植物细胞培养
植物细胞培养
植物细胞培养
植物细胞培养是一种将植物细胞通过人工的方式在无菌条件下进行培养的方法。
它可以用来研究植物生长发育、植物组织和器官的形成、植物代谢产物的生产等。
植物细胞培养的步骤大致分为以下几个步骤：
1. 材料准备：准备需要培养的植物材料，如幼芽、种子、叶片等。
同时准备好无菌培养基、培养器皿和器械。
2. 表皮消毒：将植物材料表皮的细菌和真菌等杂质进行消毒处理，常用的方法有浸泡在含有消毒剂的溶液中，如酒精和次氯酸钠。
3. 组织分离：将消毒后的植物材料进行分离，常用的方法有切碎组织、分离细胞等。
4. 培养基制备：制备无菌的培养基，可以根据具体需求调整培养基的成分，常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。
5. 培养：将组织或细胞转移到无菌培养基上进行培养。
可以选择不同的培养条件，如光照条件、温度、激素的添加等。
6. 培养过程中的观察和记录：观察培养物的生长情况，记录细胞的增殖、分化和器官的形成等变化。
植物细胞培养可以应用于植物繁殖、基因转化、抗病性筛选、药物生产等方面。
同时，植物细胞培养也属于一种生物技术手段，可用于保护濒危物种、加速育种进程等。
植物细胞培养
班级：农学11-2
姓名：徐东阳
概念及发展
植物细胞培养的概念及发展 植物细胞培养的概念
植物细胞培养是指对有力的植物细胞或细胞小聚体 进行立体无菌培养，通过继续代培养使 细胞增殖， 从而获得大量细胞群体的一种技术。
方法
应用
植物细胞培养的发展
1.全能性 （植物学家Hanberlandt根据细胞理论预言。英国人Steward 和法国人Reinert，从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中产生了完整的植株， 对植物细胞的全能性给予了科学的证实．） 2.胚培养（E．hanning培养了萝卜的近成熟胚并发育成熟） 3.无毒植 株 （Morel和Martin通过茎尖分生组织培养获得大丽花的无毒植株。） 4.培养基 （B族维生素、生长素IAA、激动素、MS） 5.应用(从科学研究转入生产应用)
植物细胞悬浮培养
游离单细胞方法 培养基 悬浮细胞培养方法 生长测定 同步化处理
培养基
基本培养基：MS、B5、NT、TR、VR、SS、SCN、SLCC等
碳源：蔗糖、葡萄糖、果调节物质：NAA、IAA、2，4-D、6-BA等
悬浮培养方法
分批培养： 分批培养设计 分批培养细胞的增殖 连续培养： 封闭式连续培养 开放式连续培养（化学恒定、浊度恒定）
植物细胞培养的方法 植物细胞培养的概念及发展
植细胞培养按照不同的分类方法可分为以下几种 按对象： 单倍体培养 原生质体培养 按培养基： 固体培养 液体培养 按培养方式： 悬浮培养 固定化培养
植物细胞培养的方法
植细胞培养按照不同的分类方法可分为以下几种 按对象： 单倍体培养 原生质体培养 按培养基： 固体培养 液体培养 按培养方式： 悬浮培养 固定化培养
茎段优于叶片 帯叶优于不带叶 不同培养基 MS 幼叶 BS幼茎 氮源 硝酸跟含量高促进 铵根含量高抑制 前体饲养 添加抑制剂 添加诱导子 植物生长调节因子 生物反应器 其他（温度、光超声处理，气体组成）
植物细胞培养的基本过程和方法
植物细胞培养的基本过程和方法植物细胞培养是一种将植物细胞体外培养的技术，其主要目的是为了研究细胞的生理、生化过程以及植物的生长发育等方面的问题，也可以用于植物遗传改良、利用细胞培养生产植物品种等领域。
下面将对植物细胞培养的基本过程和方法进行详细介绍。
1.材料准备：选择合适的植物组织作为培养材料，如茎段、叶片、根尖等。
同时还需要准备一些基本的实验仪器和培养基成分。
2.细胞分离：将选取的植物组织进行表皮剥离、细胞壁酶解等操作，将细胞分离出来。
可以使用显微镜观察细胞的分离程度。
3.培养基配制：根据不同的培养目的和植物类型，调配适合的培养基。
培养基通常包括无机盐、有机物、维生素、激素等成分，用于提供细胞生长所需的养分。
4.细胞培养：将分离得到的细胞悬浮在培养基中，将其培养在恒温恒湿的培养箱中。
培养箱中的温度和光照条件可以根据植物的特性进行调节。
5.观察和保存：定期观察细胞的生长情况，包括细胞的形态、分裂情况等。
同时可以进行细胞生长速率、物质代谢等方面的研究。
对于需要保存的细胞，可以使用液氮冷冻或低温贮藏的方法保存。
1.组织培养：将植物组织培养在含有适当激素的培养基上，促使其分化和增殖。
常用的组织培养方法包括愈伤组织培养、种子发芽培养、胚培养等。
2.悬浮细胞培养：将植物细胞分散在培养基中形成悬浮细胞。
可以利用悬浮细胞进行物质代谢、遗传变异等研究。
3.离体培养：将完整的植物器官（如茎尖、叶片等）切分成适当大小的组织块，培养在含有激素的培养基上，使其分化为根、茎、叶等组织。
4.离体器官培养：将完整的植物器官（如拟南芥的花蕾、水稻的胚等）取出，培养在含有细胞分裂素和植物生长素的培养基中，经过适当的处理后，可以使其分化为新的植株。
5.基因转化：将外源基因导入植物细胞中，使其产生新的表型特征。
常用的基因转化方法包括农杆菌介导的转化、基因枪轰击法等。
总之，植物细胞培养是一种重要的实验手段和研究方法，通过培养和处理植物细胞，可以为植物生物学和生物技术研究提供重要的理论基础和实验依据。
3.植物细胞培养（植物组织培养）
3.植物细胞培养（植物组织培养）第三章植物细胞培养植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或⼩细胞团）进⾏培养，形成单细胞⽆性系或再⽣植株的技术。
Haberlandt（1902）⾸次尝试分离和培养植物叶⽚单细胞。
细胞培养的意义有利于进⾏细胞⽣理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。
进⾏细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微⽣物遗传技术⽤于⾼等植物以进⾏农作物的改良。
细胞培养的增殖速度快，适合⼤规模悬浮培养，⽣产⼀些特有的产物，如许多种植物的次⽣代谢产物，包括各种药材的有效成分等，⽤于医药业、酶⼯业及天然⾊素⼯业，这是植物产品⼯业化⽣产的新途径。
由于植物组织培养中细胞之间在遗传和⽣理⽣化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出⼀定的差异。
这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病⾍和抗逆性等⽅⾯。
所以由单细胞培养获得的单细胞⽆性繁殖系，并对不同的细胞进⾏研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。
细胞培养就是从⾼等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进⾏培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。
第⼀节植物细胞培养⼀. 单细胞培养(⼀)单细胞分离1.机械法2.酶解法3.从愈伤组织中分离(⼆)单细胞的培养⽅法1、平板培养（细胞的⽣长周期）2、看护培养3、微室培养 4. 条件化培养⼆. 细胞悬浮培养（⼀）悬浮培养的⽅法1、分批培养（细胞的⽣长周期）2、半连续培养3、连续培养——封闭型、开放型（化学、浊度恒定式）4、固定化培养（⼆）培养细胞的同步化1. 化学⽅法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法）2. 物理⽅法（分选、低温）（三）培养基振荡⼀、单细胞培养（⼀）单细胞的分离1.机械法: Ball(1965)⾸次由花⽣成熟叶⽚利⽤机械的⽅法使叶⾁细胞得到分离的技术。
⑴⼑⽚刮: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表⽪(露出叶⾁细胞) →⽤解剖⼑刮下细胞→单细胞悬浮培养⑵研磨离⼼法: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶⽚+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离⼼(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养研磨介质: 20µmol蔗糖+ 10µmol MgCl2 + 20µmol Tris-HCl (pH7.8)机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发⽣质壁分离。
植物细胞培养
分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所 培养的细胞使其分裂和生长； 将饲养细胞与靶细胞混合于液体培养基中. 有四种： 共同混合与琼脂糖培养基中 饲养层位于下层，靶细胞位于上层 一起培养与液体培养基中 双层滤纸植板培养：
看护培养：
Muir于1953年创立 用一块活跃生长的愈伤
组织来看护单细胞使之 持续分裂生长和增殖的 培养方法。这个愈伤组 织块称为看护愈伤组织 简便、成功率高 不能在显微镜下直接观 察
容易放大实现规模化；
三、植物细胞的培养基
培养基组成 无机盐 碳源 植物生长激素 有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基
酸混合物，对初级培养的早期生长阶段有利。 有机酸：丙酮酸等 复合物质:椰子汁 MS、 B5、N6
四、植物单细胞培养
单细胞制备方法 单细胞培养方法 悬浮细胞的同步化方法 细胞保存 植物细胞培养的意义与应用举例
B．按震荡与否分为
a．静置培养；b震荡培养（摇床、转 床悬浮培养）
C．是否加Leabharlann 他细胞培养：a．饲养层培养：将饲养细胞与靶细 胞混合于液体培养基中.
b．看护培养：将一块生长活跃的愈 伤组织（或组织）放入培养基中，再在 上放置一层滤纸，滤纸上加上靶细胞进 行培养。
饲养层培养法
看护培养
用一块活跃生长的愈伤组织 来看护单细胞使之持续分 裂生长和增殖的培养方法。
（四）细胞的保存
1.继代保存 常温，每1~2周换一次液体，植物和海藻多用此法 低温保存：5~10°C下培养，10天换一次培养液，对
于微生物可保存几个月，使用时要活化，防止水分蒸 发（用石蜡封口，或加液体石蜡。） 冰冻保存：-20°C保存，可保存一到两年，仍有活力。 如优良的植物细胞系、动物细胞也可保存在液氮或70°C的冰箱中，一般用5%、10%或15%的甘油及 10%的二甲基亚砜（DMSO）冻存或传代细胞。细胞 数量为2~6x106，用90%培养液+10%DMSO冻存 在2ml的安培瓶中。
第六章 植物细胞培养
平板培养为分离、筛选单细胞无 性系提供了一个有效方法
第五节 植物细胞大规模培养 生产次生代谢物质
Production of Secondary Metabolites by Large-scale Culture of Plant Cells
一、 植物次生代谢和次生代谢产物
（一）次生代谢和次生代谢产物 初生代谢：为维持植物正常的生长发育所 必须的代谢，如呼吸作用、光合作用、 蛋白质和氨基酸代谢、核酸和核苷酸代 谢、脂肪代谢、激素代谢等。初生代谢 过程中形成的各种产物称为初生代谢产 物。初生代谢产物不稳定，在体内容易 发生转化。
植物细胞全能性的证明
2. 筛选变异体：在生产中，人们总是希望 获得具有某些抗性的品种，如抗病、抗 虫、抗盐碱、抗铝、抗除草剂等。通常 的方法是在大量的植株中进行选择。这 种方法不仅工作量大，而且效率低。细 胞培养技术为突变体的筛选提供了快速 有效的方法。在一个培养皿中，一次可 以筛选20万个细胞。 将具有抗性的细胞 挑选出来以后，进行培养、再生，即可 获得抗性植株。
匀桨
过滤
培养
外植体
振荡
液体培养 愈伤组织
振荡
培养上清液
继代培养
液体培养
愈伤组织(callus)是一群无明显组织分化、 分裂能力强的细胞。它是植物受到创伤后或 在植物激素的诱导下形成的。
分化(differentiation)——形态、结构和功 能相同的细胞变成形态、结构和功能互 不同的细胞的过程，如分生组织细胞转 变成薄壁组织、维管组织、厚壁组织等。 脱分化(dedifferentiation)——已分化、成 熟的细胞（一般不再分裂）重新恢复分 裂能力的过程。外植体形成愈伤组织的 过程就是脱分化的过程。 再分化 (redifferentiation)——愈伤组织形 成其它组织或器官的过程
植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方 法。
（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经 计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密 封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
（四）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生：
1.愈伤组织的诱导： (1)取水稻种子，人工去皮后用70％酒精表面消毒2 分钟，再用2．5％次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次，按每瓶3粒接入 附加2mg／L 2，4—D、3％蔗糖、0．3％酵母提取 物的Ms固体培养基中，25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后，将从胚部长出的愈伤组织切割，并转移 到新鲜培养基上继代培养，每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖．
•植物细胞培养及原生质体培养
植物细胞培养的概念及意义
7 CELL SUSPENSION CULTURE
7.1 植物细胞培养的概念及意义 7.1.1 定义
植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易 分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散 成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得 大量的细胞群体的一种技术。小规模的悬浮培养可在培养 瓶中进行。大规模的需要利用生物反应器生产。
7 植CE物LL细SU胞S培PE养NSION CULTURE
7.1 植物细胞培养的概念及意义 7.1.2 植物细胞培养的方法
根据培养对象，植物细胞培养主要有单细胞培养、单倍体培养、原 生质体培养等。根据培养系统可分为悬浮培养、液体培养、固体培养、 固定化培养等。
固体培养
琼脂培养
固定化培养
细胞培养
液体培养
产品成分 长春花碱
阿吗灵 奎宁
致热素 毛地黄
用途 治疗白血病 循环系统障碍药
治疗疟疾 杀虫剂
心脏病药
年销售额（亿美元） 18-20（美国） 5-25（全世界） 5-10（美国） 20（全世界） 20-55（美国）
三 七
中 草 药地
黄
红 花
石 刁 柏
7 植CE物LL细SU胞S培PE养NSION CULTURE
植物细胞培养是在植物组织培养技术基础之上发展起来 的。理论基础是植物细胞的单个细胞内存在生命体的全部 能力（全能性）。
7 CELL SUSPENSION CULTURE
What is a bioreactor?
It is a culture vessel generally of a large volume which has provisions for aeration, stirring to achieve medium and cell mixing , contamination control, replacement of used medium and or cells
植物细胞培养概论
植物细胞培养：
❖ 植物细胞的获取； ❖ 植物细胞的优化改良； ❖ 培养办法； ❖ 生产此生代谢产物； ❖ 应用于生物转化、农业方面
植物组织培养
概念：在无菌条件下，将离体的植物器官、组 织、细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配制 的培养基上，同时予以适宜的培养条件，诱发 产生愈伤组织或长成新的完整植株的过程。
第八章 植物细胞培养概论
植物组织和动物细胞培养的比较
比较项目
植物组织培养
动物细胞培养
原理
细胞的全能性Hale Waihona Puke 细胞增殖培养基性质
固体培养基
液体培养基
培养基特有成分 培养成果
蔗糖、植物 激素
植株
葡萄糖、动物 血清
细胞株、细胞系
培养目的
快速繁殖、哺育 获得细胞或
无病毒植株等
细胞产物
❖ 植物细胞的全能性:
每种植物的每个细胞都包含母株的整套 遗传信息，都能够发育成完整的植株。
❖ 培养对象不同 ❖ 愈伤组织培养既属于组织培养又属于细
胞培养，它既是一种组织又是一种脱分化的 细胞，且含有再分化的能力；既能够用于次 级代谢物的生产和生物转化，又能够再生为 植株。
植物组织与细胞培养的比较
❖ 培养目的不同
❖ 组织培养：获得所需的植物组织和再生成植 株，还能够运用发状根培养生产某些次级代 谢物。
理论根据：植物细胞的全能性
愈伤组织：在人工培养基上，由外植体的表 面形成的一团不定形的排列疏松的薄壁细胞。
植物细胞培养
概念：在离体条件下将易分散的植物组织 或植物的愈伤组织置于液体培养基中， 将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通 过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞 群体的办法。
植物组织与细胞培养的比较
植物细胞培养
植物细胞培养的方法与分类
植物细胞培养的方法
• 固体培养：细胞在固体培养基上进行培养 • 液体培养：细胞在液体培养基中进行培养 • 悬浮培养：细胞在无细胞壁的液体培养基中进行培养
植物细胞培养的分类
04
植物细胞培养实例分析与实践
植物细胞培养在园艺植物中的应用实例
花卉生产
• 通过细胞培养生产花卉，如玫瑰、菊花等 • 提高花卉产量和品质
观赏植物
• 通过细胞培养生产观赏植物，如多肉植物、盆景植物等 • 保护珍稀观赏植物，防止物种灭绝
植物细胞培养在农作物中的应用实例
粮食作物
• 通过细胞培养生产粮食作物，如水稻、小麦等 • 提高粮食产量和品质
• 有性细胞培养：培养生殖细胞，如花粉、胚珠等 • 无性细胞培养：培养体细胞，如叶片、茎段等
植物细胞培养的条件与优化
植物细胞培养的条件
• 无菌：防止微生物污染 • 营养：提供必需的营养物质，如氮素、磷素等 • 恒温：维持适宜的温度，如25℃ • 恒湿：维持适宜的湿度，如80%
植物细胞培养的优化
• 选择合适的培养基：根据细胞类型和培养目的选择合适的培养基 • 调节光照：提供合适的光照强度和光周期 • 添加植物生长调节剂：如生长素、细胞分裂素等
DOCS
谢谢观看
THANK YOU FOR WATCHING
解决方案
• 采用无菌技术，防止微生物污染 • 优化培养条件，提高细胞生长和产物合成的效率
植物细胞培养技术的发展趋势与展望
技术创新
• 研究和应用新型培养技术，如基因编辑、细胞信号调控等 • 推动植物细胞培养技术的创新发展
植物细胞培养
（2）气升式反应器
●在反应器环流管底部有一个空气喷嘴，空 气以高速度（250-300m/S）喷入环流管， 气泡被分散于环流管液体中 ●借助于环流管内气-液混合物密度与反应主 体密度之差，气-液混合物连续循环流动。 ●培养罐液体中的溶解氧会不断减少，通过 环流管又达到饱和。
（一）植物单细胞的获得
1、从外植体直接分离单细胞
●外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过
一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬 浮液。 ●悬浮液中所含的完整细胞数量很少， 分散性较好，可以看作是游离的单细胞悬 浮液。
2、从愈伤组织分离单细胞
1）经过愈伤组织诱导获得脱分化愈伤组织 的薄壁细胞团。 2）将细胞团转移到液体培养基中，进行振 荡培养，使细胞团分散成为单细胞，然后用 适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去细胞团和 残渣，得到单细胞悬浮液。
2．低温处理法
1) 将收集得到的细胞或小细胞团，在4℃左右 的低温条件下处理1～3d，植物细胞在低温 下全部停止生长繁殖， 2)然后再悬浮于新鲜的液体培养基中，在25℃ 培养，于是细胞几乎同时开始生长繁殖，处 于同步状态。
3．限制营养处理法
1)将细胞或小细胞团悬浮在营养物质受到限 制的培养液中培养几天，由于营养缺乏， 细胞的生长繁殖受到限制，几乎所有的细 胞都停止生长； 2)然后再将细胞转移到新鲜的培养液中，进 行悬浮培养，则细胞几乎同步地开始生长繁 殖。
1. 平板培养法
●概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定
的细胞密度，接种在1mm的薄层固体培养基 上进行培养，称之为平板培养。
●由Bergman1960年首创的，其目的是
为了获得单细胞系 ，并研究其生理 生化和遗传上的规律。
特
• 自一个单细胞。 •
植物细胞培养
植物细胞培养植物细胞培养是一项重要的生物学研究技术，通过将植物细胞放入适宜的培养基中，提供适宜的养分和生长条件，使其在无菌条件下进行繁殖和生长。
这项技术在植物生物技术和植物育种研究中有着广泛的应用，可以用于植物组织培养、植物再生、基因工程、植物病毒研究等方面。
接下来，我将详细介绍植物细胞培养的原理、步骤、方法及其应用。
一、植物细胞培养的原理植物细胞培养的原理是利用植物细胞的分裂和再生能力，在培养基上形成功能完整的植株。
培养基中提供的养分和生长因子可以满足植物细胞的营养需求，而适宜的温度和光照条件则有利于细胞分裂和再生。
在无菌条件下进行培养，可以避免外界的微生物污染和干扰，保证细胞培养的成功率。
二、植物细胞培养的步骤植物细胞培养主要包括材料准备、杀菌、建立无菌培养条件、组织处理、细胞培养和植株再生等步骤。
1.材料准备：选择适宜的植物材料，如幼苗的茎尖、子叶、胚乳、花药等作为外植体。
同时准备培养基、培养器具和培养条件所需的试剂和设备。
2.杀菌：将外植体浸泡在含有杀菌剂的溶液中，进行表面消毒，以去除外植体表面的细菌和真菌。
3.建立无菌培养条件：在无菌操作台上进行操作，使用无菌培养器具和培养基，保持操作环境的无菌状态。
4.组织处理：将外植体切割成适当的大小，要求每个组织片段都含有足够的细胞和组织分化能力。
5.细胞培养：将组织片段放置在含有适宜濃度的培养基中，提供适宜的养分和生长因子，调节温度和光照条件，使细胞进一步分裂和分化。
6.植株再生：当细胞分裂和分化达到一定程度时，可以通过调节培养基的成分和添加适宜的激素来诱导细胞形成胚乳、芽和愈伤组织，最终形成功能完整的植株。
三、植物细胞培养的方法植物细胞培养可以通过不同的方法来实现，包括愈伤组织培养、悬浮细胞培养、胚愈伤组织培养等。
1.愈伤组织培养：将外植体的某些部位培养在含有适宜生长因子的培养基上，刺激组织的分裂和分化，形成愈伤组织，进而形成植株。
2.悬浮细胞培养：将植物细胞分散在液体培养基中，进行无瓶培养。
第六章植物细胞培养
一、前期准备
材料自来水冲洗——75%的乙醇擦洗——将材料切成 小块（带形成层）——接种到MS+2,4-D 2mg/L+CH
500mg/L+琼脂0.8%,pH5.8的培养基上——得愈伤组织—
—扩大繁殖。 2、单细胞悬浮液的制备
愈伤组织转移到液体培养基中——4r/min转床培养
10d——140m×140m的细胞筛过筛——使细胞密度达到10 个/ml左右——得单细胞悬浮液。
1、连续培养的特点 （1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应， 不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。 （2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。细胞增 殖速度快。 （3）适于大规模工业化生产。
2、连续培养的种类 封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。 开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。
第三节
植物细胞生长和活力的测定
一、悬浮培养中细胞生长的测定 1、细胞计数：把1份培养物加入到2份8%三氯化铬溶液中， 在70℃下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震 荡10分钟，用血球计数板进行细胞计数。
2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放 入1个15ml刻度离心管中，在2000g下离心5min， 得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积（PCV）：以每ml培养液中细胞总体 积的ml数表示。 3、细胞鲜重和干重：
酶解法的优缺点： • 优点：可以得到高纯度的叶肉细胞；产量高；细胞 不易破 • 缺点：细胞受到酶伤害；细胞受到质壁分离影响； 对于，大麦、小麦和玉米很难通过酶解法使细胞分 离（叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间形 成一种互锁结构）
机械法和酶解法比较
1. 2. 3. 4. 细胞不受到酶的伤害； 不用质壁分离； 细胞产量低； 细胞易破。
植物细胞培养
植物细胞培养第七章植物细胞培养第⼀节植物细胞培养的理论基础⼀、植物细胞的全能性植物细胞全能性是指植物体的每⼀个活细胞具有发育成完整个体的潜在能⼒。
即植物体的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息，在适当的内、外条件下，⼀个细胞有可能形成⼀完整的新个体。
在植物的⽣长发育中，从⼀个受精卵可产⽣具有完整形态和结构机能的植株，这是全能性，是该受精卵具有该物种全部遗传信息的表现。
同样，植物的体细胞，是从合⼦有丝分裂产⽣的，也应具有像合⼦⼀样的全能性。
但在完整植株上，某部分的体细胞只表现特定的形态和局部的功能，这是由于它们受到具体器官或组织所在环境的束缚，但细胞内固有的遗传信息并没有丧失。
因此，在植物组织培养中，被培养的细胞、组织或器官，由于离开了整体，再加上切伤的作⽤以及培养基中激素等的影响，就可能表现全能性，⽣长发育成完整植株。
⼆、植物细胞的脱分化和再分化通常，我们⽤于组织培养的植物材料，太多是已分化了的细胞。
⼀个已分化有⼀定机构和功能的细胞要表现它的全能性，⾸先要经过⼀个脱分化的过程。
脱分化：是指已分化的细胞在⼀定因素作⽤下，失去它原由的机构和功能，重新恢复分裂机能。
细胞脱分化的机构通常形成愈伤组织。
从外植体形成愈伤组织的过程，根据其群体细胞的形态、细胞分裂、⽣长活动和RNA相对含量的变动，⼤致可分起动期、分裂期和形成期三个时期。
起动期是细胞准备进⾏分裂时期。
外植体在外观上虽看不到多⼤变化，但代谢活化了，细胞内的合成代谢迅速进⾏，RNA 的含量急剧上升，细胞核和核仁增⼤。
分裂期的主要特征是被起动细胞进⾏活跃的细胞分裂。
这时细胞⽐起动的细胞更⼩，核和核仁更⼤，RNA含量继续上升，出现⾼峰。
由于细胞分裂活跃，细胞数⽬迅速增加，开始出现可见的愈伤组织球体。
紧接着进⼊形成期。
愈伤组织进⼀步发展，细胞分裂较多地出现在愈伤组织的周缘近表⾯部分，且分割⾯较多的是平周的，因此构成⼀个所谓愈伤形成层，相应的内部细胞显著增⼤，核和核仁变⼩，RNA含量急剧下降。
植物细胞培养技术
植物细胞培养技术植物细胞培养技术是一种以植物体中的组织和细胞作为外植体，在理想的环境条件下进行体外培养和繁殖的方法。
通过这种技术，可以实现植物的无性繁殖、基因转化以及药用植物次生代谢物质的生产等目标。
本文将重点介绍植物细胞培养技术的原理和应用。
一、植物细胞培养的原理植物细胞培养的原理基于植物组织和细胞的可再分化能力。
在适宜的培养基和环境条件下，植物细胞可以分化为新的组织和器官，或者直接分化为整个植株。
培养基中的营养物质和激素是影响和调控细胞分化的关键因素。
通过合理调配培养基的成分，可以促使细胞分化为不同类型的组织和器官。
二、植物细胞培养的步骤植物细胞培养一般分为以下几个步骤：1. 外植体的选择和预处理：外植体通常选择植物体中的组织部分，如茎尖、嫩叶等。
在培养前需要对外植体进行预处理，如消毒、切割等，以确保培养的无菌性和外植体的活力。
2. 培养基的配制：培养基的成分包括营养物质、植物激素和其他辅助物质。
根据培养的目标和所需组织类型的特点，可以针对性地调整培养基的配方。
3. 培养和分化：将外植体放置在培养基上进行培养，适时调整培养条件，如温度、光照等。
在培养过程中，外植体会发生细胞分化和组织构建。
4. 组织增殖和再生：在适当的生长阶段，可以通过分化培养基中的激素成分调节外植体的生长速度和特性，以促使细胞和组织的增殖和再生。
5. 植株移栽：当培养出足够数量和大小的植株时，可以将其移栽到土壤或其他适宜生长的介质中，实现其正常的生长和发育。
三、植物细胞培养的应用植物细胞培养技术在农业、林业、生物技术和药物生产等领域有着广泛的应用。
1. 繁殖与育种：植物细胞培养技术可以实现植物的大规模无性繁殖，从而加快植物的育种进程。
通过外植体培养和细胞分化，可以繁殖出与母体植株相同的新植株。
2. 基因转化：植物细胞培养技术可以实现外源基因在植物细胞中的转化和表达。
通过导入外源基因，可以改良植物的性状，提高农作物的产量和抗逆性，以及生产具有特殊功能的植物。
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方法1:
撕去表皮
露出叶肉细胞 用解剖刀刮下细胞
方法2：叶片研碎、离心
加研磨介质
• 操作简便、重复性好、群体大
二：单细胞的分离
• 可以获得单细胞的来源：
• 由植物器官分离单细胞 • 由愈伤组织分离单细胞
1 由植物器官分离单细胞
• 叶片是分离单细胞的最好材料 • 叶片分离单细胞的方法：
• 机械法 • 酶解法
• 1）机械法：
• 用刀片刮叶片 (花生成熟叶片) • 叶片研碎、离心法
• 方法：
• 把含琼脂的培养液加到小三角瓶中，使成1cm厚，高压灭菌后备 用。在无菌条件下，取处于活跃生长期的约1cm2大小的愈伤组织 块，安放在三角瓶中固体培养基上的中央部位，并在愈伤组织块上 放一片约1cm2的无菌滤纸片，将其在培养室中放置过夜，使滤纸充 分吸收从组织块渗出来的营养成分。然后将分离出的单个细胞接种 到滤纸上面进行培养。待2~3个月后即可从滤纸上直接转移到新鲜 培养基上，得到单细胞无性系
•
•
该方法可在暗 视野（或相差 显微镜下清楚 地观察到活细 胞的各种变 化，甚至还可 以观察到线粒 体的变化。 由于培养基 少，营养、水 分和PH变动 大，培养细胞 仅能短期分裂
第八讲 植物细胞培养
2012年秋季
上一讲内容回顾
• 1）什么是单倍体？单倍体植株？ • 单倍体（Haploid）：具有配子染色体数目的 细胞、组织或个体 • 单倍体植株（Haploid Plant）：由单倍体细 胞分化、生长出来具有配子体染色数的植株
• 2）单倍体细胞培养的途径？
• 雌配子体培养（未受精的胚珠/子房培养） • 花药培养 • 花粉培养
轻轻研磨 过滤、离心
• 机械法的优缺点：
• 优点：完整细胞不受酶的伤害，无需胞质分离，对于生理生 化研究较为理想 • 缺点：细胞产量低，不易获得大量活性细胞；仅适用于只有 薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少的叶片类型
• 2）酶解法
• 常用酶：果胶酶 • 添加0.8%甘露醇及1% 硫酸葡聚糖钾
加果胶酶
• 3）什么是雄核发育途径？其启动机制是？
• 在合成培养基上，以花药或花粉为外植体，改变花粉 的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行 分裂、分化、最终发育成完整植株的发育途径。 • P花粉及饥饿处理
• 4）适合单倍体培养的花粉发育阶段？花粉单 倍体植株的形态发生方式有哪两类？
• 花粉离体培养时，雄核发育最适宜的时期一般是第 一次有分裂或之前 • 胚状体发育途径及愈伤组织发育途径
三：植物细胞培养的分类
• 单细胞培养
• 细胞的悬浮培养
1 单细胞培养
• 对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂 增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、 根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术 • 培养方法：
• 平板培养法(Plating Method) • 看护培养法(Nurse Culture) • 微室培养法(Microchamber Culture) • 纸桥培养法(Paper Wick Method)
• 此法简单易 行，易于成 功，但不能在 显微镜下直接 观察细胞生长 过程
• 3）微室培养法
• 悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的 固体培养基中的培养方法
• 方法：
• 将洗净的盖玻片与载玻片在酒精灯火焰上消毒，冷却后按盖 玻片大小在载玻片上涂一圈四环素眼膏。 • 将细胞悬浮液滴一小滴在载玻片上，然后在四环素眼膏上放 一小段毛细管，将消毒后的盖玻片盖在四环素眼膏的框子沙 锅内，使其与眼膏紧密接触，在盖玻片与载玻片之间造成一 密闭的小室，这小室通过一段毛细管与外界通气，盖玻片盖 上后要使它与细胞悬浮液滴相接触。 • 带有培养物的微室可以按需要放在培养箱或培养室中，温度 26~28℃，光照或黑暗的条件下进行培养。 • 观察或照相时一定要在同一温度下进行。
• 1）平板培养法：
• 分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿 内的培养方法称为平板培养法
• 方法：
• 将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等)消化 分散纯化的细胞，经计数及稀释（悬浮液中细胞的 密度调整到103~105个/ml），接种到加热熔化而刚 冷却至35℃左右的固体培养基中充分混匀，倾入培 养皿中，石蜡密封，于25℃培养，约20天后细胞即 可生长成团。统计生长情况
• •
平板培养的效果一般用植板率衡量。植板率是指已形成细胞团的单 细胞与接种总细胞数的百分比 植板率=（每个平板中所形成的细胞团数/每个平板中接种的细胞 数）Χ100%
• 2）看护培养法
• 从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃毛细管分离单细胞，每 个细胞放在一个方形滤纸片的上表面，而滤纸片放在活跃生长的愈 伤组织上进行培养的方法
பைடு நூலகம்
• 5）花药/花粉培养在育种中的应用有哪些？
• 克服后代分离，缩短育种周期 • 提高目标基因型的选择效率 • 用于诱变育种 • 获得超雄株
本讲内容
• 概念 • 单细胞的分离 • 植物细胞培养分类 • 植物细胞培养的应用
一：定义
• 植物细胞培养（plant cell culture）：指对 植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞(或 小细胞团)进行培养，形成单细胞无性系或再 生植物的技术 • 特点：
过滤 、离心
• 酶解法的优缺点：
• 优点：可以得到高纯度的叶肉细胞；产量高；细胞 不易破 • 缺点：细胞受到酶伤害；细胞受到质壁分离影响； 对于，大麦、小麦和玉米很难通过酶解法使细胞分 离（叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间形 成一种互锁结构）
2 由愈伤组织分离单细胞
• 将未分化、易碎散的愈伤组织—转移到装有适当液体 培养基的三角瓶中—置于水平摇床以80-100 rpm振荡 培养—获得悬浮细胞液—用孔径200 mm的细胞筛过滤 除去大块细胞团—再以4000 rpm速度离心—除去比单 细胞小的残渣碎片—获得纯净的单细胞悬浮液 • 方法简便、易于获得大量高质量的单细胞，应用广泛