【免费下载】生物化学实验示范报告 蔗糖酶的提取与纯化正确
蔗糖酶的提取和固化
唐志远 08化生一班 0808106020
蔗糖酶的提取和固化
一：试实验目的
1， 了解酶的提取和初纯化法，掌握高速冷冻离心机的操作技术。
2， 了解固定化酶的原理和优缺点。
掌握制备固定化酶的最基本方法。
二：实验原理
酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶系胞内酶，提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶剂提取，得到的材料称为细胞抽取液。
材料不同破壁的方法不同。
我们用的菌体细胞破壁法是自溶法。
固定化酶是用物理或化学的方法使酶固定。
包括吸附法，包埋法，共价交联法等 三：试剂和器材 略。
四：实验步骤：
1， 蔗糖酶的提取 包括初提取A 液，细提取B 液。
2， 酶的固定化，主要用的是包埋法和共价交联法。
3， 固定化酶活力的测定。
（1） 制作葡萄糖的标准曲线。
（2） 酶活测定。
（3） 计算固定化酶的活力单位。
五：实验数据处理
葡萄糖标准曲线
-0.200.20.40.6
0.8葡萄糖的浓度 mg/ml
吸光度
2，酶活性的侧定
六：实验总结
本次试验主要是酶也得提取，其中在提取的过程中掌握如何使用离心机和注意事项，还有提取液的初提取和精细提取的方法。
酶的固化中让我们了解了几种常用的酶固化的原理，以及操作方法和注意事项。
最后是酶活性的测定基本上是测其吸光度，然后根据吸光度进行计算，并得出结论。
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告一、实验目的本实验旨在学习酵母蔗糖酶的提取方法，并掌握其酶活力的测定方法。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种重要的生物催化剂，广泛应用于食品工业、医药工业等领域。
其提取方法主要包括细胞破碎法和超声波法。
细胞破碎法是将酵母细胞经过离心、洗涤后，在低温下使用高压均质机或超声波仪器进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
而超声波法则是将细胞悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
三、实验步骤1. 酵母菌体培养：将活性酵母菌体接种到含有10%蔗糖和0.5%酵母粉的液体培养基中，在30℃下静置48小时。
2. 细胞破碎：将培养好的菌体通过离心后洗涤两次，然后在低温下使用高压均质机进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
3. 超声波处理：将菌体悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
4. 酶活力测定：取一定量的提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，在37℃下反应30分钟后用硫酸铜试剂测定还原糖的含量。
四、实验结果通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，测得其酶活力分别为10.5 U/g和12.8 U/g。
五、实验分析1. 细胞破碎法和超声波法都可以用于酵母蔗糖酶的提取，但是超声波法更加快速、高效。
2. 酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意培养基成分和温度等因素。
3. 酵母蔗糖酶的测定方法可以采用硫酸铜法，但是也可以采用其他方法，如比色法和光度法等。
六、实验结论本实验通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，并测定了其酶活力。
结果表明，超声波法更加高效。
同时，酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意调整培养条件。
最后，硫酸铜法可以用于测定酵母蔗糖酶的活力。
【精品】蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究
论文论文题目：蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究作者姓名周柱林指导教师钟莉学科专业食品科学与工程1102所在学院生物与环境工程学院提交日期2013年12月蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究周柱林生物与环境工程学院食品科学与工程1102班摘要：对啤酒酵母蔗糖酶的相关性质进行研究讨论，实验采用酵母自溶法初步得到粗蔗糖酶，离心除杂质法得到初提取液A，接着制备热提取液B，接着制备乙醇沉淀提取液C，接着采用QSepharose-柱层析法得到纯度较高的D液，然后用DNS法、标准曲线法和分光光度法测定蔗糖酶的活力，用Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量及计算比活力，用微量凯氏定氮法测定总蛋白含量，最后用SDS-PAGE 法测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究。
实验测定结果A、B、C提取液的酶回收率（％）分别为100、128.5、56.6，蛋白回收率（％）分别为100、98.15、4.29，比活力分别为17.4、22.8、230.1，纯化倍数分别为1、1.31、13.22，SDS-PAGE测定酵母蔗糖酶相对分子质量为A:99150、45000；B：10140；C：92200、65660.关键词：蔗糖酶、提取、纯化、酶活力、蛋白质含量、比活力、相对分子质量1.前言（文献综述）：啤酒酵母也叫营养酵母，可以从其中提取蔗糖酶，蔗糖酶又称为转化酶，属于水解酶类，蔗糖在蔗糖酶的催化下，水解为两种还原糖D一葡萄糖和D一果糖。
蔗糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用，并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。
按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。
前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告酵母蔗糖酶的提取实验报告1. 引言酵母蔗糖酶是一种重要的酶，在许多生物过程中起着关键作用。
通过提取酵母蔗糖酶，我们可以深入了解其结构和功能，以及其在实际应用中的潜力。
本实验旨在通过一系列步骤，从酵母细胞中提取酵母蔗糖酶，并评估其活性和效果。
2. 方法和材料2.1 材料- 新鲜酵母菌浆液- 蒸馏水- 磷酸缓冲液- 蔗糖溶液- 高速冷离心机- 低速冷离心机- 离心管- 离心管架- 塑料吸管- 双室温度计- 分光光度计- 试管2.2 实验步骤步骤1：制备酵母酶提取液a) 将10ml新鲜酵母菌浆液倒入离心管中，并以1500rpm的速度在低温下离心10分钟。
b) 将上清液转移至另一个离心管中，再次进行高速离心，以去除细胞碎片。
步骤2：沉淀酵母蔗糖酶a) 将上一步中得到的上清液倒入一个含有7ml蔗糖溶液的试管中。
b) 在室温下孵育搅拌2小时，让酵母蔗糖酶与蔗糖结合形成沉淀。
c) 用低速离心将沉淀分离。
收集上清液备用。
步骤3：测定酵母蔗糖酶活性a) 在分光光度计中设置波长为540nm。
b) 取1ml上清液和1ml磷酸缓冲液混合，作为空白对照。
c) 另取1ml上清液和1ml含20%蔗糖溶液的试管中，作为实验组。
d) 在不同时间点（例如0、1、2、3、4分钟）测定两个试管的吸光度，并记录数据。
e) 计算酵母蔗糖酶的活性。
3. 结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地提取了酵母蔗糖酶，并可以测定其活性。
根据测定结果，我们观察到酵母蔗糖酶在一定时间范围内对蔗糖的降解表现出线性增加的趋势。
这表明酵母蔗糖酶在一定程度上具有稳定的催化作用。
通过本实验，我们还可以根据酵母蔗糖酶的活性表征其在不同条件下的稳定性、催化效率和适应性。
我们可以改变温度和pH值，观察对酵母蔗糖酶活性的影响，从而了解其最适宜的操作条件。
通过进一步的研究，我们还可以探索酵母蔗糖酶在生物制药、食品加工和能源生产等领域的应用潜力。
总结回顾：通过酵母蔗糖酶的提取实验，我们深入了解了酵母蔗糖酶的结构、功能和应用前景。
“蔗糖酶的分离纯化及鉴定”实验目标及PBL问题
实验一、蔗糖酶的提取及粗分离
1. 蔗糖酶的用途，研究蔗糖酶的意义？蔗糖酶(Sucrase , EC 3.
2. 1. 26)叉称转化酶(Invertase)。
可作用于B-1 , 2糖苷键，将蔗糖水解为n葡萄糖和n果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1. 36〜1. 60 倍，在工业上具有较高的经济价值‘“。
可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，
制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
10分
2. 蔗糖酶有哪些性质？包括酶的适用pH和温度、等电点等。
蔗糖酶的最适温度为45 °C
~50 C，最适ph为4.0~4.5。
CuCl:对蔗糖酶有激活作用，而AgC］对蔗糖酶则其抑制作用，NaCI，KCI，FeSQ对蔗糖酶活性无明显作用，但相对活力都保持在70 %以上。
等电点5.6
10分
3. 蔗糖酶存在于什么材料中？你选择哪种材料来提取？为什
么？10分
4 .蔗糖酶属于胞内酶，提取前需要破壁，破壁方法有哪些？15分
5 .蔗糖酶提取溶剂如何选择？为什么？10分
7.蛋白质的粗分离方法有哪些？各有什么优缺点？如何选择？25
分
实验二、蔗糖酶的层析分离(一)
一、实验目标
根据初步纯化以后的样品性质选择一种柱层析方法进行纯化，目
标是纯化效果好，回收率高。
二、导学问题
1蛋白质层析分离方法有哪些？10分
1蛋白质层析分离方法有哪些？10分
2 .各测定方法的原理？20分。
蔗糖酶生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。
2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。
3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。
4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶，并测定其活力，了解蔗糖酶的特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂（如班氏试剂）2. 试剂：- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取：- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤，并悬浮于磷酸缓冲液中。
- 使用匀浆机破碎细胞，收集匀浆液。
- 将匀浆液离心，收集上清液即为蔗糖酶粗提液。
2. 蔗糖酶的纯化：- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解，并使用凝胶过滤柱进行纯化。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合，在适宜的温度下反应。
- 加入还原糖试剂，观察颜色变化，根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取：- 通过匀浆和离心，成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。
2. 蔗糖酶的纯化：- 通过盐析和凝胶过滤柱，成功纯化出蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 在适宜的温度下，蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
- 加入还原糖试剂后，溶液颜色发生变化，表明蔗糖酶具有活力。
4. 影响蔗糖酶活性的因素：- 温度：在一定范围内，温度升高，蔗糖酶的活力增加。
- pH值：在一定范围内，pH值升高，蔗糖酶的活力增加。
- 抑制剂：某些物质（如重金属离子）可以抑制蔗糖酶的活力。
1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 实验结果表明，温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。
3. 在实际应用中，需要根据具体情况进行酶活性的调控，以获得最佳催化效果。
七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
实验操作指导书：蔗糖酶的提取与部分纯化
（一）蔗糖酶的提取与部分纯化一、实验目的：学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。
二、试剂：1. 啤酒酵母2. 二氧化硅3. 甲苯（使用前预冷到0℃以下）4. 去离子水（使用前冷至4℃左右）5. 冰块、食盐6. 1N乙酸7. 95%乙醇三、仪器：1. 研钵1个2. 离心管3个3. 滴管3个4. 量筒50ml 1个5. 水浴锅1个6. 恒温水浴7. 烧杯100ml 2个8. 广泛pH试纸9. 高速冷冻离心机四、操作步骤：1. 提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
（2）称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适量（约10g）二氧化硅，放入研钵中。
二氧化硅要予先研细。
（3）量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。
研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。
（4）缓慢加入预冷的40ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。
以便将蔗糖酶充分转入水相。
（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10000rpm，10min。
如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。
用滴管吸出上层有机相。
（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000rpm，离心10min。
（7）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。
剩余部分转入清洁离心管中。
（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”。
2. 热处理（1）予先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离心10min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分II”）。
3. 乙醇沉淀将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。
蔗糖酶综合性实验报告
一、实验目的1. 了解蔗糖酶的特性和功能；2. 掌握蔗糖酶提取和纯化的方法；3. 学习测定蔗糖酶活力和专一性的实验技术；4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种水解酶，可以将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验通过提取和纯化蔗糖酶，测定其活力和专一性，并分析影响其活性的因素。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母菌、蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等；2. 实验试剂：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铜、硫酸锌、碘液、斐林试剂等；3. 实验仪器：旋光仪、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、移液器、容量瓶、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 蔗糖酶提取（1）将酵母菌接种于含有葡萄糖的培养基中，37℃培养24小时；（2）收集培养液，离心分离菌体；（3）将菌体悬浮于磷酸缓冲溶液中，加入一定量的氯化钠和磷酸氢二钠，超声波破碎菌体；（4）离心分离酶液，得到粗提蔗糖酶。
2. 蔗糖酶纯化（1）将粗提蔗糖酶溶液通过硫酸铵分级沉淀法进行纯化；（2）收集沉淀，用磷酸缓冲溶液溶解，透析去除小分子物质；（3）通过凝胶过滤色谱法进一步纯化蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力测定（1）采用硫酸铜法测定蔗糖酶活力，以葡萄糖生成量为指标；（2）设置不同浓度的蔗糖溶液，在特定条件下测定酶活力；（3）绘制酶活力曲线，确定最适酶浓度和反应时间。
4. 蔗糖酶专一性实验（1）将蔗糖酶分别作用于蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等底物；（2）通过比色法测定反应产物的生成量；（3）分析酶对不同底物的催化效率，确定蔗糖酶的专一性。
5. 影响蔗糖酶活性的因素实验（1）考察pH、温度、离子强度等因素对蔗糖酶活性的影响；（2）设置不同pH、温度、离子强度等条件，测定酶活力；（3）分析影响蔗糖酶活性的因素。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶提取和纯化通过超声波破碎菌体和离心分离，成功提取出粗提蔗糖酶。
经过硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶过滤色谱法，纯化得到较高纯度的蔗糖酶。
蔗糖酶的提取和纯化步骤
色1小时。
10. 脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直 到蛋白质区带清晰。确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不
同纯化过程对杂蛋白去除状况。
※剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。
低分子量标准蛋白试剂盒:
•
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白
MW=97,400 MW=66,200
②以1号管为参比调零，记录光密度值A650，以标准液的浓度为横坐 标， A650值为纵坐标，画出工作曲线。
蛋白含量测定的计算
Pr (mg/ml)=
A650值对应的µ g数(Pr)×10-3 ×稀释倍数 Pr溶液的ml数
BSA标准液 250 µ g/ml
SDS-PAGE电泳实验过程
1. 准备玻璃板：将玻璃板用蒸馏水洗净晾干(实验室前后的空调
蔗糖酶米氏常数的测定操作方法
1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6 HAC缓冲液)至20U/mL，共16ml。 2）取试管8支，按0--7编号，0为对照管。 3）按表 1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃水浴中保温（使 温度平衡，以下同）10min。
4）取约16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。
Buffer
10%SDS 10%Ap TEMED
6、样品预处理：
低分子量蛋白Mark,E1,E2,E3,E4,牛血清白蛋 白。 （1）低分子量蛋白Mark、牛血清白蛋白和E4的样品 由实验室提供。
（2）E1,E2,E3,E4分别取20µ l，再加入20µ l 2倍 (2X)样品缓冲液，在沸水中煮3分钟(本次实验1个 E3、E4-1和E4-2由实验室提供)，点动离心除沉淀。
线的时候，将电流改为20mA （如果同时电泳两块胶，电流恒定在
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
蔗糖酶提取实验报告
1. 掌握从酵母中提取蔗糖酶的基本方法。
2. 了解酶的提取、纯化及活力测定的原理和操作。
3. 掌握酶活性测定的方法。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验采用酵母作为原料，通过破碎细胞、离心、沉淀、透析等步骤提取蔗糖酶，并对其进行活力测定。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母（安琪酵母粉）2. 蔗糖3. 葡萄糖4. 果糖5. 磷酸盐缓冲液（pH6.0）6. 3，5-二硝基水杨酸（DNS）仪器：1. 电子天平2. 离心机3. 恒温水浴锅4. 分光光度计5. 试管6. 烧杯7. 移液器1. 酵母细胞的制备：- 称取1g酵母粉，加入10ml磷酸盐缓冲液（pH 6.0），搅拌均匀，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 将保温后的酵母悬液以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
2. 酶液的提取：- 向上清液中加入等体积的50%饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，置于4℃冰箱中过夜。
- 将沉淀物以3000r/min离心10分钟，收集上清液即为粗酶液。
3. 酶液的透析：- 将粗酶液置于透析袋中，置于磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中透析过夜，以去除硫酸铵等小分子杂质。
4. 酶液的活力测定：- 取1ml蔗糖溶液（2%蔗糖溶液），加入1ml透析后的酶液，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 取0.5ml反应液，加入2ml DNS试剂，沸水浴5分钟。
- 取出后，加入4ml蒸馏水，在540nm波长下测定吸光度。
五、实验结果与分析1. 酶液活力测定结果：- 通过DNS试剂显色，根据吸光度计算出酶的活力。
2. 结果分析：- 通过对比不同处理条件下的酶活力，分析提取、纯化过程中酶活力的影响因素。
六、实验结论1. 通过本实验，成功从酵母中提取了蔗糖酶。
2. 酶的提取、纯化过程中，酶活力受到pH、温度、离子强度等因素的影响。
3. 透析法是一种有效的酶纯化方法，可以去除小分子杂质，提高酶的纯度。
生化实验报告-离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
实验报告一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的pI 偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。
2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。
（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。
（100℃显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液⑶ 20mmol/L Tris-HCl （1mol/L NaCl ）pH7.3缓冲液 ⑷ 0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）（3）ÄKTA TM start（1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）（5）－20℃冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪 200ul、1000ul（7）1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）（8）7ml离心管（留样品Ⅳ用）（9）恒温水浴（50℃、100℃）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。
生化实验报告离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤六、实验结果和分析沖戸必象实验报告一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得一、 实验目的和要求1、 学习离子交换层析的基本原理2、 学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、 学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、 实验内容和原理1、 离子交换层析由于蔗糖酶的偏酸性，所以在7.3缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷， 因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提 高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同 的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。
2、 酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。
（50C 水解）3.5 -二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。
（100C 显色）三、 实验材料和主要仪器1、 实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品川）2、 实验试剂⑴⑵20 7.3 缓冲液 ⑶20（1 ） 7.3缓冲液⑷0.2乙酸缓冲液，4.5 ⑸5%蔗糖溶液⑹3，5-二硝基水杨酸试剂3、 实验仪器（1） 高速冷冻离心机（2） 层析柱（© 1.0 X 20 cm ） （1 支/ 组）(3)? (1 套/ 组)(4)部分收集器及收集试管(4管)(1台/组)(5)—20C冰箱(保存样品用)(6)微量移液枪200、1000(7) 1.5离心管(留样品川和样品W用)(8)7离心管(留样品W用)(9)恒温水浴(50、100(10)试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接(1)接通各仪器电源，将泵头分别放置A, B两个溶液瓶中。
注意B为含溶液。
(2)点击电脑桌面上软件图标，打开软件。
选择，点击，进入操作界面。
蔗糖酶的提取及活力
蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定摘要：本学期共做了六次生化实验。
.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。
实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。
实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。
将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。
也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。
第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。
此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。
第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定方法，了解各个酶的纯化情况。
利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。
并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。
第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。
同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。
测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。
第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。
目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。
本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。
其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。
最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。
此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。
最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。
关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD正文：1，蔗糖酶的提取及提纯1.1，文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解反应的酶，广泛存在于生命体内，具有重要的应用价值。
本文主要介绍了蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测方法。
一、蔗糖酶的提取1、选择合适的菌株：蔗糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体中，但不同菌株对蔗糖酶的产生能力存在差异，因此需要根据实际需求选择产酶能力较高的菌株。
2、液态培养：选用适宜的培养基和培养条件，促进菌株生长和蔗糖酶的合成。
一般情况下，最佳培养条件为温度在35℃左右，pH值为7.0左右，培养时间为24-48小时。
3、离心沉淀：将菌液离心，取上清液即为蔗糖酶提取液。
1、离子交换层析：通过调节液相pH值，利用离子交换材料对蔗糖酶进行吸附、洗脱和分离。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶材料对蔗糖酶进行筛分，分离出不同分子量的蔗糖酶。
3、亲和层析：在固相材料上引入亲和基团，用于特异性地吸附蔗糖酶，洗脱和分离目标蛋白。
1、透析：通过半透膜对蔗糖酶真空透析，去除杂质。
2、浓缩：利用超滤膜对蔗糖酶进行浓缩。
3、电泳：运用电泳等方法对混合蛋白进行分离和分析，以实现蔗糖酶的纯化。
蔗糖酶的活性检测方法多种多样，以下介绍其中几种常见的方法。
1、邻苯二甲酸法：通过对邻苯二甲酸恒量反应条件下，测量比色产物的吸光度来检测蔗糖酶的活性。
2、甲酚磺酸法：测量甲酚磺酸转化为带电离子的速率，来判断蔗糖酶活性的多少。
3、蔗糖酶显色法：在蔗糖酶的作用下，蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，再利用淀粉-碘酒作为指示剂，显色程度来反映蔗糖酶的活性。
总结：蔗糖酶是一种重要的酶类，在生命科学和工业生产等领域具有广泛应用。
其提取、分离、纯化及活性检测方法多种多样，需要根据不同的实验条件和需求来选择合适的方法。
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose 柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力, 但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离DEAE-Cellulose 柱层析分子筛层析Km 前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
提取蔗糖实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握提取蔗糖的实验方法；2. 了解蔗糖的化学性质和物理性质；3. 培养学生的实验操作技能和实验数据处理能力。
二、实验原理蔗糖是一种天然甜味剂，广泛存在于植物中。
提取蔗糖的方法有结晶法、酸解法、酶解法等。
本实验采用酸解法提取蔗糖，通过将含有蔗糖的原料与稀硫酸混合，使蔗糖分解为葡萄糖和果糖，然后通过蒸发浓缩、冷却结晶等步骤，得到纯净的蔗糖。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：甘蔗、稀硫酸、蒸馏水、无水硫酸钠、乙醇、氢氧化钠、活性炭；2. 实验仪器：烧杯、玻璃棒、漏斗、蒸发皿、冷凝管、抽滤瓶、温度计、电子天平、烘箱、显微镜。
四、实验步骤1. 准备原料：将甘蔗洗净，去皮，切成小块，放入烧杯中，加入适量的蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀；2. 加酸分解：向烧杯中加入适量的稀硫酸，使溶液pH值在2-3之间，搅拌均匀，然后置于水浴锅中加热，保持微沸状态，加热时间为1小时；3. 蒸发浓缩：将加热后的溶液倒入蒸发皿中，用玻璃棒搅拌，使溶液中的水分逐渐蒸发，浓缩至体积减少至原体积的1/10；4. 冷却结晶：将浓缩后的溶液置于冰箱中冷却，使蔗糖结晶；5. 抽滤：将结晶后的蔗糖用抽滤瓶进行抽滤，收集蔗糖晶体；6. 洗涤与干燥：用少量蒸馏水洗涤蔗糖晶体，然后用无水硫酸钠干燥，置于烘箱中烘干；7. 精制：将烘干后的蔗糖加入适量的氢氧化钠溶液，搅拌均匀，再加入活性炭，搅拌片刻，过滤，将滤液蒸发浓缩，冷却结晶，重复以上步骤，得到纯净的蔗糖。
五、实验结果与分析1. 实验结果：通过以上实验步骤，成功提取出纯净的蔗糖晶体；2. 实验分析：本实验采用酸解法提取蔗糖，通过加热分解蔗糖，使其转化为葡萄糖和果糖，再通过蒸发浓缩、冷却结晶等步骤，得到纯净的蔗糖。
实验过程中，需要注意控制溶液的pH值，以确保蔗糖分解完全。
此外，实验过程中要注意安全，避免酸液溅到皮肤上。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了提取蔗糖的实验方法，了解了蔗糖的化学性质和物理性质；2. 培养了学生的实验操作技能和实验数据处理能力；3. 增强了学生对实验安全知识的认识。
化学蔗糖实验报告
一、实验目的1. 了解蔗糖的化学性质和组成；2. 掌握蔗糖的提取和纯化方法；3. 学习使用化学试剂和仪器进行实验操作；4. 培养实验观察、记录和分析能力。
二、实验原理蔗糖是一种二糖，由葡萄糖和果糖通过糖苷键连接而成。
在酸性条件下，蔗糖可被水解为葡萄糖和果糖。
本实验通过水解反应，提取并纯化蔗糖，同时观察其性质和组成。
三、实验器材与试剂1. 器材：烧杯、玻璃棒、漏斗、滤纸、蒸发皿、电子天平、水浴锅、滴定管、移液管、锥形瓶等；2. 试剂：蔗糖、硫酸、氢氧化钠、氯化钠、硫酸铜、氢氧化铜、无水硫酸铜、蒸馏水等。
四、实验步骤1. 蔗糖的提取（1）称取5.0g蔗糖，置于烧杯中；（2）加入20ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌溶解；（3）将溶液过滤，收集滤液。
2. 蔗糖的水解（1）将滤液倒入烧杯中，加入5ml硫酸，搅拌均匀；（2）将烧杯放入水浴锅中，加热至沸腾，保持5分钟；（3）停止加热，用玻璃棒搅拌溶液，冷却至室温。
3. 蔗糖的纯化（1）将冷却后的溶液倒入漏斗中，用滤纸过滤；（2）将滤液倒入蒸发皿中，加热蒸发，直至浓缩；（3）冷却后，用玻璃棒搅拌，观察晶体形成；（4）收集晶体，称重，计算产率。
4. 蔗糖的性质鉴定（1）将少量蔗糖晶体加入硫酸铜溶液中，观察颜色变化；（2）将少量蔗糖晶体加入氢氧化钠溶液中，观察颜色变化；（3）将少量蔗糖晶体加入氯化钠溶液中，观察颜色变化。
五、实验结果与分析1. 蔗糖的提取与纯化根据实验结果，蔗糖的提取率为80%，纯化后产率为60%。
2. 蔗糖的性质鉴定（1）蔗糖晶体加入硫酸铜溶液后，溶液呈蓝色；（2）蔗糖晶体加入氢氧化钠溶液后，溶液呈蓝色；（3）蔗糖晶体加入氯化钠溶液后，溶液无明显变化。
六、讨论与改进1. 实验过程中，由于操作不当，导致部分蔗糖损失，影响了产率；2. 在实验过程中，为了提高实验效果，可以尝试以下改进措施：（1）提高实验操作的规范性，减少蔗糖损失；（2）优化实验条件，提高蔗糖的提取和纯化效果；（3）采用其他方法进行蔗糖的性质鉴定，如红外光谱、核磁共振等。
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生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
在本实验条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位；通过Folin法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活。
单位质量的酶蛋白中所含酶的活力称为酶的比活。
主要实验器材：1. 试管、血糖管；2. 秒表；3. 冰盐浴；4. 恒温水浴；5.离心机；6. 721- 型分光光度计；7. 柱层析装置；8. 梯度洗脱装置；9. 部分收集器；10. 电磁搅拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纤维素。
实验操作1．蔗糖酶的分离提纯（1）．蔗糖酶粗品的制备流程：250mL具塞三角瓶＋酵母粉＋1.5g乙酸钠＋25mL甲苯于35o C恒温水浴中搅30min →补加水60mL，搅匀，用塑料薄膜封口，35℃保温过夜→自溶液于4000r/min离心20min，取中间水层液再次在4000r/min离心20min，得无细胞抽提液（初酶E1）→测量初酶液的体积V1，并取出5mL待测酶活力和酶蛋白浓度。
实验得到的初酶液体积V1 = 48.5 mL，留5mL测酶活及酶蛋白，其余43.5mL做后续纯化实验。
（2）．乙醇分级和透析流程：将43.5mL初酶液用稀醋酸调节pH值至4.5 → 32％的乙醇饱和度除杂蛋白（计算所需95％乙醇的量并与初酶液在冰盐浴中预冷，缓慢滴加95％乙醇并不断搅拌。
滴加结束后，于4000r／min离心5min，留取上清液）→再用95％乙醇调节酶液到47.5％的乙醇饱和度，沉淀蔗糖酶（此时需准确计算出使粗酶液的乙醇浓度达47.5％时所需补加95％乙醇的体积；按上述方法加入乙醇后于4000r／min离心5min）→透析（沉淀立刻用10mL 0.005mol／L，pH6.0的磷酸钠缓冲液溶解后，转入透析袋中，将透析袋放入500mL烧杯中，加清水透析过夜（中间换一次清水）→次日，将透析液离心得酶液E2 ，准确测量出酶液E2的体积Ｖ2，并取出5mL待测酶液，测定酶的活力和蛋白浓度。
实验得到的乙醇分级和透析纯化后的酶液体积为13.8 mL，考虑到初酶液留下的5mL，则纯化后的酶液体积校正后应为：V2 = 13.8 × 48.5 / (48.5-5) = 15.39 (mL)。
问题1: 乙醇分级纯化的目的是什么？分级纯化后透析的目是什么?2：乙醇分级和透析纯化后的酶液体积为什么需要进行校正？如何较正？（3）．DEAE—纤维素离子交换层析法纯化：（由于实验条件和学时数所限，此步省略）2．牛血清蛋白和葡萄糖标准曲线定制（1）Folin法定制牛血清白蛋白标准曲线：按表1进行实验操作，并记录A650nm处测得的各浓度对应的OD值，一并填入下表中。
再以蛋白质的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，即可得到标准曲线。
表1 Folin法定制牛血清白蛋白标准曲线实验加样操作及数据记录表表2 Folin法定制牛血清蛋白标准曲线微机数据统计表（2）3、5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线定制：按表3进行实验操作，并记录A540nm处测得的各浓度对应的OD值，一并填入下表中。
再以葡萄糖的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，即可得到标准曲线。
表中试剂混匀后，在沸水浴中准确反应15min，取出后立即用冷水冷却，加蒸馏水定容至25mL，摇匀，用lcm的比色杯于540nm处测光密度值。
表3 3、5 - 二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线实验加样操作及数据记录表、5 - 二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线微机数据统计表表4 33．蔗糖酶活力、蛋白浓度、比活力的测定（1）通过预备实验确定酶活测定以及酶蛋白含量时酶的稀释倍数.（2）蔗糖酶活力测定操作：取2支试管，1支加入用pH4.6，0.2mol／L的醋酸缓冲液适当稀释过（稀释倍数均为50）的酶液（E1、E2）2mL，另一支加入2mL 5％的蔗糖液，把两支试管放入35℃水浴中预热恒温。
3分钟后，将2mL蔗糖加入到酶液试管中，准确计时，3min后于测定管中加入0.5mL 1mol／L的NaOH，摇匀，终止酶促反应。
从酶促反应液准确移取0.5mL溶液放入血糖管中，加入2mL 2%的3,5-二硝基水杨酸试剂摇匀。
于沸水浴中准确反应15min后，加水稀释至定容至25mL，摇匀后，于540nm处测光密度。
问题3: 测定蔗糖酶活力时，酶液为什么要进行稀释？如何确定酶液的稀释倍数？4: 测定蔗糖酶活力时，反应液中先后加入0.5mL 1 mol／L的NaOH的目的是什么？实验测得：稀释50倍的粗酶液催化生成还原糖的吸光度A初葡萄糖= 0.231 ；乙醇分级纯化后稀释50数的酶液催化生成还原糖的吸光度A纯葡萄糖= 0.683（3）酶蛋白浓度测定：分别将初酶液(稀释100倍)与乙醇分级纯化后的酶液(稀释10倍)按Folin法进行蛋白质测定。
问题5：测定酶蛋白浓度时，酶液是否需要进行稀释?实验测得：初酶液中蛋白质显色反应测得的吸光度A初蛋白质= 0.384 ；乙醇分级纯化后蛋白质显色反应测得的吸光度A纯蛋白质= 0.490将以上实验数据代入蛋白质标准曲线回归方程：Y = 0.0155X - 0.0046计算蛋白质含量。
初酶液中蛋白质浓度= 100 × [6 × ( 0.384＋0.0046)/0.0155 ]/1000 = 15.04（mg/mL）初酶液中蛋白质含量= 48.5 ×15.04 = 729.57(mg)乙醇分级纯化后蛋白质浓度= 10 × [6 × ( 0.490＋0.0046)/0.0155 ]/1000 = 1.915（mg/mL）乙醇分级纯化后蛋白质含量= 15.39 ×1.915 = 29.47 (mg)（4）酶活力测定的相关数据处理a. 通过葡萄糖标准曲线测定得到的回归方程：Y = 0.00318X + 0.0082 （Y为吸光度，X为糖浓度）将测得的吸光度代入回归方程，分别计算出蔗糖酶纯化前后催化生成的葡萄糖的量（mg）初酶稀释液催化生成的葡萄糖浓度C初葡萄糖= [50 × (A初葡萄糖－0.0082) / 0.0032]/1000= [50 × (0.231 －0.0082) / 0.0032]/1000 =3.4813 (mg/mL)2mL初酶稀释液催化生成的葡萄糖量（mg）= 4.5 × 初酶液催化生成的葡萄糖浓度C初葡萄糖= 15.67（mg）初酶酶活浓度=50 × 初酶液催化生成的葡萄糖毫克数/参与反应酶体积=50 × 15.67/2 = 391.75（U/mL）初酶液总酶活= 初酶酶活浓度×初酶液体积= 391.75 × 48.5 =18999.88（U）乙醇分级纯化后稀释酶液催化生成的葡萄糖浓度C纯葡萄糖=[50 × (A纯葡萄糖－0.0082)/0.0032]/1000=[50 × (0.683 －0.0082) / 0.0032]/1000 = 10.54 (mg/mL)2mL纯酶稀释液催化生成的葡萄糖量（mg）= 4.5 × 纯酶液催化生成的葡萄糖浓度C初葡萄糖= 47.43（mg）；纯化后酶的酶活浓度= 50×纯酶液催化生成的葡萄糖毫克数/参与反应酶体积= 50 × 47.43 /2=1185.75（U/mL）纯酶液总酶活= 纯酶液酶活浓度×纯酶液体积×纯酶液稀释倍数= 1185.75×15.39 = 18248.69（U）（5）酶比活、提纯倍数及回收率的计算：初酶液酶比活 = 初酶液总活力/初酶液中蛋白质含量= 18999.88 / 729.57 = 26.04 (U/mg)乙醇分级纯化后酶液的比活= 1837.6 / 29.47 = 619.23 (U/mg)蔗糖酶的提纯倍数 = 乙醇分级纯化后酶液的比活/初酶液酶比活 = 619.23 / 26.04 = 23.78（倍）蔗糖酶的回收率 = 乙醇分级纯化后酶液总活力 / 初酶液总活力 = 18248.69 / 18999.88 = 96.05%实验结果统计与结果讨论1．实验结果数据统计表2．实验结果分析总结：（此分析结果不涉及离子交换柱层析的纯化处理）通过实验统计可以明显看出：在提取蔗糖酶过程中，采用乙醇分级纯化透析处理后，得到的蔗糖酶其总活力略有下降，但其阶段收率任能达到96.05%；同时其比活力明显提高，提纯倍数达到23.77倍。
回顾整个蔗糖酶提取及纯化操作，为提高阶段收率保持酶的总活力，在操作过程中需注意以下环节：首先是在乙醇的分级纯化时，应根据蔗糖酶蛋白与其它杂蛋白因结构及分子大小不同等特性，选择好适宜的乙醇浓度除去杂蛋白，沉淀、纯化分离到蔗糖酶。