磷酸氟达拉滨的有关物质研究

Table 1 Fludarabine phosphate and specified impurities
表 1 磷酸氟达拉滨及其特定杂质
Structure
Compd．
Fludarabine phosphate Impurity A Impurity C Impurity E Impurity F
Table 2 HPLC data of fludarabine phosphate and specified impurities
表 2 磷酸氟达拉滨及其特定杂质的高效液相色谱数据
Chromatographic condition
Compd．
t / min
tR
a
Impurity A
2. 34
0. 26
至 0 ℃ ，用质量分数为 10% 的盐酸中和至 pH 值
为 3. 0 ～ 4. 0，过滤，滤液通过制备色谱分离纯化。 色谱柱： C18柱（ 150 mm × 4. 6 mm，5 μm） ； 流动相： 质 量分数为 0. 1% 乙酸水溶液-甲醇（ 体积比 85∶ 15） ； 流 速： 1. 0 mL·min －1； 检 测 波 长： 260 nm； 进 样 量： 100 μL； 收集相对保留时间为 2. 5 的峰富集杂质 F。
1—Impurity A； 2—Impurity B； 3—Impurity C； 4—Impurity D； 5—Impurity E； 6—Impurity F； Ⅰ—Fludarabine phosphate； A—Fludarabine phosphate and specified impurity A，B and C by chromatographic condition a detected； B—Fludarabine phosphate and specified impurity D，E and F by chroma-
作者首次设计合成了杂质 C 和 F，并用全新、 简便的化学方法合成了杂质 A。采用起始原料氟 达拉滨与三氯氧磷在三烷基磷酸酯中低温反应得 到磷酸氟达拉滨，当增加三氯氧磷用量和提高反 应温度时，副产物杂质 C 为主要产物； 磷酸氟达 拉滨分别和不同的碱发生取代反应生成杂质 A 和杂质 F。通过制备色谱对这 3 个杂质进行分离 纯化，并 通 过 质 谱、核 磁 共 振 等 方 法 进 行 结 构 确 证，解决了磷酸氟达拉滨原料药和制剂产品质量
周期和增加利润空间，对药品中关键杂质的研究 尤为重要。《欧洲药典》［2］和《美国药典》［3］收录
胞生长。磷酸氟达拉滨对低度惰性淋巴瘤和淋巴 的磷酸氟达拉滨有关物质项下均要求检测 6 个特
增殖性疾病具有很好的疗效，耐受性好，是目前慢 性淋巴细胞白血病治疗的标准一线药物［1］。
定杂质（ 见表 1） 。目前国际通行要求对特定杂质 采 用杂质对照品进行分析验证 ，而 磷 酸 氟 达 拉 滨
氟达拉滨（ 即杂质 E，白色粉末，连云港盛和 生物科技有限公司，批号 100101） ，杂质 B（ 白色 粉末，上 海 瀚 鸿 化 工 科 技 有 限 公 司，批 号 BHB81037-090301） ，杂质 D（ 白色粉末，上海瀚鸿化 工科技有限公司，批号 BH-4057-081001） ，磷酸氟 达拉滨（ 白色粉末，连云港杰瑞药业有限公司，批 号 100501） ，三 氯 氧 磷 （ 分 析 纯，天 津 红 岩 试 剂 厂） ，磷酸三乙酯（ 分析纯，国药集团化学试剂有 限公司） ，其他试剂（ 分析纯，市售） 。
F
OH
H PO3 H2
6-amino-9-（ 5-O-phosphono-β-D-arabinofuranosyl） -9H-purin-2-ol
OH
OH
H PO3 H2
9-（ 3， 5-di-O-phosphono-β-D-arabinofuranosyl） -2-fluoro-9H-purin-6-amine
《美国药典》和《欧洲药典》对磷酸氟达拉滨 有关物质的检测方法相同，其中流动相 a 检测主
保留时间为 0. 26 的峰富集杂质 A。
峰前杂质，流动相 b 检测主峰后杂质。在药典的
2. 2 9-β-D-阿 拉 伯 呋 喃 糖-2-氟 腺 嘌 呤-3'，5'-二 检测方法下，杂质峰与主峰均能良好分离，并有较
F
OH PO3 H2 PO3 H2
9-β-D-arabinofuranosyl-2-fluoro-9H-purin-6-amine
OH
OH
H
H
2-ethoxy-9-（ no-furanosyl）
5-O-phosphono-β-D-arabi-9H-purin-6-amine
O-C2 H5
OH
H PO3 H2
杂质进行纯化。结果 制备了磷酸氟达拉滨 3 个特定杂质，并通过高分辨质谱、核磁共振等方法进
行了结构鉴定。结论 制备的化合物可作为磷酸氟达拉滨原料药和制剂产品质量控制的杂质对照
品，可对特定杂质进行准确的定性定量控制。
关键词： 磷酸氟达拉滨； 有关物质； 合成； 纯化； 结构鉴定
中图分类号： R 914
2 方法
磷酸氟达拉滨的 3 个特定杂质 A、C、F 的合 成路线见图 1。
1—Impurity E； 2—Impurity A； 3—Fludarabine phosphate； 4—Impurity C； 5—Impurity F
Fig． 1 Synthetic routes of fludarabine phosphate specified impurities
CAS No．
75607-67-9 62314-92-5 548774-53-4 21679-14-1 159002-28-5
Nomenclature
R
R1
R2
R3
R4
9-（ 5-O-phosphono-β-D-arabinofuranosyl） -2-fluoro-9H-purin-6-amine
入二氯甲烷（ 50 mL × 2） 萃取，合并水层，过滤，滤
液 通 过 制 备 色 谱 分 离 纯 化。 色 谱 柱： C18 柱 （ 150 mm × 4. 6 mm，5 μm） ； 流动相： 10 mmol·L － 1 磷酸二氢钾； 流速： 1. 0 mL·min － 1 ； 检测波长： 260
3 结果
3. 1 磷酸氟达拉滨及其特定杂质的 HPLC 分析
tographic condition b detected． Fig． 2 HPLC chromatograms of fludarabine phosphate and specified impurities
图 2 磷酸氟达拉滨及其特定杂质的高效液相色谱图
文献标志码： A
磷酸氟达拉滨（ fludarabine phosphate） 化学名
为了加强磷酸氟达拉滨原料药和制剂产品的
为 9-β-D-阿 拉 伯 呋 喃 糖-2-氟 腺 嘌 呤-5'-磷 酸 酯， 质量控制，进一步延长磷酸氟达拉滨的市场生命
属于抗代谢抗肿瘤药，在人体内可代谢成为氟达 拉滨三磷酸酯抑制 DNA 的合成，从而抑制肿瘤细
控制所需的杂质对照品来源问题。
1 仪器与材料
Agilent 1100 LC-MSD 质谱仪（ 美国 Agilent 公 司） ，Waters MicroMass Q-Tof 高分辨质谱仪（ 美国 Waters 公司） ，BRUKER AV-500 核磁共振仪（ TMS 为内标，瑞士 Bruker 公司） 。
（ 1. 连云港杰瑞药业有限公司 研发部，江苏 连云港 222006； 2. 中国药科大学 药物分析教研室，江苏 南京 210009； 3. 沈阳药科大学 制药工程学院，辽宁 沈阳 110016）
摘要： 目的 制备磷酸氟达拉滨的 3 个特定杂质，以加强磷酸氟达拉滨原料药和制剂产品的质量控
制。方法 首次以 9-β-D-阿拉伯呋喃糖-2-氟腺嘌呤-5'-磷酸酯（ 磷酸氟达拉滨） 为起始原料，分别合
图 1 磷酸氟达拉滨特定杂质的合成路线
2. 1 9-β-D-阿拉伯呋喃糖-2-羟基腺嘌呤-5'-磷酸 50 ℃ ，搅拌反应过夜后冷却至 0 ℃ ； 用质量分数
酯（杂质 A）的制备
为 10% 的盐酸中和至 pH 值为 6. 0 ～ 7. 0，过滤，滤
将磷酸氟达拉滨 1 g（ 2. 7 mmol） 加至 10 mL 质量分数为 10% 的氢氧化钠水溶液中，加热 至
第1 期
赵金龙等： 磷酸氟达拉滨的有关物质研究
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特定杂质的对照品在国内外均无销售，且无文献 报道其相应的结构确证信息，对有关物质进行控 制所采用的自身对照法准确性欠佳，因此，制备磷 酸氟达拉滨的特定杂质具有重要意义。药品有关 物质的制备，普遍采用的方法有分离富集和化学 合成。杂质 B、D 和杂质 E（ 氟达拉滨） 已有市售 化学品，进行标定后即可作为杂质对照品使用； 杂 质 A 的合成虽有文献报道［4 － 6］，但操作复杂，耗 时长，且在合成的最后阶段采用了生物合成法，处 理方法繁杂，收率低，成本高； 而杂质 C 和 F 的合 成均未见文献报道。
磷酸酯（杂质 C）的制备
强信号。磷酸氟达拉滨有关物质的 HPLC 色谱图
将氟达拉滨 1 g（ 3. 5 mmol） 溶解在 10 mL 磷 见图 2，数据见表 2。
酸三乙酯中，加入三氯氧磷 2 mL（ 21. 9 mmol） ，常
温搅拌反应过夜后冷却至 0 ℃ ； 用质量分数为
10% 的碳酸钠溶液中和至 pH 值为 3. 0 ～ 4. 0，加
第 29 卷 第 1 期 2012 年1 月
沈阳药科大学学报 Journal of Shenyang Pharmaceutical University
文章编号： 1006-2858（ 2012） 01-0016-06
Vol. 29
No. 1
பைடு நூலகம்
Jan． 2012 p. 16
磷酸氟达拉滨的有关物质研究
赵金龙1 ，程 宣1 ，郑 枫2 ，尹 璐1 ，贾 娴3 ，季锡平1
Impurity B 3373-53-3 6-amino-7H-purin-2-ol
OH
Impurity D 700-49-2 2-fluoro-7H-purin-6-amine
F
收稿日期： 2011-07-15 作者简介： 赵金龙（ 1985-） ，男（ 汉族） ，江苏连云港人，助理工程师，本科，主要从事药品注册及药物合成工艺研究， Tel． 15961348367，E-mail rexon@ sina． cn； 贾娴（ 1968-） ，女（ 汉族） ，河北石家庄人，副教授，博士，主要从事药物化学 及不对称合成研究，Tel． 024-23986456，E-mail jiaxian206@ 163． com。
nm； 进样量： 100 μL； 收集相对保留时间为 0. 34
的峰富集杂质 C。
2. 3 9-β-D-阿拉伯呋喃糖-2-乙氧基腺嘌呤-5'-磷
酸酯（杂质 F）的制备
将磷酸氟达拉滨 2 g（ 5. 4 mmol） 加至100 mL
质量分数为 30% 乙醇钠中，常温搅拌过夜后浓缩
至干，得白色固体； 加水 10 mL 溶解，将溶液冷却
成 9-β-D-阿拉伯呋喃糖-2-羟基腺嘌呤-5'-磷酸酯（ 杂质 A） 和 9-β-D-阿拉伯呋喃糖-2-乙氧基腺嘌
呤-5'-磷酸酯（ 杂质 F） ； 以 9-β-D-阿拉伯呋喃糖-2-氟腺嘌呤（ 氟达拉滨） 为起始原料，经磷酰化、水
解反应合成 9-β-D 阿拉伯呋喃糖-2-氟腺嘌呤-3'，5'-二磷酸酯（ 杂质 C） 。采用制备色谱对以上 3 个
液 通 过 制 备 色 谱 分 离 纯 化。 色 谱 柱： C18 柱 （ 150 mm × 4. 6 mm，5 μm） ； 流动相： 10 mmol·L － 1
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沈阳药科大学学报
第 29 卷
磷酸二氢钾-甲醇（ 体积比 94 ∶ 6） ； 流速： 1. 0 mL· min －1 ； 检测波长： 260 nm； 进样量： 100 μL； 收集相对
Impurity B
3. 07
0. 34
Impurity C
3. 30
0. 42
Fludarabine phosphate
7. 64
1. 00
b
Impurity D
3. 93
1. 50
Impurity E
4. 72
1. 90
Impurity F