逆体积排阻层析法测定层析介质的孔径分布
蛋白质纯化的一般原则及方法选择
随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。
但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。
相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。
纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。
这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。
在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。
本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。
1 蛋白纯化的一般原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。
粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。
精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。
选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。
仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。
试验四体积排除色谱SEC法测定聚合物的分子量及分子量分布
实验四体积排除色谱(SEC)法测定聚合物的分子量及分子量分布分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。
聚合物的性能与其分子量和分子量分布密切相关。
体积排除色谱( size exclusion chromatography , SEC)是液相色谱的一个分支，已成为测定聚合物分子量分布和结构的最有效手段。
其还可测定聚合物的支化度，共聚物及共混物的组成。
采用制备型的色谱仪，可将聚合物按分子量的大小分级，制备窄分布试样，供进一步分析和测定其结构。
该方法的优点是：快捷、简便、重视性好、进样量少、自动化程度高。
体积排除色谱在一段时期内常称为凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)、凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography ，GFC )、凝胶色谱。
从分离机理看，使用体积排除色谱较为确切。
一、实验目的：1．了解SEC 法测定高聚物分子量及分子量分布的原理；2．掌握Waters—510 型仪器的操作技术；3．掌握SEC 数据处理方法。
二、基本原理：体积排除色谱(SEC)分离机理认为在多孔载体(其孔径大小有一定的分布，并与待分离的聚合物分子尺寸可比拟的凝胶或多孔微球)充填的色谱柱里引入聚合物溶液，用溶剂淋洗，体系是处于扩散平衡的状态。
聚合物分子在柱内流动过程中，不同大小的分子向载体孔洞渗透的程度不同，大分子能渗透进去的孔洞数目比小分子少，有些孔洞即使大小分子都能渗透进去，但大分子能渗透的深度浅。
溶质分子的体积越小渗透进去的几率越大，随着溶剂流动，它在柱中保留的时间越长。
如果分子的尺寸超过载体孔的尺寸时，则完全不能渗透进孔里，只能随着溶剂从载体的粒间空隙中流过，最先淋出。
当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中保留的时间比大分子保留的时间要长，于是整个样品即按分子尺寸由大到小的顺序依次流出。
色谱柱总体积为V t,载体骨架体积为V g，载体中孔洞总体积为V i,载体粒间体积为V o，则V t= V g+ V°+ V iV0 和V i 之和构成柱内的空间。
9种层析分离纯化方法详解
9种层析分离纯化方法详解层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。
当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
按层析原理可将层析分为以下9种：1、亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
2、离子交换层析采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。
8反相层析
BioPharm
4.2 流动相的pH控制
流动相pH的改变会影响到溶质的解离状态、固定相表面残 留硅醇基和其它吸附基团的解离情况、以及添加至流动相 的可解离组分的离子平衡，因此pH值的改变会引起溶质选 择性和保留值的改变 酸性条件常用三氟乙酸（TFA）、七氟丁酸（HFBA）和正 磷酸调节pH，接近中性时常用乙酸铵或磷酸盐来调节pH ， 碱性条件用NaOH来调节控制
– n-辛基
– n-十八烷基 – n-丙基
– 二苯基等
3.1.3 配基与基质的偶联 用氯化三甲基硅烷或氯化三乙基硅烷封阻硅胶表面残留的 硅醇基 配基较大时，由于空间位阻效应，导致亲硅醇基效应存在
BioPharm
3.2 反相层析介质的性质
粒径
– RPC是与HPLC技术伴随发展的，有着高分辨率，反相介质的粒径一 般在5~30μm之间，小于常用的凝胶过滤介质和离子交换剂，有着 较高的柱效 – 分析型应用：< 15μm介质 – 制备型应用：> 15μm介质
BioPharm
反相层析流动相的溶剂洗脱强度变化范围大，使溶质保留 值的差别可以达到1-2个数量级，因此反相层析可分离的 溶质范围很宽，从极性较大的寡肽、小分子有机物到疏水 性较强的生物大分子 反相层析能够区分分子在疏水性质方面的细微差异而有效 地进行分离，具备高分辨率的特性
BioPharm
BioPharm
加样量对Rs的影响
BioPharm
柱长
反相介质粒径普遍较小，本身有着较高的柱效，一般所用 层析柱柱长较短
对于寡肽等生物小分子，适当增加柱长能够改善Rs
生物大分子在反相柱中的保留值对于流动相的微小变化十 分敏感，可以认为是由开/关机制控制，增加柱长不能明 显改善Rs
生物制药名词解释
1、药物Medicine(remedy)：用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质，有4 大类：预防药、治疗药、诊断药和康复保健药。
2、生物药物（biopharmaceutics）：是以生物体、生物组织或其成份为原料（包括组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢、排泄物）综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。
3、基因药物（gene medicine）：是以基因物质（RNA 或DNA 及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的DNA 片段、重组疫苗、反义药物和核酶等。
4液-液萃取：是指用一种溶剂将物质从另一种溶剂中提取出来的方法。
5萃取:料液与萃取剂接解后，料液中的溶质的萃取济转移的过程就叫萃取。
6、反义药物：是以人工合成的十至几十个反义寡核苷酸序列，它能与模板DNA 或mRNA 互补形成稳定的双链结构，抑制靶基因的转录和mRNA 翻译，从而达到抗肿瘤和抗病毒作用。
7、生物制品（biologics）：是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。
8、RNA 干涉（RNAi，RNA interference）：是指在生物体细胞内，dsRNA 引起同源mRNA 的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。
9、siRNA (small interfering RNA)：是一种小RNA 分子（~21-25 核苷酸），由Dicer （RNAase Ⅲ家族中对双链RNA 具有特异性的酶）加工而成。
siRNA是siRISC (RNA-induced silencing complex 由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA 进行识别和切割）的主要成员，激发与之互补的目标mRNA 的沉默。
10、酶工程（enzyme engineering）：是从应用目的出发，研究酶和应用酶的特异催化功能，并通过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术。
各类层析色谱分析技术完全讲解
二、层析法的特点
❖ 分离效率高：复杂混合物、有机同系物、异构体、手性异 构体。
❖ 灵敏度高：可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级 的物质量。
❖ 分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试 样的分析。
❖ 应用范围广
不足之处：被分离组分的定性较为困难。
层析应用范围
吸附介质的分类及其性质（一）
❖ 羟基磷灰石 特点：抗机械强度弱。 原理：溶质分子中的酸性基团与洗脱液中的磷酸根离子 对羟基磷灰石中的钙离子有竞争作用。 应用：分离有序和无序的生物大分子，如分离RNA和 DNA等。
❖
1941年，英国生物学家Martin和Synge 首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技 术的发展奠定了基础。
1944年出现纸层析。以后层析法不断发 展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层 层析、亲和层析、凝胶层析等。
层析法是利用混合物中各组分物理化学 性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分 子亲和力、分配系数等），使各组分在两相 （一相为固定的，称为固定相；另一相流过固 定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而 使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
层析分类法
按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法
固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
薄层层析法 纸层析法
将适当粘度的固定相均匀涂铺 在薄板上，点样后用流动相展 开，使各组份分离
用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
薄膜层析法
将适当的高分子有机吸附剂制 成薄膜，以类似纸层析方法进 行物质的分离
层析技术是一种分离技术，是混合物 最有效的分离、分析方法。
经典色谱（offline)
蛋白纯化办法大全及优缺点比较
蛋白纯化方法大全及优缺点比较1.?蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。
硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。
硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。
蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。
在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。
其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。
除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。
蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。
其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
2.缓冲液的更换?虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。
不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。
假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用予大规模纯化中。
新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。
也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。
体积排阻色谱 孔径
体积排阻色谱孔径
体积排阻色谱的孔径是指用于分离样品的色谱柱的孔径大小。
体积排阻色谱是基于样品分子在填充有固定相的色谱柱中流动的速度差异来进行分离的。
色谱柱的孔径大小会直接影响分离效果和分离时间。
孔径较大的色谱柱会有更高的通透性和较快的流速，分离效果会更好，但可能会出现分辨率较低的情况。
孔径较小的色谱柱会有较慢的流速和较高的分辨率，但可能会导致分离时间较长。
常见的体积排阻色谱柱的孔径范围一般为1.8 μm至10 μm，
常用的孔径包括2 μm、3 μm、5 μm和10 μm。
选择合适的孔
径大小需要考虑到分离目标、样品特性和分析要求等因素。
尺寸排阻色谱法原理
尺寸排阻色谱法原理体积排阻色谱法 (SEC) 是液相色谱的一种主要分离模式，近年来被广泛地应用在各个行业，是研究分子量及分子量分布测试、研究聚合物分子结构，揭示聚合物类样品物理性能的重要表针手段。
在聚合物类产品质量的控制、合成工艺的改进过程中发挥着积极作用。
今天就和大家一起看一看SEC的原理、实验条件选择、应用、常见问题及解决办法，我们一起分享学习。
定义排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液相色谱的一种。
分类1、凝胶过滤色谱法-GFC一般用于分离水溶性的大分子，凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
2、凝胶渗透色谱法-GPC主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
基本原理凝胶本身具有三维网状结构，大分子在通过这种网状结构上的孔隙时被排阻，小分子通过时被滞留。
分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现分子筛效应。
排阻色谱不适用范围1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离效果。
两种排阻色谱类型比较固定相与流动相流动相的选择1、必须能溶解样品，与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。
2、溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。
3、常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
固定相（凝胶）一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，含有大量液体(一般是水)，柔软而富于弹性。
分类：1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
2、按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。
8-4 液相色谱之体积排阻色谱
体积排阻色谱法
体积排阻色谱法的分离原理
SEC分离机理
SEC原理
SEC分离机理
固定相
无机填料（多孔硅胶或多孔玻璃）
优点：可以耐高温；机械性能稳定
缺点：表面具有吸附性，干扰SEC分离机理(硅烷化)有机填料（交联聚苯乙烯凝胶）【广泛使用】
优点：渗透性能好；柱效高
缺点：不宜长期高温条件使用
流动相
流动相的要求
•能完全溶解试样；但不与试样反应；
•不与填料有任何相互作用；
•黏度低；沸点比柱温高20-50摄氏度
•与检测器匹配，提高灵敏度。
SEC方法特点
•保留时间是分子尺寸的函数
•保留时间短，谱峰窄，容易检测
•柱子使用寿命长（固定相与组分作用力弱）
•不能分辨分子大小相近的化合物（相差10%以上）。
生物化学实验报告
生物化学实验报告姓名：专业：院系：学号：实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法一、实验原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。
凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同分子量的物质。
以下进一步来说明凝胶层析的原理。
将凝胶装载柱后，柱床总体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。
Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。
洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。
色谱分离技术凝胶筛分
缺点：
5
凝胶强度低，可耐受的压力通常低于0.2个大气压，
6
故流速低，通常的线速度小于20cm/h。因此，处理速度
7
较慢。但Superdex的最大耐受压力可达15个大气压，流
8
速也提高近10倍。
9
无机填料：
表面改性后的硅胶，主要是用有机物或聚合物对硅胶
颗粒进行处理，增加其亲水性并消除或抑制体积排阻以
Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生
物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
琼脂糖凝胶：
1
商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，
2
pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。
3
琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维
09
子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分
10
离的目的。
凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如 下要求： （1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任 何化学或物理相互作用； 蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、 分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液 的pH值和离子强度等物性无关。 （2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试 剂中保持稳定，使用寿命长； （3）具有一定的孔径分布范围； （4）机械强度高，允许较高的操作压力。
分离操作模式 洗脱展开：最常用 前沿（迎头）分析 顶替展开
用于大量制备
根据溶质和固定相间的作用机理
01
凝胶过滤
02
离子交换
03
反相色谱
04
疏水层析
05
亲和色谱
06
分配机理
排阻色谱法
一、分离原理排阻色谱法（SEC）亦称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法。
是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
排阻色谱的分离机理是立体排阻，样品组分与固定相之间不存在相互作用的现象。
色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。
凝胶的孔穴大小与被分离的试样大小相当。
仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出人。
对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排斥。
小个的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。
因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗出，它的洗脱体积（即保留时间）很小。
小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积卿保留时间）较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，这种按分子大小而分离的洗脱过程才告完成。
因为分子尺寸一般随分子量的增加而增大，所以根据分子量表达分子尺寸比较方便。
将因分子过大而不能部分地进入某一给走固定相孔内的最小的样品粒子的分子量，定义为该固定相的排阻极限。
如图13-10中A点所相应的相对分子质量（这里，相对分子质量相当于），凡是比A点相应的相对分子质量大的分子，均被排斥于所有的胶孔之外，因而它们将以一个单一的谱带C出现，在保留体积V0时一起被洗脱。
很明显，V0 是柱中凝胶颗粒之间的体积。
随固定相不同，排阻极限范围约在 400至60 X 106之间。
将能够完全进入固定格最小孔内的最大的样品粒子的相对分子质量定义为填料的渗透极限。
如图14-10中B点所相应的相对分子质量（这里相对分子质量为）。
凡是比B点相应的相对分子质量小的分子都可以完全渗入凝胶孔穴中。
同理这些化合物也将以一个单一谱带F在保留体积Vt被洗脱。
可以预料，相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将根据它们的分子尺寸，进入一部分孔隙，而不能进入另一部分孔隙，其结果使这些化合物按相对分子质量降低的次序被洗脱。
第三章 凝胶过滤层析
交联度
交联剂占单体和交联体总量的百分数 凝胶颗粒孔径大小与交联度有关
第二节 凝胶介质的分类和性质
1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl 2）琼脂糖凝胶 3）聚丙烯酰胺凝胶
（1）葡聚糖凝胶
① G类葡聚糖（Sephadex）
其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质 完全渗入凝胶内。
分级分离，将样品中一些分子量比较接近的物质分开。 策略是使在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地 深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最 后得到分离。
组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50(3*104 Da)，脱盐一般选用G25（1000-5000Da）。
柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。
洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。
Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ
计算法： Vt = 1/4 D2h
测量法： Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ 由于Ｖｇ 非常小，可忽略不计，因此： Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ Ｖ０可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液，如蓝 色葡聚糖-2000； Ｖi可用硫酸铵等无吸附力的小分子物质。
理论上，Vp(加入样品体积）＝Vs时就能分离两种
蛋白质
Vp<Vs时效果好。
（2）样品粘度的影响
五、 洗脱 洗脱液：能溶解被洗脱物质、不使其变性或 失活为原则。 一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、TrisHCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液。
有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。
影响流速的因素
（2） 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose（瑞典）
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识来源：易生物实验浏览次数：2755 网友评论0 条凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。
关键词：层析凝胶测定层析柱装填柱效测定分子筛层析排阻层析凝胶过滤层析一、实验目的和内容目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；2. 熟悉凝胶层析的一般过程；3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。
内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填；2. 凝胶柱柱效测定；3．凝胶再生的方法。
二、实验仪器和试剂1. 实验仪器层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管易生物仪器库：/yp/product-list-42.html易生物试剂库：/yp/product-list-43.html2. 实验材料和试剂Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）三、实验步骤清洗层析柱测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液（重复使用的填料，从此步开始）边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)始终保护凝胶上端有一段液体准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脱，记录t r(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)，计算单位高度的柱效（参考完成时间16：00）柱效计算公式：N = 5.54•［θr/( W 1/2)］2其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。
3-13-常见分离纯化技术原理
常见分离纯化技术原理---介绍离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、分配层析和电泳原理1、离子交换层析法⏹原理:根据离子间作用力的不同而将物质分离的方法⏹离子交换剂可解离出阴离子或阳离子，当待分离的溶液中含有阳离子时可以与阳离子交换剂的阳离子交换吸附在离子交换介质上，带电量不同的物质与离子交换剂的结合力不同，解离的条件不同，可通过改变条件，促使其解离和分部收集待分离物。
Sampleapplication and wash Elution Equilibration Regeneration-------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++anion exchanger bead ----------离子交换层析步骤和发生的变化2、凝胶过滤层析技术●概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。
●原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外,在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
⏹凝胶过滤法测定相对分子量◆蛋白质分子通过凝胶的洗脱体积取决于它的斯脱克半径；◆如果未知蛋白与理想的非水化球体有相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与球体相同的的斯脱克半径；◆因此，实验中只要测得标准蛋白的洗脱体积，再测得未知蛋白的洗脱体积就可以得到它的相对分子量。
3、疏水作用层析⏹非极性氨基酸残基组成的疏水区域可使蛋白质结合非极性分子，利用这种相互作用蛋白质可被吸附在基质上。
⏹在不带电荷的载体上偶联疏水基团而形成疏水吸附剂⏹利用载体和样品疏水基团间的相互作用使它们吸附在一起，然后改变层析条件，减弱疏水作用，使吸附的蛋白质从吸附剂上解吸下来。
凝胶过滤层析分子筛层析、排阻层析
2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯化
凝胶过滤层析分子筛层析、排阻层析
二、原理 ➢ 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用
具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离。
凝胶过滤层析分子筛层析、排阻层析
凝胶过滤层析分子筛层析、排阻层析
四、仪器的使用－核酸蛋白检测仪及 部分收集器的操作方法
凝胶过滤层析分子筛层析、排阻层析
核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法
1、在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪 三部份电路连接是否正确，插上电源插头。
2、接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示 灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量 程调在10mV档上。
6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当 样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪 给出所需样品吸收的图谱。
7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池 和尼龙管。
凝胶过滤层析分子筛层析、排阻层析
➢ 记录仪光吸收A读数 当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应 于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定 在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当 记 录 笔 指 示 在 记 录 纸 一 半 (50% 刻 度 ) 位 置 时 即 为 0.25A。
3、将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程 旋钮拔到100％T档。
4、按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录 仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量” 旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数 字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时 左右，待基线平直凝胶后过滤，层析分可子筛层加析、排样阻层析测试。
逆体积排阻层析法测定层析介质的孔径分布
逆体积排阻层析法测定层析介质的孔径分布沈醉;林东强;姚善泾【期刊名称】《化工学报》【年(卷),期】2010(061)004【摘要】针对层析介质的孔径分析,基于刚性球状分子进入柱状孔的假设,分别采用高斯正态分布和对数正态分布描述孔径分布,利用简化的单孔分配因子模型,建立了孔径分布函数和分配因子Kd的关联,通过体积排阻层析实验测定系列标准物的Kd,从而拟合得到孔径分布信息,建立了逆体积排阻层析法.以葡聚糖作为分子大小的标准物,测定了5种典型层析介质(SP Sepharose FAST FLOW、Q Sepharose FAST FLOW、Toyopearl DEAE-650M、Streamline DEAE和Sephadex G-150)的Kd,计算和比较了不同介质的孔径分布,分析了介质的可吸附孔表面积等结构参数,证实了逆体积排阻层析法分析层析介质孔径分布的可行性和实用性.【总页数】8页(P867-874)【作者】沈醉;林东强;姚善泾【作者单位】浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江,杭州,310027;浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江,杭州,310027;化学工程联合国家重点实验室(浙江大学),浙江,杭州,310027;浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江,杭州,310027【正文语种】中文【中图分类】TQ028.8【相关文献】1.用压汞法和氮吸附法测定孔径分布及比表面积 [J], 田英姿;陈克复2.孔径分布对多孔镍孔体积分形维数的影响 [J], 王学龙;胡锐;薛祥义;王一川;傅恒志3.孔径分布色谱法测定数据的计算机处理 [J], 苏国钧;肖鹏峰;禹懿4.低场核磁法测定凝胶过滤介质的孔径分布 [J], 王晓君;刘新利;李秀男;马光辉;苏志国5.泡点法测定微孔孔径分布的改进算法 [J], 丁祥金;张继周;宝志琴;丁传贤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
分子排阻层析
分子排阻层析
排阻层折，是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。
主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
也叫做分子排阻层析。
一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
｛ ［
∞
］｝
（ ） ２
对数正态分布模型 中狉 ｐ 和狊 ｐ 分别描述孔径和孔径 不 再 直 接 表 示 平 均 孔 半 径， 分 布 的 宽 度， 其 中狉 ｐ 平均孔半径可由式 狉 ＝
生物分离用层析介质多为亲水软胶 ， 难以用一 些常规的 孔 径 分 布 分 析 方 法 来 测 定 ， 如 气 体 吸 附
，
犛 狋 犪 狋 犲犓 犲 犪 犫 狅 狉 犪 狋 狅 狉 犺 犲 犿 犻 犮 犪 犾犈 狀 犻 狀 犲 犲 狉 犻 狀 犺 犲 犻 犪 狀 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 犪 狀 狕 犺 狅 狌３ １ ０ ０ ２ ７，犣 犺 犲 犻 犪 狀 犺 犻 狀 犪） 狔犔 狔狅 犳犆 犵 犵，犣 犼 犵犝 狔，犎 犵 犼 犵，犆
１ １２ １ ，犔 犛 犎 犈 犖犣 狌 犻 犐 犖犇 狅 狀 犻 犪 狀 犃 犗犛 犺 犪 狀 犻 狀 犵 狇 犵 ，犢 犼 犵
１ （ 犇 犲 犪 狉 狋 犿 犲 狀 狋 狅 犺 犲 犿 犻 犮 犪 犾犪 狀 犱犅 犻 狅 犾 狅 犻 犮 犪 犾犈 狀 犻 狀 犲 犲 狉 犻 狀 犺 犲 犻 犪 狀 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 犪 狀 狕 犺 狅 狌３ １ ０ ０ ２ ７，犣 犺 犲 犻 犪 狀 犺 犻 狀 犪； 狆 犳犆 犵 犵 犵，犣 犼 犵犝 狔，犎 犵 犼 犵，犆
１ （ 浙江大学化学工程与生物工程学系 ， 浙江 杭州 ３ １ ０ ０ ２ ７； ２
檭檭殐
：Ｔ 犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋 ｈ ｅｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄｏ ｆ ｉ ｎ ｖ ｅ ｒ ｓ ｅｓ ｉ ｚ ｅ ｅ ｘ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｒ ａ ｈ Ｉ Ｓ Ｅ Ｃ）ｗ ａ ｓｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｅ ｄｔ ｏｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍ ｉ ｎ ｅｔ ｈ ｅ ｇ ｐ ｙ（ （ ） Ｓ Ｄ ｏ ｆｐ ｏ ｒ ｏ ｕ ｓｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｒ ａ ｈ ｉ ｃｍ ｅ ｄ ｉ ａ ．Ｔ ｗ ｏｗ ｅ ｌ ｌ ｋ ｎ ｏ ｗ ｎｐ ｏ ｒ ｅｓ ｉ ｚ ｅｄ ｉ ｓ ｔ ｒ ｉ ｂ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｒ ｅｓ ｉ ｚ ｅｄ ｉ ｓ ｔ ｒ ｉ ｂ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｐ ｇ ｐ ｐ （ ，Ｇ ，ｗ Ｐ Ｓ Ｄ） ｍ ｏ ｄ ｅ ｌ ｓ ａ ｕ ｓ ｓ ｉ ａ ｎｄ ｉ ｓ ｔ ｒ ｉ ｂ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎａ ｎ ｄｌ ｏ ｎ ｏ ｒ ｍ ａ ｌｄ ｉ ｓ ｔ ｒ ｉ ｂ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｅ ｒ ｅｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ａ ｔ ｅ ｄｉ ｎｔ ｈ ｅｐ ｒ ｅ ｓ ｅ ｎ ｔ ｇ ｇ ｗ ｏ ｒ ｋ ．Ｔ ｈ ｅｍ ｏ ｓ ｔｕ ｓ ｅ ｄｌ ｏ ｃ ａ ｌｐ ａ ｒ ｔ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎｃ ｏ ｅ ｆ ｆ ｉ ｃ ｉ ｅ ｎ ｔｍ ｏ ｄ ｅ ｌｗ ａ ｓａ ｄ ｏ ｔ ｅ ｄｗ ｉ ｔ ｈｔ ｈ ｅａ ｓ ｓ ｕ ｍ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆｒ ｉ ｉ ｄｓ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ａ ｌ ｐ ｐ ｇ ｐ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｅ ｓｉ ｎｔ ｈ ｅｃ ｌ ｉ ｎ ｄ ｒ ｉ ｃ ａ ｌｐ ｏ ｒ ｅ ｓ ．Ｔ ｈ ｅ ｎｔ ｈ ｅｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｈ ｉ ｅ ｔ ｗ ｅ ｅ ｎＰ Ｓ Ｄａ ｎ ｄｔ ｈ ｅｔ ｈ ｅ ｏ ｒ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｌｄ ｉ ｓ ｔ ｒ ｉ ｂ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｙ ｐｂ ａ ｓｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｅ ｄ ．Ａ ｆ ｔ ｅ ｒｔ ｈ ｅｍ ｅ ａ ｓ ｕ ｒ ｅ ｍ ｅ ｎ ｔｏ ｆ犓ｄ ｗ ｉ ｔ ｈａｓ ｅ ｒ ｉ ｅ ｓｏ ｆｍ ｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ｅｓ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｒ ｄ ｓｂ ｉ ｚ ｅ ｃ ｏ ｅ ｆ ｆ ｉ ｃ ｉ ｅ ｎ ｔ犓ｄ ｗ ｙｓ ， ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆＰ Ｓ Ｄｃ ｏ ｕ ｌ ｄｂ ｅｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄｗ ｉ ｔ ｈｔ ｈ ｅｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆ ｃ ａ ｌ ｃ ｕ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ犓ｄ ｅ ｘ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｒ ａ ｈ ｇ ｐ ｙ ，Ｓ ｔ ｏｔ ｈ ｅｅ ｘ ｅ ｒ ｉ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｌｄ ａ ｔ ａ ． Ｉ ｎｔ ｈ ｅｐ ｒ ｅ ｓ ｅ ｎ ｔｗ ｏ ｒ ｋ，犓ｄ ｏ ｆｆ ｉ ｖ ｅｔ ｉ ｃ ａ ｌｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｒ ａ ｈ ｉ ｃｍ ｅ ｄ ｉ ａ ＰＳ ｅ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅ ｐ ｙ ｐ ｇ ｐ ｐ Ｆ Ａ Ｓ ＴＦ Ｌ ＯＷ，ＱＳ ｅ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ Ａ Ｓ ＴＦ Ｌ ＯＷ，Ｔ ｏ ｏ ｅ ａ ｒ ｌＤ Ｅ Ａ Ｅ ６ ５ ０ Ｍ，Ｓ ｔ ｒ ｅ ａ ｍ ｌ ｉ ｎ ｅＤ Ｅ Ａ Ｅａ ｎ ｄＳ ｅ ｈ ａ ｄ ｅ ｘＧ ｐ ｙ ｐ ｐ １ ５ ０，ｗ ｅ ｒ ｅｍ ｅ ａ ｓ ｕ ｒ ｅ ｄｂ ｓ ｉ ｎ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｎ ｓａ ｓｔ ｈ ｅｓ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｒ ｄ ｓ ．Ｔ ｈ ｅ ｎｔ ｈ ｅＰ Ｓ Ｄ ｓｏ ｆｆ ｉ ｖ ｅｍ ｅ ｄ ｉ ａｔ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄｗ ｅ ｒ ｅ ｙｕ ｇｄ ，ａ ｎ ｄｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍ ｉ ｎ ｅ ｄｂ ｈ ｅｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄｏ ｆ Ｉ Ｓ Ｅ Ｃ ．Ｔ ｈ ｅｍ ｏ ｄ ｅ ｌ ｃ ａ ｌ ｃ ｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｆ ｉ ｔ ｔ ｅ ｄｗ ｅ ｌ ｌｗ ｉ ｔ ｈｔ ｈ ｅｅ ｘ ｅ ｒ ｉ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｌｄ ａ ｔ ａ ｙｔ ｐ ， Ｐ Ｓ Ｄ ｓｏ ｆｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔｍ ｅ ｄ ｉ ａｗ ｅ ｒ ｅａ ｎ ａ ｌ ｚ ｅ ｄ ． Ｉ ｎａ ｄ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｒ ｅ ｓ ｕ ｒ ｆ ａ ｃ ｅ ａ ｒ ｅ ａｗ ａ ｓ ｃ ａ ｌ ｃ ｕ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｙ ｐ ａ ｎ ｄｄ ｉ ｓ ｃ ｕ ｓ ｓ ｅ ｄ ．Ｔ ｈ ｅｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓｄ ｅ ｍ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ｄｔ ｈ ａ ｔＩ Ｓ Ｅ Ｃｉ ｓａｆ ｅ ａ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄｔ ｏｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍ ｉ ｎ ｅｔ ｈ ｅＰ Ｓ Ｄｏ ｆｐ ｏ ｒ ｏ ｕ ｓ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｒ ａ ｈ ｉ ｃｍ ｅ ｄ ｉ ａ ． ｇ ｐ
１卷 第４期 第６ ０ １ ０年４月 ２
化 工 学 报 Ｉ Ｅ Ｓ Ｃ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ Ｃ
ｏ ｌ ． ６ １ Ｎ ｏ ． ４ Ｖ ｒ ｉ ｌ ０ １ ０ Ａ ２ ｐ
檭殐
檭檭檭檭檭檭殐
研究论文
逆体积排阻层析法测定层析介质的孔径分布
２ 沈 醉１ ， 林东强１， ， 姚善泾１
０ ０ ９－０ ９－２ ９ 收到初稿 ，２ ０ ０ ９－１ １－２ ３ 收到修改稿 。 ２ 联系 人 ： 姚 善 泾 。 第 一 作 者 ： 沈 醉 （ ， 男， 硕 士 研 １ ９ ８ ６—） 究生 。 基金项目 ： 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 （ ； ２ ０ ７ ７ ６ １ ２ ９，２ ０ ９ ７ ６ １ ５ ４） 新世纪优秀人才支持计划项目 。 ：２ 犲 犮 犲 犻 狏 犲 犱犱 犪 狋 犲 ０ ０ ９－０ ９－２ ９． 犚 犆 狅 狉 狉 犲 狊 狅 狀 犱 犻 狀 狆 犵 ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ ＠ｚ ｊ 犉 狅 狌 狀 犱 犪 狋 犻 狅 狀犻 狋 犲 犿：ｓ ｕ ｏ ｒ ｔ ｅ ｄｂ ｈ ｅＮ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌＮ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌＳ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｐ ｐ ｙｔ Ｆ ｏ ｕ ｎ ｄ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆＣ ｈ ｉ ｎ ａ（ ２ ０ ７ ７ ６ １ ２ ９，２ ０ ９ ７ ６ １ ５ ４）ａ ｎ ｄｔ ｈ ｅＰ ｒ ｏ ｒ ａ ｍｆ ｏ ｒ ｇ Ｎ ｅ ｗＣ ｅ ｎ ｔ ｕ ｒ ｘ ｃ ｅ ｌ ｌ ｅ ｎ ｔＴ ａ ｌ ｅ ｎ ｔ ｓ ｉ ｎＵ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ Ｎ Ｃ Ｅ Ｔ） ． ｙＥ ｙ（
］ ６ ７ 法 、 压汞 法 、 气 泡 法 、Ｘ 射 线 小 角 散 射 法 等 ［ 。
犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狆 狅 狉 犲 狊 犻 狕 犲犱 犻 狊 狋 狉 犻 犫 狌 狋 犻 狅 狀狅 犳狆 狅 狉 狅 狌 狊犿 犲 犱 犻 犪犫 狔 犻 狀 狏 犲 狉 狊 犲 狊 犻 狕 犲 犲 狓 犮 犾 狌 狊 犻 狅 狀犮 犺 狉 狅 犿 犪 狋 狅 狉 犪 犺 犵 狆 狔
∞
引 言
层析是生物大分子分离纯化的有效方法 ， 具有 多孔结构的层析介质是层析分离得以进行的必要条
］ １ ２ 件 ， 直接影响 了 分 离 的 效 果 ［ 。绝大多数天然或
差 ，犃 则是归一化常数 ， 为
在孔径很 狉） ｄ 狉。 ∫ 况 下 ， 高斯正态分布函数可 能会出现狉 为负数的情况 。 １ ０］ 对数正态分布模型 ［ 的表达式为
２ （ ／ ｎ 狉 狉 １ ｌ ｐ） ）＝ 犃ｅ 狉 ｘ ｐ－ 犳（ 狊 ２ 狉 ｐ
合成的多孔介质的孔隙具有不规则的几何形状以及 不均一的大小 ， 为了描述复杂的孔结构 ， 产生了许 多结 构 参 数， 其 中 孔 径 分 布 （ ｏ ｒ ｅｓ ｉ ｚ ｅｄ ｉ ｓ ｔ ｒ ｉ ｂ ｕ ｐ ，Ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｓ Ｄ） 能够表示孔 径 大 小 在 一 定 范 围 内 的 分 布密度 ， 是 对 不 同 孔 径 大 小 分 布 的 一 个 统 计 学 描
檭檭檭檭檭殐
２
化学工程联合国家重点实验室 （ 浙江大学 ） ， 浙江 杭州 ３ ） １ ０ ０ ２ ７
摘要 ： 针对层析介质的孔径分析 ， 基于刚性球状 分 子 进 入 柱 状 孔 的 假 设 ， 分 别 采 用 高 斯 正 态 分 布 和 对 数 正 态 分 布描述孔径分布 ， 利用简化的单孔分配因子模型 ， 建立了孔径分布函数和分配因子 犓ｄ 的关联 ， 通过 体 积 排 阻 层 析实验测定系列标准物的 犓ｄ， 从而拟合得到孔径分布信息 ， 建立了逆体 积 排 阻 层 析 法 。 以 葡 聚 糖 作 为 分 子 大 小 的标准 物 ， 测 定 了 ５ 种 典 型 层 析 介 质 （ Ｓ ＰＳ ｅ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ Ａ Ｓ ＴＦ Ｌ ＯＷ、 Ｑ Ｓ ｅ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ Ａ Ｓ ＴＦ Ｌ ＯＷ、 Ｔ ｏ ｏ ｅ ａ ｒ ｌ ｐ ｐ ｙ ｐ ） 的 犓ｄ， 计算和比较了不同介质的 孔 径 分 布 ， 分 析 了 介 质 的 Ｄ Ｅ Ａ Ｅ ６ ５ ０Ｍ、Ｓ ｔ ｒ ｅ ａ ｍ ｌ ｉ ｎ ｅＤ Ｅ Ａ Ｅ和Ｓ ｅ ｈ ａ ｄ ｅ ｘＧ １ ５ ０ ｐ 可吸附孔表面积等结构参数 ， 证实了逆体积排阻层析法分析层析介质孔径分布的可行性和实用性 。 关键词 ： 逆体积排阻层析 ； 层析介质 ； 孔径分布 ； 分配因子 中图分类号 ：ＴＱ０ ２ ８ ． ８ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：０ ）０ ４ ３ ８－１ １ ５ ７（ ２ ０ １ ０ ４－０ ８ ６ ７－０ ８