机溶剂中形 成一种稳定的大小为毫微米级的聚集体， 成一种稳定的大小为毫微米级的聚集体 ， 这聚集 体就是反胶团。 体就是反胶团。 • 反胶团的形态：球形或近似球形，也呈柱状。 反胶团的形态：球形或近似球形，也呈柱状。 极性核: S分子的自组装形成了极性核。具有溶解极 极性核 分子的自组装形成了极性核。 分子的自组装形成了极性核 性物质的能力。 性物质的能力。 微水相或“水池” 极性核溶解于水后就形成“ 微水相或“水池” ：极性核溶解于水后就形成“水 池”。反胶束内溶解的水
4.2 反胶束萃取
• 反胶团萃取类似于水- 有机溶剂的液液萃取， 但它是利 反胶团萃取类似于水 - 有机溶剂的液液萃取 ， 用了表面活性剂在有机相形成的反胶团水池的双电层与 蛋白质的静电吸引作用，而将不同极性（等电点） 蛋白质的静电吸引作用，而将不同极性（等电点）、 不 同分子量的蛋白质选择性地萃取到有机相， 同分子量的蛋白质选择性地萃取到有机相，达到分离目 的。 • 例如： 例如：蛋白质 • • 利用调节pH 值选择性地使蛋白质萃取到有机相的液 利用调节 pH值选择性地使蛋白质萃取到有机相的液 pH 液萃取方法，易使蛋白质变性； 液萃取方法，易使蛋白质变性； 利用离子对试剂与蛋白质作用形成疏水性物质而萃 取至有机相的办法， 取至有机相的办法 ， 常因缔合物在有机相的分配系 数太小（蛋白质带电荷多，亲水性强）而难成功。 数太小（蛋白质带电荷多，亲水性强）而难成功。
反胶束萃取蛋白质
反胶束萃取蛋白质
反胶束萃取蛋白质是一种常用的蛋白质提取方法。
与传统的胶束萃取相比，反胶束萃取具有更高的效率和选择性。
反胶束萃取的原理是利用表面活性剂作为萃取剂，将蛋白质从样品中提取出来。
与胶束萃取不同的是，反胶束萃取使用的表面活性剂是带有负电荷的，可以与大部分蛋白质发生作用。
此外，反胶束萃取还可以通过改变表面活性剂的性质来调整萃取效率和选择性。
因此，反胶束萃取在生物医学和生化研究中得到了广泛应用。
- 1 -。
反胶束萃取
❖ 水相的pH值决定了蛋白质表面电荷的状态、从 而对萃取过程造成影响。
❖ 对不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率 的影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增加时， 只有增大(pH-PI)值的绝对值，相转移才能顺利 完成
负电荷（AOT-----丁二酸－2－乙基己基酯磺酸钠)
正电荷（TOMAC(triomethyl-ammonium chloride)氯化三辛基
DDAB 甲铵；
(didodecyldimethyl ammonium bromide)溴化十二烷基二
CTAB 甲铵；
(cetyl-methyl-ammonium bromide溴化十六烷基三甲胺/
(d)蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾发生相互 作用，被几个小反胶团所“溶解”。
反胶束萃取蛋白质的基本原理
三元相图
由水、表面活性剂和非极性有机溶剂构成的三元系统. 能用于蛋白质分离的仅是位于底部的两相区：水相；反 胶束溶液。
物理化学性质: 界面张力在0.1－2mN/m范 围内，密度差为10％-20％， 反胶束溶液粘度适中，大约 为1mPa·s。
蛋白质的萃取 1)蛋白质溶解原理
蛋白质
界面间的表 面活性剂
静电作用
蛋白质进入 反胶束溶液 是一个协同 过程。
变形
包含有蛋白质的反胶束
（相界面）
扩散进入有机相
蛋白质萃取
萃取 过程
改变水相条 件 （ pH 、 离子种类 和强度） 使蛋白质 由有机相 返回水相， 实现反萃 取过程.
反萃取 过程
2）蛋白质进入反胶束相的传质三过程
表面液膜扩散
蛋白质（水相）
到达相界面
含有蛋白质的反胶束
扩散 有机相
进入反胶束
❖ 对不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率 的影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增加时， 只有增大(pH-PI)值的绝对值，相转移才能顺利 完成
负电荷（AOT-----丁二酸－2－乙基己基酯磺酸钠)
正电荷（TOMAC(triomethyl-ammonium chloride)氯化三辛基
DDAB 甲铵；
(didodecyldimethyl ammonium bromide)溴化十二烷基二
CTAB 甲铵；
(cetyl-methyl-ammonium bromide溴化十六烷基三甲胺/
(d)蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾发生相互 作用，被几个小反胶团所“溶解”。
反胶束萃取蛋白质的基本原理
三元相图
由水、表面活性剂和非极性有机溶剂构成的三元系统. 能用于蛋白质分离的仅是位于底部的两相区：水相；反 胶束溶液。
物理化学性质: 界面张力在0.1－2mN/m范 围内，密度差为10％-20％， 反胶束溶液粘度适中，大约 为1mPa·s。
蛋白质的萃取 1)蛋白质溶解原理
蛋白质
界面间的表 面活性剂
静电作用
蛋白质进入 反胶束溶液 是一个协同 过程。
变形
包含有蛋白质的反胶束
（相界面）
扩散进入有机相
蛋白质萃取
萃取 过程
改变水相条 件 （ pH 、 离子种类 和强度） 使蛋白质 由有机相 返回水相， 实现反萃 取过程.
反萃取 过程
2）蛋白质进入反胶束相的传质三过程
表面液膜扩散
蛋白质（水相）
到达相界面
含有蛋白质的反胶束
扩散 有机相
进入反胶束
反胶束萃取技术的应用
文震等利用超临界CO2/ 微乳(反胶束)萃取技术， 研究海 星甾体活性成分在超临界CO2 微乳多相体系中溶解平衡与 萃取过程。
2.6.2 胶束萃取与超声波技术联用
反胶束技术与超声波技术联用，不仅超声的空化作用以 及机械粉碎作用可以增加植物蛋白在反胶束中的萃取率， 而且，萃取得到的蛋白质与未联用超声技术、传统碱溶酸 沉法提取的蛋白质相比持水性、起泡性、起泡稳定性及乳 化稳定性更优。
1 反胶束技术概述
反胶束：表面活性剂在有机溶剂中，当浓度大于临界胶束 浓度时形成极性头向内，非极性尾朝外的含有水分子内核 的聚集体
形成反胶束体系的常用有机溶剂有: 异辛烷、正辛烷、正辛醇等； 常用的表面活性剂有: 丁二酸- 2 - 乙基已基酯磺酸钠(AOT) 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 三辛基甲基氯化铵( TOMAC)
3 讨论与展望
该技术用于提取分离酶和蛋白质等活性物质具有可行性和 优越性，在工业化生产方面有巨大的应用潜力。
但由于反胶束技术在食品科学上研究的起步较晚，仍存在 一些问题: (1) 表面活性剂对反应底物和产品存在着污染； (2) 缺乏合适的满足食品工业需要的天然安全反胶束体系
随着新型天然安全反胶束体系的开发和工业生产规模所需 基础数据的积累，反胶束萃取技术则可在油脂水解、植物 蛋白和油脂的分离、发酵滤液的提取上实现工业化生产， 将会引起特别是食品工业产生深刻而广泛的变革
反胶束萃取技术的应用
姓 名：田 雪 玲 学 号：S1210286 专 业：制药工程学
传统的分离方法 ( 如溶剂萃取技术 ) 在抗生素等物质 的生产中广泛应用，并显示出优良的分离性能，但 在基因工程和细胞工程方面，它难以提取和分离蛋 白质。其主要原因有两个： 1.被分离对象(蛋白质等)在40~500C不稳定，开始 变性，绝大多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋 白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质的变性； 2.萃取剂问题—蛋白质分子表面带有许多电荷，普 通的离子缔合型萃取剂很难有效果。 反胶束萃取法就是在解决上述两问题的基础上发展 起来的一种新型分离技术。
反胶束萃取
从反胶束萃取蛋白质的机理出发选用有从反胶束萃取蛋白质的机理出发选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶束内表面利于增强蛋白质表面电荷与反胶束内表面电荷间的静电作用和增加反胶束大小的表电荷间的静电作用和增加反胶束大小的表面活性剂除此以外还应考虑形成反胶面活性剂除此以外还应考虑形成反胶束及使反胶束变大束及使反胶束变大由于蛋白质的进入由于蛋白质的进入所所需的能量的大小反胶束内表面的电荷密需的能量的大小反胶束内表面的电荷密度等因素这些都会对萃取产生影响度等因素这些都会对萃取产生影响目前研究中常用的目前研究中常用的aotaot反胶束体系和其反胶束体系和其他体系有许多不足如不能用于分子量他体系有许多不足如不能用于分子量较大的蛋白质的萃取和往往在两相界面较大的蛋白质的萃取和往往在两相界面上形成不溶性的膜状物等等为克服这上形成不溶性的膜状物等等为克服这些不足些不足可通过在单一表面活性剂中加入可通过在单一表面活性剂中加入具有亲和作用的生物表面活性剂或另一具有亲和作用的生物表面活性剂或另一种非离子型表面活性剂的方法来改善萃种非离子型表面活性剂的方法来改善萃取性能
中自发形成的纳米尺度的一种聚集体. 反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。
表面活性剂
是构成反胶团的必要条件
反胶束萃取的优点： 成本低，溶剂可反复使用 萃取率和反萃取率高 解决蛋白质变性、降解的问题. 从完整细胞中提取蛋白质和酶
具有工业开发前景的蛋白质分离技术
表面活性剂（阳、阴、非）
离子型表面活性剂所形成的反胶束的表面带有 电荷：
b.反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱 了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反 胶束变小，从而使蛋白质不能进入其中；
c.离子强度增加时，增大了离子向反胶束 内“被盐析出来；
d.盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用， 可以改变溶解性能，盐的浓度越高，其影 响就越大。
中自发形成的纳米尺度的一种聚集体. 反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。
表面活性剂
是构成反胶团的必要条件
反胶束萃取的优点： 成本低，溶剂可反复使用 萃取率和反萃取率高 解决蛋白质变性、降解的问题. 从完整细胞中提取蛋白质和酶
具有工业开发前景的蛋白质分离技术
表面活性剂（阳、阴、非）
离子型表面活性剂所形成的反胶束的表面带有 电荷：
b.反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱 了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反 胶束变小，从而使蛋白质不能进入其中；
c.离子强度增加时，增大了离子向反胶束 内“被盐析出来；
d.盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用， 可以改变溶解性能，盐的浓度越高，其影 响就越大。
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• 离子强度
离子强度过小时，表面活性剂与溶剂相无法形成反 胶束，而形成了稳定的乳液，使其无法用于蛋白质 萃取。 离子强度增大时，它会： 1. 使反胶束内的双电层变薄，减弱蛋白质与反胶束内 表面间的静电引力，从而减小蛋白质溶解度。 2. 减弱表面活性剂之间的斥力，使胶束变小，不利于 蛋白质的溶解进入。 3. 增大了离子向反胶束内的迁移，并取代蛋白质，使 蛋白质从反胶束中析出。
蛋白质的反胶束萃取
Outline
蛋白质概述
蛋白质的常见分离方法
蛋白质反胶束萃取的原理 蛋白质反胶束萃取的应用举例 蛋白质的选择性萃取
蛋白质
化学分析试剂
化工用催化剂 …… 蛋白质
蛋白质分离上的常见问题
1 2 3 4 对温度、溶剂等敏感，易变性失活 原料中目标蛋白成分浓度小 杂质含量高，成分复杂 种类繁多，批量的特异性分离比较困难
有机相 萃取，实质上是蛋白质在 水相和反胶束内微水相间 的分配过程
水相
反胶束萃取的驱动力
静电相互作用 空间相互作用 疏水性相互作用
• 表面活性剂种类和浓度
影响反胶束萃取的因素
表面活性剂的种类： 1. 阳离子表面活性剂对表富集负电荷的蛋白质有较大分配比。 2. 阴离子表面活性剂对表富集正电荷的蛋白质有较大分配比。 表面活性剂的浓度： 1. 表面活性剂浓度增大，有利于形成更多的反胶束，可以加 速蛋白质的萃取。 2. 通过调节水率 w0，即胶束内水和表面活性剂的比，可调 节反胶束的大小。反胶束体积越大，其对大分子蛋白质的 分配比越大。
水相
反胶束分离蛋白质举例
选择性反胶束萃取
向反胶束体系加入亲和配体后，可显著增强反胶束萃 取的选择性。 如对与刀豆球蛋白A的萃取，通过向反胶束中添加生 物表面活性剂octyl β-D-glycopyran（表面活性剂总量 的2-20%），作为参比的核糖核苷酸酶不受影响，而 刀豆球蛋白A与配体发生作用使其萃取效率显著提高。 对于抗生物素蛋白的反胶束萃取，同样可以通过加入 一些亲和配体，如带生物素标记的表面活性剂，使得 抗生物素蛋白更容易地进入胶束。 ……
1 2 3
可用于大批量分离纯化
可进行连续操作 分离成本低
问题
蛋白质在传统有Biblioteka 萃取剂中溶解度低且易变性蛋白质反胶束萃取
反胶束萃取 Reversed micellar extraction： 源于20世纪70年代，本质上是一种液-液萃取，利用表面活性剂 在有机相中形成反胶团，从而在有机相中形成分散的微水环境， 使难溶于有机相或在有机相中发生生物活性变性的生物物质溶于 其中的萃取技术。
• pH
pH会影响蛋白质的表面电荷及其分布，当pH<pI 时，蛋白质表面带正电荷，此时需用阴离子表面 活性剂制备反胶束进行萃取；反之，当pH>pI时， 蛋白质表面带负电荷，需用阳离子表面活性剂制 备胶束进行萃取。 pH-pI的大小，可以反映蛋白质所带电荷的多少， 一般来说pH与pI的差值越大，越有利于蛋白质萃 取。对于一些大分子蛋白质，只有在大的pH-pI 下才有可能分离。
常见的分离方法
膜过滤 凝胶过滤 大小 抗蛋白酶 亲和色谱 金属离子 树脂 特殊性质 特异性结合 金属螯合力 溶解度 条件沉淀 蛋白质 形状 荷电性 等电点 密度 疏水性 疏水作用 色谱 离子交换 树脂 等电沉淀 梯度离心 分子筛
萃取
利用物质在互不相溶的两相之间分配特性不同而得以分离纯 化的技术
优势
• 温度
升高温度会增加蛋白质在有机相中的溶解度，促进其的反 胶束萃取。但温度过高同时也会造成蛋白质变性等问题。
反萃取
有机相 蛋白质通过反胶束萃取后，进入 有机相的反胶束内。经过分离操 作，除去水相中的杂质等。
反萃取
萃取
再通过调节体系的pH、离子强 度等，使得被萃取的蛋白质从反 胶束中释放出来，从来完成蛋白 质的分离提纯过程。