年产1000吨酸性蛋白酶的生产工艺设计

1. 前言

酸性蛋白酶是一类最适pH值为的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。细菌中尚未发现产酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。

国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。

与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白.近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它们的突变株。李永泉等，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究.戚淑威等对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等，采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋

白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。2008年王云等，通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究，国内仅仅集中于凝乳酶和胃蛋白酶方面，有关真菌酸性蛋白酶的分子生物学研究报道很少

摘要：本课题设计是利用黑曲霉（Aspergillus niger ）制备酸性蛋白酶，主要从菌种的选育，培养基的配置，灭菌，种子扩大培养，和发酵罐的设计，发酵车间的物料衡算，发酵过程的工艺控制，下游加工十点进行。阐述了1000吨饲用酸性蛋白酶的制取工艺。其中对发酵罐做了创新性设计。

2. 菌种的选育

菌种的制备

不管在过去、现在和将来，微生物是各种生物活性产物的丰富资源。在发酵前期，微生物的选择至关重要，此课题设计的是利用黑曲霉发酵生产酸性蛋白酶的整体过程。

选择性分离的一般步骤如下：

含微生物材料的选择——材料的预处理——所需菌种的分离——菌种的培养——菌种初筛——菌种复筛——性能鉴定——菌种保藏。

本实验选用黑曲霉作为菌种，发酵生产酸性蛋白酶，该霉菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为3．350。

而黑曲霉（Aspergillus niger ）生产酸性蛋白酶的工艺流程为：

原始菌株→分离纯化→紫外线诱变→选育菌株分离纯化→亚硝基胍诱变→选育菌株分离纯化→选育菌株生产工艺优化→传代试验→选育菌株→斜面菌种→三角瓶菌种→浅盘菌种_________________

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主原料→混料（水、无机氮、无机盐）→蒸料→冷却→接种→发酵→稳定化处理→干燥→粉碎→包装→检测→成品

↓

粗酶→抽提→过滤→盐析→沉淀→干燥粉碎→包装→检测→成品

菌种的保藏

菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产工业，更离不开菌种。所以，菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分，其任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。常用的菌种保藏方法有：斜面冰箱保藏法、沙土管保藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存

法、真空冷冻干燥保藏法和液氮超低温保藏法。

此课题中黑曲霉采用真空冷冻干燥保藏法，预冻：本实验采用-80 ℃预冻2h 后进行干燥。干燥过程：第一阶段干燥．样品温度分别控制在-15 ℃14 h，10 ℃10 h，真空度为150 Pa，直到样品的水分升华除去90%；第二阶段干燥。升高板层温度至20℃，迅速蒸发样品中的残余水分。该过程大约需要10h。将冻干菌存放于0℃冰箱中备用.

3．培养基的配制

培养基的类型很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到孢子、种子和发酵培养基这三种类型。

活化培养基

黑曲霉的活化培养基的配制如下：斜面培养基：蔗糖30g，NaNO3 3 g，MgSO4 g，KCl g，FeSO4g，K2HPO4 1 g，琼脂20 g，将上述各组分溶于1000 mL水中，121 ℃灭菌20 min，备用。

种子培养基

种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮成为活力强的种子。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。

黑曲霉的种子培养基为麦芽汁培养基。

发酵培养基

发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，