分子生物学综述

基于特定引物PCR的DNA分子标记技术研究进展

摘要：

PCR是一种选择性体外扩增DNA的方法，分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种比较理想的遗传标记技术。SSR、SCAR、SRAP 和TRAP是四种最新发展的基于特定引物PCR的新型DNA分子标记技术，具有简便、高效、重复性好等优点，已在遗传育种的种质资源等各个方面得到广泛应用。介绍了这四种分子标记的基本原理和特点，综述了它们在分子生物学研究中的应用。

关键词：分子标记SSR SCAR SRAP TRAP

DNA分子标记技术的研究始于1980年，本质上是指能反映生物个体或种群间基因组某种差异的特异性DNA片段，DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA差异，通常也称DNA的指纹图谱。与其他几种遗传标记相比具有的优越性有：大多数分子标记为显性，对隐性的农艺形状的选择十分便利;基因组变异及其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标形状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。目前DNA分子标记技术已有数十种，主要可分为4大类:基于分子杂交的DNA 分子标记技术;基于随机/特定引物PG R的DNA分子标记技术;基子限制性酶切与PCR技术的分子标记技术;基于芯片技术的DNA分子标记技术。概述新型的基于特定引物PCR的DNA分子标记技术，包括SSR,SCAR,SRAP和TRAP。目前这些I3;VA分子标记技术的应用仍具有相当的局限性，如何将它们有效地利用于分子生物学研究是函待解决的问。

1序列特异扩增区域SCAR

1. 1 SCAR标记的原理

序列特异扩增区域(sequence characterised am-plifiedreginn)简称SCAR标记，是1993年Paran和Michelma记[1]]建立的一种可靠、稳定、可长期利用的RAPD 标记技术。SCAR标记的基本流程:先用随机引物进行RAPD筛选，获取特异的RAPD标记，然后对标记进行克隆和测序，根据测定RADII标记两末端的序列设计一对引物，此引物通常包含有原来的RAPD引物序列，多为20-24，再用该引物对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，这样就可以把与原来的RAPI3片段相对应的单一位点鉴定出来。

1. 2 SCAR标记的特点

SCAR标记方便、快捷、可靠，适合于大量个体的快速检测，结果稳定性好，重复性高。由干SCAR标记使用的引物长，因而试验的可重复性高，它克服了RAPD重复性欠佳的弱点，同时具有STS标记的优点，因此比RAPn及其他利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用要好，在分子标记辅助育种、种质资源鉴别等方面有着潜在的应用前景，SCAR标记是共显性遗传的。待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示，这甚至可省却电泳的步骤。由于RAPD 扩增过程中错配几率较高，RAPD标记片段同源性高导致SCAR标记的转化成功

率较低，而由SRAP和I55R分子标记转化得到的。SCAR标记转化成功率较高。

1.3 SCAR标记的应用

SCAR标记直接采用专一特异性引物进行PC R扩增，排除了随机引物结合位点之间的竞争，且避免了筛选引物、估算样品间遗传相似性和构建遗传聚类图的繁琐过程，稳定性和重复性得以显著提高。SCAR标记目前已被广泛用于农林经济作物的种质鉴定、分子标记辅助育种、遗传连锁图谱构建和基因定位等诸多领域[2]。吴学谦等[3]通过对香菇菌株IG2和申香1U号的RAPD分析中分别获得一个多态性片段，再将该片段转化为特异的SCAR标记，该标记能快速鉴定这两个菌株。谢宝贵等[4]将金针菇子实体白色基因连锁的RAPD标记转化为SCAR 标记，认为可应用于白色金针菇良种选育，提高育种效率。Masuzeki等利用8对SC AR锚定引物构建洋葱的SCAR标记连锁图谱，并将此用于其他葱类的遗传分析。Shimada等在黄酮生物合成基因内含子长度多态性的基础上，建立SCAR 标记，可有效鉴定龙胆草极其变种，从而保护育种者权利。假单胞菌可代替农药用于雪霉病的生物防治，Halm-berg等应用SCAR标记来有效监测假单胞菌的生物防治作用效果。

2相关序列扩增多态性(SRAP )

2.1 SNAP标记的原理

相关序列扩增多态性简称SRAP，是一种新型的基于PCR技术的分子标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系LI与Q博士于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性。该标记通过一对引物对开放读码框进行扩增，上游引物长17 bp,5'端的前10bp是一段填充序列，紧接着是CCGG，它们组成核心序列及3'端3个选择碱基，对外显子进行特异扩增。下游引物长18 bp , 5'端的前10一11帅是一段填充序列，紧接着是AATT，它们组成核心序列及3'端3个选择碱基，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。

2. 2 SRAP标记的特点

SRAP标记测序显示多数标记为外显子区域，25条多态性带中16条序列GC含量超过35%，表明可能是外显子部分;Blas t搜索表明，60%条带与已知基因序列高度一致，这就确认了SRAP产生的多数标记包含了可译框中的外显子。测序还表明SRAP多态性产生于两个方面:由于小的插入与缺失导致片段大小改变.而产生共显性标记;核昔酸改变影响引物的结合位点，导致显性标记产生。该标记的优点:多态性高、产率中等;重复性好;操作简单;在基因组中分布均匀:可显示大量的共显性标记;较易对扩增得到的目标片段进行测序;引物具有通用性，而且其正向引物可以与反向引物两两搭配组合，因此用少量的引物可组配得到多个引物对，提高了引物的使用效率，降低引物合成成本。

2. 3 SRAP标记的应用

SRAP分子标记系统主要应用于物种资源鉴定与评价、遗传图谱构建、绘制基因转录图谱、基因定位以及标记重要基因并克隆测序。该分子技术最早是在芸甚属作物开发出来,目前已在其他作物如马铃薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、苹果、