生物药物分析与检验氨基酸、多肽和蛋白质类药品检验全解
氨基酸、多肽及蛋白质类药物分析方法
氨基酸、多肽及蛋白质类药物分析方法1. 引言氨基酸、多肽及蛋白质类药物是一类重要的生物大分子，广泛应用于医学、生物学和药物研发领域。
分析方法的研发和优化对于确保药物的质量和安全性至关重要。
本文将介绍氨基酸、多肽及蛋白质类药物分析方法的原理、常用技术和应用。
2. 氨基酸分析方法2.1 色谱法色谱法是最常用的氨基酸分析方法之一。
其中，离子交换色谱法（Ion-exchange chromatography）和高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography, HPLC）是最常用的技术。
离子交换色谱法基于氨基酸的电荷性质，通过固定相上的阴离子交换树脂将氨基酸分离。
而HPLC则利用溶液中氨基酸的亲水性质，通过不同流动相的梯度洗脱将氨基酸分离。
2.2 光谱法光谱法基于氨基酸的吸光特性，常用的有紫外-可见光谱法（UV-Vis spectroscopy）和红外光谱法（Infrared spectroscopy, IR）。
紫外-可见光谱法利用氨基酸在特定波长下的吸光度差异进行分析，而红外光谱法则通过氨基酸吸收、发射或散射红外光的特性进行定性和定量分析。
3. 多肽分析方法3.1 质谱法质谱法是多肽分析的主要方法之一。
质谱法利用质谱仪对多肽进行分析，可以进行结构鉴定、定性和定量分析。
常用的质谱方法包括基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS）和液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS）。
3.2 磁共振波谱法磁共振波谱法（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）提供了多肽的结构信息。
通过分析多肽所产生的NMR信号，可以揭示多肽的空间构象和相互作用等重要信息。
氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验.
一氨基酸类药品检验
氨基酸类药物由于其结构上有羧基和氨， 故在进行含量测定时常用下列几种分析方 法。
**1、酸碱滴定法
谷氨酸(glutamic acid)、门冬氨酸(aspartic acid)和赖氨酸(lysine)等氨基酸，其分子结 构中均有羧基，故对其原料药一般采用氢 氧化钠滴定液滴定。
**4、碘量法或溴量法
示例一盐酸半胱氨酸水合物( cysteine hydrochloride hydras)的测定 因其分子结构中含有-SH基，可用碘量法测定。 例二 ，胱氨酸( L-cystine)的测定 因其分子结构中含有-S-S-基，可用溴量法测 定。
5、HPLC或氨基酸自动分析仪
根据蛋白质的性质和结构选用不同 的测定方法。
1、定氮法 2、电泳法 3、生物检定法P183
四常用的酶类药物
常用的酶类药物有胰酶( pancretin)、胃蛋 白酶(pepsin)、尿激酶(urokinase)、糜蛋白 酶( chymotrysin)、弹性酶(elastase)等。
**2、非水溶液滴定法
甘氨酸(glycine)、丝氨酸(serine)、缬氨酸(valine)、亮 氨酸(leucine)、精氨酸(arinine)、丙氨酸(alanine)和色氨 酸(tryptophen)等氨基酸，因其分子结构含有氨基，故对 其原料药，中国药典和卫生部以及地方药品标准一般采用 在非水溶剂中高氯酸滴定液测定含量。 **根据酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能 接受质子的物质为碱。弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强， 而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此本来在水溶液中 不能滴定的弱碱或弱酸，如果选择适当的溶剂使其强度增 加，则可以顺利滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中呈现 中性，假如在冰醋酸中就显示出碱性，因此可以用高氯酸 进行滴定。
《生物药物分析与检验》课程教学大纲
《生物药物分析与检验》课程教学大纲一、课程性质本课程是生物工程专业本科学生的专业课，也是一门专业拓展课，在教学计划中占有重要的地位，本课程主要学习药物结构与药效的关系，药物的理化性质、鉴别方法、合成方法等，为后续课程如药剂学、药用分析化学等的学习打下基础，是全面掌握药学领域各学科知识的重要桥梁。
本课程需先修无机化学、有机化学、生物化学等课程。
二、教学目的通过生物药物分析与检验课程的教学，使学生掌握生物药物特有的一些分析思路和分析手段，能够设计生物药物的标准规格，培养学生独立思考工作的能力。
同时培养学生强烈的药物质量观念以及生物药物分析的基本知识和技能。
学习本门课程后，要求学生不仅能够熟练掌握普通生物药物分析的方法、而且能够独立设计药物质量标准、建立质量分析方法及方法学评价。
三、教材教参教材：《生物药物分析》，何华，化学工业出版社（第一版），2001年。
教参：《生物药物分析》，曾经泽，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，2000年；《生物药物分析》，白秀峰，中国医药科技出版社，1999年。
四、教学方式本课程以课堂讲授为主、自学和讨论为辅的方式组织教学，内容采用多媒体辅助手段。
五、教学内容及时数根据生物工程专业人才培养方案，本课程共1学分，总的教学时数为18学时，其中讲授18学时。
具体如下：1. 生物药物分析学概述 (1.5学时，其中讲授1.5学时)基本内容：药物分析的性质、任务、药品质量标准的内容、生物药品的分类和科学管理、生物药品分析检验的基本程序和检验内容、药物代谢与药物动力学中的分析方法。
重点：生物药物分析的性质、概念、应用范围、工作方法及有关内容。
难点：药物代谢与药物动力学中的分析方法。
新知识点：药品质量标准的内容。
2. 生物药物分析信息的获取（自学）3. 药物分析方法的选择、建立和认证（1.5学时，其中讲授1.5学时）基本内容：分析质量控制、标准、标准物质等概念、质量控制图、实验室内外部的质量控制、准确度、精密度、线性范围等参数的概念、考察方法。
生化药物分析及生物检定技术
一、平皿法
4．药品的预处理 (2) 固体、半固体或黏稠液供试品 ③ 不溶于水的膜剂供试品 取100cm2，剪碎， 加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液100mL(必 要时可增加稀释剂)，浸泡，振摇，作为供试液。 ④ 肠溶胶囊(片)供试品 称取供试品10g，置 含pH6.8无菌磷酸盐缓冲液100mL的锥形瓶内， 于45℃水浴中，保湿，振摇，使溶解作为供试液。
一、平皿法
o 5．细菌总数计数 o (7) 结果报告 菌数报告：选择菌落数在30～300
之间的稀释级平板计数，以该稀释级的平均平板菌落数 乘稀释倍数作为报告菌数；若邻近的2个稀释级平均平 板菌落数均在30～300之间，计算级间比值，当比值 ≤2时，以2级菌落数的平均值为报告菌落数，比值大于 2但不超过5时，按低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为 报告菌数。当比值大于5时，或高稀释级的菌落数大于 或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应重新验证； 各稀释级平均菌落数均不足30时，以最低稀释级平均 菌落数乘稀释倍数为报告菌数；如各稀释级平板均无菌 落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，以小于 1乘以最低稀释倍数的值为报告菌数。
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及
其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检
查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控
制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度 10 000级下的局部洁净度100级的单向流 空气区域内进行，其全过程必须严格遵守无 菌操作，防止再污染。
二、检查方法
药品微生物限度检查采用活菌计数，
三、生化药物分析进展 总体向理化/仪器分析发展 如：GC、HPLC、UV、TR、质谱、磁共振、 超离技术、放射免疫、酶试剂、酶电极检 测等。 另，应用细胞培养，对生化药的活力 和效价检测。 单克隆体免疫分析技术及基因分析技 术，提高检测限量和灵敏度。
生物药物分析与检验 氨基酸、多肽和蛋白质类药品检验
内，在规定时间内观察家兔体温升高的情况，以判定 供试品中所含热原的限度是否符合规定。
第一节 氨基酸类药品检验
三、氨基酸含量测定 1、茚三酮法 • 茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。 • 当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧
4、旋光性 除甘氨酸外，所有的天然氨基酸都有旋光性，且每种 氨基酸的比旋度不同，因此，可以用比旋度作为氨基 酸药物的鉴别指标。
第一节 氨基酸类药品检验
二、氨基酸特殊杂质及安全性检查 1、特殊杂质检查 • 氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类
的氨基酸。 • 用薄层色谱法进行限量检查：将样品配成一定浓度的
COOH
OH
+ H-C-NH2
OH
O
R
O
OH
O
+ NH3 + CO2 + R C
H
O
O
O
OH
HO
+ NH3 +
H
HO
O
O
O
O
NC
H
O
O
+ H2O
第一节 氨基酸类药品检验
2、光谱鉴别法 （1）紫外吸收光谱法 在20
种天然氨基酸中，只有酪 氨酸、色氨酸和苯丙氨酸 在紫外区有最大吸收。
• 酪氨酸的max＝275nm • 苯丙氨酸的max＝257nm • 色氨酸的max＝280nm
第一节 氨基酸类药品检验
• 这三种氨基酸可以通过紫外 吸收光谱加以鉴别。
• 精密称取酪氨酸、色氨酸、 苯丙氢酸各适量。
第九章 氨基酸、多肽与蛋白质类药物的分析2
0. 063m o l/L磷酸盐 缓冲溶液-异丙醇(97： 3)流速0.6ml/min
流动相
色谱条件 与系统适 用性试验
214nm
紫外检测器
对照溶液：取人生长激 素单体与二聚体混合物 对照品，用0. 025m o l/L磷酸盐缓冲液 （pH7.0）制成 1.0mg/ml
测定法：
• 供试品溶液：1.0mg/ml（ 0. 025m o l/L磷酸盐缓冲 液（pH7.0）溶） • 对照品溶液: 1.0mg/ml（ 0. 025m o l/L磷酸盐缓冲 液（pH7.0）溶） • 供试品溶液与对照溶液各进样20l ，分别注入液 相色谱仪，外标法以峰面积计算。 • 先用紫外-可见法测定计算总蛋白质含量，每1mg 蛋白质中含重组人生长激素的量应不少于0.91mg.
• (七)其他方法
• 质谱法、核磁共振法、红外光谱法等
三、 检查
• （一）多肽类药物 • 一般检查：包括酸度、水分、无机盐、有机物 、溶液的颜色或澄清度、澄明度、重金属、无 菌、热原、致敏、异常毒性等。 • 特殊杂质检查：多肽合成步骤较多，杂质复杂 ，包括缺失肽、断裂肽、插入肽、未脱保护肽 等，多肽脱酰胺、氧化、还原、水解、二硫键 错配、β-消除等降解产物杂质，二聚体和多聚 体等，消旋化、非对映异构体等光学杂质。
含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生 同样反应
肽键的反应，肽键越多颜色越深，粉红，紫
红，蓝紫
受蛋白质特异性影响小
蛋白质定量测定 测定蛋白质水解程度
（3）福林－酚反应（Lowry）
• 包括两步反应：
• （1）在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋 白质－铜络合物； • （2）此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原 ，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜 色深浅与蛋白含量成正相关。 • 在650nm比色测定的灵敏度比双缩脲法高 100倍。该法适于微量蛋白的测定。
生物药物质量检测技术蛋白质药物的分析1
蛋白质的紫外吸收光谱
蛋白质在远紫外光 区 （ 200-230nm ） 有 较 大 的 吸 收 ， 在 280nm 有 一特征吸收峰，可利用 这一特性对蛋白质进行 定性定量鉴定。
蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A218c0m - 0.76A216cm0
测定范围：0.1～0.5mg/ml
第二节 氨基酸类药物的分析
在0.5～3.0mg/100ml范围，浓度与 吸收度差值呈良好性关系。
31
（七）、导数分光光度法
选定导数光谱波长范围为322～270nm，按导数分 光光度法测定色氨酸、酪氨酸的一阶，二阶和三阶 导数光谱。
在三阶导数光谱中色氨酸在287、284、280nm有 三个导数光谱峰，而酪氨酸在零线上，选定三阶导 数分光光度法。
弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在 碱性溶剂中酸性显得更强。
适合成品测定，测定范围是几十毫克。
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非水溶液滴定法
直接滴定法：适用于能溶于冰醋酸的氨基 酸。丙氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、 苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸等。
回滴法：适用于不能溶于冰醋酸而能溶于 高氯酸的氨基酸。赖氨酸、丝氨酸、半胱 氨酸等。
3
一、氨基酸的性质
1.两性解离和等电点
R
CH NH3+ COOH
+ OH+ H+
R
CH NH3+ COO
(pK´1)
pH< pI
净电荷为正
pH = pI
净电荷=0
+ OH+ H+ (pK´2)
R CH NH2 COO
pH > pI
净电荷为负
当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负
氨基酸、多肽及蛋白质类药物
氨基酸药物 三、典型氨基酸药物
单一氨基酸药物
用于肝脏疾病的氨基酸 用于消化道疾病氨基酸 用于脑病的氨基酸
氨基酸药物 三、典型氨基酸药物
单一氨基酸药物
用左于旋肝多脏巴疾片病的氨基酸 用成于份消：化左道旋疾多病巴氨基酸 功能主治：用于帕金森病及帕金森综合征。 用于脑病的氨基酸
基本知识 一、蛋白质基本知识
动物
植物
微生物
生命 物质基础
人体
基本知识 一、蛋白质基本知识
蛋白质 功能
生物催化 结构功能 运动收缩 运输功能 代谢调节 保护防御
其他功能
基本知识
定氮法
一、蛋白质基本知识
多数蛋白质含氮量相对 固定，约为16%，这是 蛋白质的一个重要特点。 因为氮元素容易通过凯 氏定氮法进行测定，故 蛋白质的含量可以由氮 的含量乘以6.25 （100/16）计算得到。
基本知识 三、多肽基本知识
多肽是α－氨基酸以肽键连
多 肽
接在一起而形成的化合物， 它也是蛋白质水解的中间产 物。
肽与蛋白质
02
氨基酸类药物
氨基酸药物 一、氨基酸药物分类
治疗消化道疾病 治疗肝病 治疗脑及神经系统疾病 用于肿瘤治疗 其他氨基酸药物
氨基酸药物 二、氨基酸药物生产
水解法
以毛发、血粉及废蚕丝等为原料，通过酸、碱或 蛋白水解酶水解成氨基酸混合物，经分离纯化获 得各种药用氨基酸的方法称为水解法。 分离、精制和结晶 胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸等
氨基酸药物 二、氨基酸药物生产
水解法 发酵法 化学合成法 酶合成法
酶合成法是以化学合成法配 制基质，利用酶促反应（即 酶的水解、裂解、合成作用） 直接制备各种氨基酸。 特别是固定化酶和固定细胞 等技术的迅速发展，解决了 酶合成法中较为突出的缺点， 从而促进了在生产实际中的 应用。
氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验
1
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5
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剩余碘量法
在供试品中先加入一定量、过量的碘滴定液，待I2与测定组分反应完全后，再用硫代硫酸钠滴定液滴定剩余的碘，根据与药物作用的碘的量来计算药物含量的方法。
2、滴定碘法(间接碘量法) 电位比EӨI2/I—高的氧化性物质，可在一定的条件下，用碘离子来还原，产生相当量的碘，然后用Na2S2O3标准溶液来滴定析出的I2，这种方法叫做间接碘量法或称为滴定碘法。例如K2Cr2O7在酸性镕液中与过量的KI作用，析出的I2用Na2S2O3标准溶液滴定。 Cr2O72-+6I-+14H+＝2Cr3++3I2+7H2O I2+2S2O32—＝2I-+S4O62— 利用这一方法可以测定很多氧化性物质,如ClO3-、ClO-、CrO42-、IO3-、BrO3-、SbO43-、MnO4-、MnO2 、AsO43-、NO3-、NO2-、Cu2+、H2O2等等，以及能与CrO42-生成沉淀的阳离子，如Pb2+、Ba2+等，所以滴定碘法的应用范围相当广泛。
肝素的效价是以每毫克肝素制剂(60℃2mmHg柱真空干燥3小时)所相当的单位数来表示。1U为24h内在冷处阻止1ml猫血凝结所需的最低肝素量。在制药工业的发展过程中，随着制药工艺的提高，药物的纯度也逐年提高，其生物效价亦随之愈来愈高。该药研制初期的生物效价，每1.0mg效价相当于125U,1977版中国药典规定肝素钠每1.0mg效价不得少于140U，而1995版药典则定为每1.0mg效价不得少于150U，2005年为不少于156U，2010年版改为不得少于170U。
01
某些生化药物，其药物中含有一些杂质，不可能是纯品。故不能以重量单位准确表示其含量，只能依靠生物检定的方法与标准品进行比较来测定药物的效价剂量。因此，采用特定的“单位”——“U”来计量。产生相同效应药品的剂量比较时，所需剂量越小，药物的效价就越高，反之效价就低。
氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验
1、碘滴定法(也称直接碘量法)
电位比EӨI2/I—低的还原性物质，可以直接用I2的 标准溶液滴定的并不多，只限于较强的还原剂，如：
S2-、SO32-、Sn2+、S2O32医-、学ppAt sO32-、SbO33-等。
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剩余碘量法
在供试品中先加入一定量、过量的碘滴定液， 待I2与测定组分反应完全后，再用硫代硫酸 钠滴定液滴定剩余的碘，根据与药物作用的 碘的量来计算药物含量的方法。
此外，加入过量的KI，可以加快反应的速度和 提高反应的完全程度。
2.反应时溶液的温度不能高，一般在室温下进行。 因度的分升。解高保。温存度Na增2S大2OI23的溶挥液发时性，，室降温低升淀高粉，指加示速剂Na的2S灵2O敏3
3.析出碘的反应最好在带塞的碘量瓶中进行，滴
定切勿剧烈摇动。
医学ppt
医学ppt
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非水溶液滴定法
非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行滴定的方法。 主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸 盐或有机酸盐，以及有机酸碱金属盐类药物的含量。 也用于测定某些有机弱酸的含量。
非水溶剂的种类 (1) 酸性溶剂 有机弱碱在酸性溶剂中可显著地增强其相对碱
度，最常用的酸性溶剂为冰醋酸。 (2) 碱性溶剂 有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强其相对酸
I2十2S2O32—＝2I—+S4O62—
本法可测定矿石中0.5%以上的铜。
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2.钡盐中钡的测定
能 涤将后B，a在2用+H沉A稀淀c-H为NCaBAla溶cC缓r解O冲4，。溶加沉液淀入中经过，过量C滤rKO、I42，洗—
医学ppt
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2、滴定碘法(间接碘量法)
电位比EӨI2/I—高的氧化性物质，可在一定的条件 下，用碘离子来还原，产生相当量的碘，然后用 Na2S2O3标准溶液来滴定析出的I2，这种方法叫做间 接碘量法或称为滴定碘法。例如K2Cr2O7在酸性镕液 中与过量的KI作用，析出的I2用Na2S2O3标准溶液滴 定。
氨基酸、多肽及蛋白质类药物分析方法 (2)
氨基酸、多肽及蛋白质类药物分析方法
氨基酸、多肽和蛋白质类药物的分析方法通常涵盖以下几
个方面：
1. 色谱分析方法：氨基酸、多肽和蛋白质类药物的分析常
常使用色谱技术，如高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）。
对于氨基酸和小肽的分析，常采用反相或离子交
换柱进行分离，并使用紫外或荧光检测器进行检测。
对于
大肽和蛋白质的分析，常采用尺寸排阻色谱（SEC）或离子交换色谱（IEC）进行分离，同时结合质谱进行定性与定量分析。
2. 质谱分析方法：质谱是氨基酸、多肽和蛋白质类药物研
究中常用的分析技术之一。
常用的质谱技术包括质谱成像（MSI）、质谱测定（MS）、质谱显微镜（MSM）等。
3. 免疫分析方法：免疫分析方法常用于蛋白质的定量分析，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫层析等。
免疫分析方
法依赖于特异性抗体与目标蛋白结合形成复合物，通过测定复合物的信号强度或荧光强度来定量。
4. 生化分析方法：利用酶促反应对氨基酸、多肽和蛋白质进行定量分析的方法，如酶标记法、比色法、发光法等。
5. 其他分析方法：还有一些特殊的分析方法，如核磁共振（NMR）、电泳等，也可以用于氨基酸、多肽和蛋白质类药物的分析研究。
需要根据具体的药物、样品和分析目的选择合适的分析方法，并结合这些方法的优势和特点进行分析。
最新生物药物分析与检验知识分析
生物药物分析与检验知识分析摘要：本次课程主要讲生物药物分析与检验常用的方法，杂质与安全检查，氨基酸、多肽和蛋白质类药物的分析与检验，酶类药物的分析与检验，脂类药物的分析与检验，核酸类药物的分析与检验，糖类药物的分析与检验，基因工程药物质量控制，生物药物的现代分析方法与检验技术。
关键词：发展前景分析检验方法安全应用生物药物分析与检验在将来相当长的时间内也仍是研究开发的主要方面，但随着现代生物技术的研究与应用日趋成熟，生物技术制药领域将发挥越来越重要的作用。
其发展趋势主要表现在：⑴应用基因工程技术，制取天然来源少和过去难以获得的生物活性物质；⑵应用蛋白质工程技术研制新型蛋白质类药物；⑶大分子物质活性片段的制取和化学修饰；⑷发展大分子药物的新剂型。
生物药物分析与检验的基本任务和作用是：使学生掌握生物药物分析与检验的基本理论知识和生物药物基本分析检验方法，培养学生重视生物药物质量的观念，从而不断提高分析问题和解决问题的能力。
它的内容主要包括生物药物分析与检验常用的方法，杂质与安全检查，氨基酸、多肽和蛋白质类药物的分析与检验，酶类药物的分析与检验，脂类药物的分析与检验，核酸类药物的分析与检验，糖类药物的分析与检验，基因工程药物质量控制，生物药物的现代分析方法与检验技术。
生物药物广泛用作医疗用品，特别是在传染病的预防和某些疑难杂症的诊断和治疗上起着其他药物所不能代替的独特作用。
随着预防医学和保健医学的发展，生物药物正日益渗入到人民生活的各个领域，大大扩展了其应用范围。
（1）、治疗药物肿瘤、爱滋病、心脑血管疾病等。
（2）、预防药物传染性强的疾病，疫苗、菌苗、类毒素。
（3）、诊断药物速度快、灵敏度高、特异性强。
免疫诊断、酶诊断、放射性诊断、基因诊断试剂。
（4）、其它生化试剂、保健品、化妆品、食品、医用材料。
生物药物是指利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、生物化学等学科的原理与方法制得的天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物。
13(1) 氨基酸、多肽、蛋白质类药物
甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT）
胰高血糖素 胰解痉多肽
胃泌素、胆囊收缩素－促胰酶素（CCKPZ）、肠泌素、肠血管 活性肽（VIP）、 抑胃素（GIP）、缓激肽、P物质
胸腺激素
胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子
多肽类药物分类：
多肽类细胞生长 表皮生长因子（EGF），转移因子（TF），
调节因子
心钠素（ANP）等。
（二）治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物 主要是甘，谷，组及其衍生物。保护胃
粘膜，防止溃疡，促进胃液分泌，治疗消 化不良，食欲不振
（三）治疗肝病的氨基酸及其衍生物 首选精氨酸，其次为谷氨酸，天冬氨
酸，蛋氨酸等，主要是加强鸟氨酸循环， 解氨毒；蛋氨酸为甲基供体，促磷脂酰 胆碱合成，治肝炎
（四）治疗脑神经系统疾病的氨基酸及其衍生物
L－谷氨酸钙镁：维持神经肌肉正常兴奋 γ－酪氨酸：调节神经传递 色氨酸 5－HT：调节高级神经活动 酪氨酸亚硫酸盐：用于中枢神经疾患
（五）用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物 主要是核酸合成中的抗代谢物 偶氮丝氨酸：抗谷氨酸酰胺用于白血病 氯苯丙氨酸：抑制5-HT合成，用于癌瘤
综合症 磷乙天冬氨酸：抑制嘧啶合成，用于黑色
2.双缩脲法 原理:碱性溶液中,蛋白质的肽键与Cu2+络合生成紫红色化合
物. 测定范围：因波长而异540nm：1-10mg/ml；330nm：
0.2－2 mg/ml；310nm：0.1－1 mg/ml 3．Folin-酚试剂法 在双缩脲基础上再加上“酚试剂”，大大增加灵敏度。 原理： Cu2+和蛋白质复合物中的酪，色残基还原了Folin试
第二节 多肽与蛋白质药物
掌握多肽及蛋白质药物的特点和生产方法 熟悉胰岛素的基本性质和制造工艺 熟悉多肽及蛋白质药物的检测和用途
生物学生物药物分析
优点： 1、对样品的吸附作用小，电渗作用
小 2、可以通过调整聚丙烯酰胺的浓度
来调整空隙大小，筛选特定分子量 的物质 3、对热稳定，凝胶透明，电泳结果 易于观察 缺点：神经毒
1、仪器装置：垂直电泳 2、试剂: 缓冲液
聚丙烯酰胺 染色液：考马斯亮蓝 脱色液：乙醇、冰醋酸
3、操作法： 1）制胶 2）电泳 3）染色和脱色 4）观察 定量检测：扫描区带面积
6、多肽和蛋白质类 7、核酸及其降解物和衍生物 8、糖类 9、生物技术药物类 10、生物制品类
（二）按生物药物的用途分类
1、治疗药物 2、预防药物 3、诊断药物 4、用作其它生物医药用品
四、生物药物的性质
五、生物药物的特点
1、相对分子质量的测定 2、生物活性检查 3、安全性检查 4、效价测定 5、生化法确证结构
（1）按照敏感材料分类：
酶、微生物、免疫、细胞器、组织 传感器
（2）按照信号转换器分类：
电化学、半导体、测光型、测热型、 测声型生物传感器
4、生物传感器的特点
（1）具有分子识别元件，不需要样品 的预处理。
（2）体积小，可以实现连续监测。
（3）响应快、样品用量少，且敏感材 料是固定化的，可以反复多次使用。
定效价或生物活性的方法。 1）药物的效价测定 2）微量生理活性物质的测定 3）某些有害杂质的限度检查
生物药物分析信息的获取 一、常用参考书 二、各国药典 三、常用期刊 四、数据库资源
第二章 酶分析法在生物药物分析中 的应用
一、以酶为分析对象，通过底物或者产 物浓度的改变来测定生物样品中所含的 酶量或者酶活力的测定，称为酶分析法
缺点：（1）孔径的大小导致高分子 量的底物反应受阻（2）使小分子量 的酶漏出
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氨基酸类药品检验
4、定氮法 • 精氨酸和天冬酰胺的原料及其制剂可以采用定氮法测 定含量。 • 将被测药物置于凯式烧瓶中，加浓硫酸、硫酸盐及适 量的催化剂，加热进行有机物的破坏，其中所含的氮 完全转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵，硫酸铵与强 碱反应，放出氨，将其蒸出，吸收于定量酸溶液，酸 碱滴定法滴定，从而计算出氮的含量并换算成被测药 物的含量。
10 mL 25mg 加水定容至 混合待测液 1mL 分别2.5mg 加水定容至 各种对照液
第一节
氨基酸类药品检验
（ 3 ）点样、展开和显色 吸取混合液和对照液各 3μL ，分别点于同一薄层板上。 • 以正丁醇 -水 - 异丁酸-醋酸（ 50︰ 50︰ 5 ︰7）之上层 作展开剂，进行单向三次展开，展开约15cm，每次必 须待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开。 • 喷以显色剂（吲哚醌 1g ，溶于 100mL 无水乙醇和 10mL 冰醋酸中）置100℃干燥5～10min至显色完全为止。
mL无水乙醇， 2.5mL水 5g微晶纤维素样品20 拌成糊状
待用
均匀涂板
溶剂挥发完毕后
105C ,1.5h
第一节
氨基酸类药品检验
（ 2 ）十一种氨基酸混合液（色、蛋、亮、异亮、甘、 赖、苏、缬、苯丙、组、精）与对照液的制备。
第一节
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2、安全性检查 • 影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要 为热原的含量。 • 中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。 • 采用家兔法，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体 内，在规定时间内观察家兔体温升高的情况，以判定 供试品中所含热原的限度是否符合规定。
第一节
第二节 品检验
多肽因子类和蛋白质类药
③检测或鉴定 NC膜借助非共价键吸附蛋白质，经转移 后蛋白质条带就固定在NC膜上，完全保留凝胶中的蛋 白谱，可直接用考马斯亮蓝、氨基黑10B等染色。 • 如果利用蛋白质生物活性，或用蛋白质生物探针来检 测，就要先用1％～3％的牛血清蛋白或血红蛋白，或 非离子去垢剂（0.3％吐温-20）等处理NC纸，以封闭 NC纸上未吸附蛋白质区域，使其不再能吸附蛋白质。 • 使用非离子去垢剂比较经济，但有可能把NC纸上的某 些蛋白质洗掉，同时还要将NC纸反复洗涤以去除变性 剂，
基本内容
第一节 第二节 第三节 氨基酸类药品检验 多肽因子类和蛋白质类药品检验 几种氨基酸、多肽和蛋白质药物的质量分析
第一节氨基酸类药品检验Fra bibliotek• 氨基酸是治疗蛋白质代谢紊乱、蛋白质缺损所引起的 一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值 的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。 • 目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创 制了一些新的生化药物。 • 如甲基酪氨酸治疗嗜铬细胞瘤 • 氧苯丙氨酸用于类癌瘤综合征 • 偶氮丝氨酸治疗白血病 • 乙酰羟脯氨酸用于治疗类风湿关节炎
第一节
氨基酸类药品检验
2、酸碱滴定法 • 谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸 • 赖氨酸（lysine）片中赖氨酸的测定 • 取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相 当于赖氨酸 0.15g ）置烧杯中，加水 25mL ，滴加氢氧 化钠滴定液（ 0.1mol/L ），用酸度计调节至 pH 值为 7.0，加入预先调节至pH值9.0的甲醛溶液15mL，搅匀 ，再用氢氧化钠滴定液（ 0.1mol/L ）滴定至 pH 值为 9.0，并持续30s。 • 按加入甲醛液后所耗用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L） 体积计算，每毫升氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当 于9.132mg的C6H14N2O2·HCl。
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茚三酮反应：茚三酮在酸性溶液中与α-氨基酸共热 ，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色物 质。 mL水 mL茚三酮T .S . 3 min 5mg样品 5 1 加热
蓝紫色溶液
O OH OH O
O OH H O HO
第二节 品检验
多肽因子类和蛋白质类药
②转移电泳 将湿醋酸纤维素（NC）薄膜紧贴凝胶，凝 胶与薄膜之间不能有气泡，否则在气泡所在部位的条 带将不能转移，在NC膜和凝胶的另一侧放上两层湿滤 纸，也不能有气泡，再在两边贴上海绵，最后用塑料 网框架夹紧，插入电泳槽，根据凝胶中样品所带电荷 的性质，决定有NC膜的一边是靠近正极还是靠近负极 一侧。 • 电泳条件取决于凝胶类型、转移装置和蛋白质本身性 质等。一般采用低电压和低电流（2mA/cm2以内）。 • 缓冲液中一般含有20％的甲醇或乙醇，其作用主要是 保持凝胶的几何形状。
第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验
• 蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质，具 多种生理功能，是一大类非常重要的生化药物。 • 多肽因子类药物指分子量不算太大的，在体内含量极微 ，但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质。 • 其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细胞介 素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术生产 的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组乙肝疫 苗等。
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• 5、HPLC • 对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定，目前 较多地采用了高效液相色谱法（HPLC）。 • 因大多数氨基酸没有紫外吸收，不能用紫外检测器测 定。为改善被测物的检测特性，提高检测灵敏度，需 进行化学衍生化。 • 衍生方式包括柱后衍生法和柱前衍生法。 • 柱后衍生法是将样品经离子交换柱分离后进行衍生； 柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行HPLC分 离。
第二节 品检验
多肽因子类和蛋白质类药
2、蛋白质免疫印迹电泳法（转移电泳、western blot） • 原理：借助聚丙烯酰胺凝胶技术，将生物活性物质高 效分离，分离后的样品可以原位、定量驱动或吸印在 另一种固相载体（通常用醋酸纤维素薄膜，简称 NC膜 ）上，能保持原有的生物活性，可以进行各种生物检 测、免疫识别、扫描、积分和保存。
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三、氨基酸含量测定 1、茚三酮法 • 茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。 • 当茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧 化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成 还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分 子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色物，最大吸收值的波 长为570nm。 • 茚三酮反应为一切α-氨基酸所共有，反应灵敏，根 据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。 • 本法可允许的测定范围是0.5～50μg氨基酸。
一、氨基酸的定性鉴别 • 旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析 、气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。 1、化学鉴别法 • 氨基酸的鉴别最常用的方法是根据所有氨基酸均能与 茚三酮显蓝紫色。 • 采用茚三酮显色法，中国药典（2010年）二部对所收 载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。
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第二节 品检验
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2、等电点测定 • 等电点是蛋白质的物理化学常数，它表示蛋白质的带 电性质。 • 一般采用凝胶等电聚焦电泳技术测定等电点。 3、紫外吸收 • 不同的蛋白质分子都有其特定的紫外吸收，对于某种 蛋白质或多肽来说，它的最大吸收波长是固定的。 • 紫外吸收光谱是检查蛋白质的一个重要指标。
1：酪氨酸 2：色氨酸 3：苯丙氨酸。
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（ 2 ）红外吸收光谱图 氨基酸在红外区都有特性图谱 ，可以通过与标准氨基酸图谱比较作为氨基酸的鉴别 依据。 • 所得的吸收图谱各主要吸收峰波长和各吸收峰间的相 互强度关系均应与对照的图谱一致。
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3、薄层色谱鉴别法 • 在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基 酸。 （1）薄层板的制备
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• 氨基酸为白色晶状体，熔点很高，多在熔融时分解， 都能溶解在强酸强碱中，形成的盐多能溶于水。 • 氨基酸在等电点（pI）时溶解度最小，最稳定。 • 中性pI值在5～6.3左右。 • 酸性pI值在2.8～3.2左右。 • 碱性氨基酸的pI值在7.6～10.8左右。
第一节
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• 本层析系统中，由于分 离的程度与各种氨基酸 显出不同的颜色，可以 区别十一种氨基酸。 • 用茚三酮-硝酸钠试剂 亦能显出不同颜色的色 斑，且灵敏度较高。
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4、旋光性 除甘氨酸外，所有的天然氨基酸都有旋光性，且每 种氨基酸的比旋度不同，因此，可以用比旋度作为氨 基酸药物的鉴别指标。
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多肽因子类和蛋白质类药
（1）基本操作 分3个部分：聚丙烯酰胺凝胶电泳；转 移电泳（即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸 上）；检测或鉴定薄膜上的多肽条带。 ①聚丙烯酰胺凝胶电泳 先将待分离样品进行凝胶电泳 分离。 • 凝胶可用琼脂糖凝胶，也可用聚丙烯酰胺凝胶，可以 是均一的，也可用梯度凝胶，凝胶缓冲体系中可含有 各种变性剂，如SDS、LDS、尿素等，可进行单向或双 向电泳，也可用等电聚焦电泳。
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二、氨基酸特殊杂质及安全性检查 1、特殊杂质检查 • 氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类 的氨基酸。 • 用薄层色谱法进行限量检查：将样品配成一定浓度的 供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在 同一硅胶G薄板上，一般用正丁醇︰水︰冰醋酸（3︰ 1︰1）展开晾干后，喷茚三酮的丙酮溶液显色，规定 供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点， 以此限制其他氨基酸的含量。
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多肽因子类和蛋白质类药
一、多肽因子类药物的定性鉴别 • 基因重组多肽因子类药物的鉴别主要采用SDS-PAGE法 和免疫印迹法。 1、SDS-PAGE法 • 用SDS-PAGE鉴别生物样品必须是该品有极纯的标准对 照品，通过电泳结果的对比，确定所测样品是否与标 准品有相同的迁移率，从而鉴别该品。 • 缺点：必须有标准品；凝胶中多肽需保留生物活性， 或能够复性，或电泳前可将检测配基与待测多肽共价 交联。