lentivirus generation 慢病毒转染手册
慢病毒载体使用手册
LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus.lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page.lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page.Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro.Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319).Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: /gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material.Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014).Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005Target Guide Sequence Cloning ProtocolIn order to clone the target sequence into the lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro backbone, synthesize two oligos of the following form. All plasmids have the same overhangs after BsmBI digestion and the same oligos can be used for cloning into lentiCRISPRv2, lentiGuide-Puro or lentiCRISPRv1.Example oligo design : Note that the NGG PAM is not included in the designed oligos. Oligonucleotide ordering tips : Standard de-salted oligos (usually the most inexpensive synthesis) are sufficient forcloning. If not already resuspended, dilute each oligo to 100 µM in sterile water or TE.* * * * *Lentiviral vector digestion, oligo annealing and cloning into digested vector:1. Digest and dephosphorylate 5ug of the lentiviral CRISPR plasmid with BsmB I for 30 min at 37C: 5 ug lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro 3 ul FastDigest BsmB I (Fermentas) 3 ul FastAP (Fermentas) 6 ul 10X FastDigest Buffer 0.6 ul 100 mM DTT (freshly prepared) X ul ddH 2O 60 ul total2. Gel purify digested plasmid using QIAquick Gel Extraction Kit and elute in EB. If BsmBI digested, a ~2kb filler piece should be present on the gel. Only gel purify the larger band . Leave the 2kb band.3. Phosphorylate and anneal each pair of oligos: 1 ul Oligo 1 (100 µM) 1 ul Oligo 2 (100 µM) 1 ul 10X T4 Ligation Buffer (NEB) 6.5 ul ddH 2O 0.5 ul T4 PNK (NEB M0201S) 10 ul total Please use the T4 Ligation Buffer since the buffer supplied with the T4 PNK enzyme does not include ATP (or supplement to 1mM ATP).Put the phosphorylation/annealing reaction in a thermocycler using the following parameters: 37o C 30 min 95o C 5 min and then ramp down to 25o C at 5o C/min4. Dilute annealed oligos from Step 3 at a 1:200 dilution into sterile water or EB.5. Set up ligation reaction and incubate at room temperature for 10 min:X ul BsmB I digested plasmidfrom Step 2 (50ng)1 ul diluted oligo duplex from Step 4 5 ul 2X Quick Ligase Buffer (NEB) X ul ddH 2O 10 ul subtotal1 ul Quick Ligase (NEB M2200S) 11 ul total Also perform a negative control ligation (vector-only with water in place of oligos) and transformation.6.Transformation into Stbl3 bacteria . Lentiviral transfer plasmids contain Long-Terminal Repeats (LTRs) and must be transformed into recombination-deficient bacteria. We use homemade Stbl3 (propagated from Invitrogen C7373-03) and get excellent plasmid yields. Although other RecA- strains may work, we have found the most consistent transformations and yields using Stbl3.。
慢病毒转染步骤
转染法步骤：
1分至适宜浓度的细胞到六孔板中，次日细胞应30%~50%融合
2.第二天，吸掉板中的生长培养基并加入新的含聚凝胺的培养基，加入适当数量的病毒于细胞中（见“决定慢病毒效价”部分），每孔溶液终体积为3ml
注意：考虑到细胞在自旋过程中不一定能完全被培养基覆盖，不推崇减少六孔板中的溶液终体积。
调整孔中聚凝胺的终浓度为8mg/ml.通过涡旋六孔板轻轻地混合培养基，病毒以及聚凝胺。
3.为减少自旋-转染过程中悬浮物质的形成以及孔与孔之间液体接触的情况发生，用无菌微孔密封膜封闭六孔板（直接盖在板上），封闭好后，再在密封膜上加上一层未经灭菌的密封箔，最后盖上六孔板盖。
4.在标准的组织培养离心机中，37°C，2250rpm（1200g）条件下自旋-转染细胞60min.
5.一自旋-转染后就移走密封膜和密封箔，将孔中原有的培养基换为新鲜的生长培养基（每孔2ml就足够）
6.转染24h后，吸掉孔中的培养基并每孔加入新鲜的含有嘌呤霉素的2ml生长培养基。
注意：嘌呤霉素的浓度应被每个细胞株充分利用，一般规定在1-5μg/mL
7.进一步的培养时间主要取决于细胞株的类型以及转染后的实验分析。
通常，嘌呤霉素筛选细胞需要大约48h。
下面推荐的是结合给定的细胞株和分析实验来得到的嘌呤霉素筛选
时间
>转染后实验分析嘌呤霉素筛选细胞时间> mRNA knockdown (qPCR) 2+ days
> Protein knockdown (Western) 3+ days
> Phenotypic assay 表型分析3+ days
8.检测目的感染细胞的表面分子。
慢病毒使用手册
慢病毒使用手册慢病毒（Lentivirus）是一类非常常见的病毒，它属于逆转录病毒家族。
与其他病毒相比，慢病毒具有一些特殊的特征，使其在生物研究领域和基因治疗等应用中变得非常重要。
本文将介绍慢病毒的基本特征、制备和使用方法，以及慢病毒在基因转染、基因表达和基因治疗中的应用。
一、慢病毒的基本特征慢病毒是一类具有外包膜的病毒，其基因组由一条单链正义RNA组成。
慢病毒具有较大的基因载量能力，可携带长达9kb的外源DNA序列。
另外，慢病毒具有高度的细胞性选择性，能够感染多种哺乳动物细胞，并将外源基因稳定地集成到细胞基因组中。
二、慢病毒的制备方法慢病毒的制备包括构建慢病毒载体和包装慢病毒。
构建慢病毒载体通常采用三元质粒系统，其中包括基因载体、包装载体和包衣载体。
基因载体负责携带外源基因序列，而包装载体负责表达与慢病毒复制有关的基因，如gag、pol和env等。
包衣载体则负责表达包衣蛋白，使慢病毒能够正常装配和释放。
包装慢病毒的方法通常采用转染细胞的方式。
将构建好的慢病毒载体与包装载体和包衣载体一同转染到特定的细胞中，通过包装载体表达的基因来启动慢病毒的复制和包装过程。
经过适当的培养和处理后，可以获得高效包装的慢病毒颗粒。
三、慢病毒的使用方法慢病毒主要通过基因转染、基因表达和基因治疗等方式应用于生物研究和医学领域。
1. 基因转染：慢病毒可以用于将外源基因导入到细胞中，实现基因转染。
通过选择性的感染特定细胞或细胞系，可以研究和探索特定基因的功能和调控机制。
2. 基因表达：慢病毒可以被用作基因表达工具。
外源基因在细胞内被稳定地整合到基因组中，从而实现长期稳定的基因表达。
慢病毒可以用于产生稳定的细胞株，并通过基因敲入或敲除等方法研究基因功能。
3. 基因治疗：慢病毒在基因治疗中的应用非常广泛。
通过将修正后的基因导入到患者体内的细胞中，可以实现对某些慢病毒引起的遗传疾病的基因治疗。
此外，慢病毒载体还可以用于制备疫苗和用于癌症免疫治疗等领域。
原汁原味的慢病毒转染与感染protocol
原汁原味的慢病毒转染与感染protocol Lentivirustransfection and infectionsPackaging cell line:293FTGrowth medium:DMEM containing 10% HI FBS, 1%P/S, 0.5mg/ml G418,4 mM L-Glutamine,0.1 mM MEM Non-Essential Amino Acids,1 mM MEM sodium pyruvateLentiviral medium:DMEM containing 10% HI FBS, without antibiotics,4 mML-Glutamine, 0.1 mM MEM Non-Essential Amino Acids,1 mM MEM sodium pyruvateTargetcell medium:DMEM or other medium containing 10% HIFBS, without antibiotics.ProtocolCulturing 293FT cellsQuickly thaw the frozen 293FT cells, and immediately after thawing, transfer the cells to a 15 ml tube containing 10 ml PBS,and then pellet the cells. Resuspend the cells in growth medium, and incubat e cells at 37°C in a humidified 5% CO2 incubator.Transfection and infections1. On Day 1, prepare DNA-Lipofectamine? 2000 complexes foreach sample.a.In a sterile 5 ml tube, dilute 3 μg pLP1, 3 μg pLP2, 3 μg pLP/VSVG, and 3 μg of pLenti expression plasmid DNA (12μg total) in 1.5 ml of DMEM (noserum, no P/S). Mix gently.b.In a separate sterile 5 ml tube, dilute 36 μl Lipofectamine? 2000 (mix gently before use) in 1.5 ml of DMEM (no serum, no P/S). Mix gently and incubate for 5 minutes at room temperature.c.After incubation, combine the diluted DNA (Step a) with the diluted Lipofectamine? 2000 (Step b). Mix gently.d.Incubate for 20 minutes at room temperature to allow the DNA Lipofectamine ? 2000 complexes to form. The solution may appear cloudy, but this will not impact the transfection.e.While DNA-lipid complexes are forming, trypsinize and count the 293FT cells.Resuspend the cells at a density of 1.2x 106 cells/ml in lentiviral medium.f.Add the DNA-Lipofectamine? 2000 complexes (Step 1d) to a 10 cm tissue cultureplate containing 5 ml of lentiviral medium.g. Add 5 ml of the 293FT cell suspension from Step 2 (6 x 106 totalcells) to the plate containing media and DNA-Lipofectamine? 2000 complexes (Step 3).Mix gently by rocking the plate back and forth. Incubate cells overnight at 37°Cin a humidified 5% CO2 incubator.2.The next day (Day 2),remove and discard the medium containing the DNA Lipofectamine ? 2000 complexes and replace with 10 ml lentiviral medium.Incubate cells for 48 hours at 37°C in a humi dified 5% CO2 incubator.Note:Expression of the VSV G glyco protein causes293FT cells to fuse, resulting in the appearance of large, multinucleated cells known as syncytia. This morphological changeis normal and does not affect production of the lentivirus.3. Day 3, set up the targetcell line in target cell medium to 60mm plate so that they will be 30% confluent on the next day.4. Posttransfection (Day 4),a. harvestvirus-containing supernatants. Use a 10 ml syringe to remove the medium from the 293FT cell lines, and filter the viral supernatants through a 0.45 μm filter in 15 ml sterile tube. Replace the medium removed from the packaging cells with 10 ml lentiviral medium.b. infect target cells: 1 volume of lentiviral medium (2ml) and1 volume offiltered virus-containing supernatants(2ml), with polybrene 4 μg/ml.c.Pipet the retaining viral supernatants into 1.5 ml sterile tube in 1 ml aliquots. Store viral stocks at -80°C. When stored properly, viral stocks ofan appropriate titer should be suitable for use for up to one year. When using the frozen viral stocks, thaw frozen stocksat room temperature, rather than at 37°C, since lentivirus is temperature-sensitive.5. Day 5 or 6, second round of infection: repeat the infection as described on day 4. And throw the 293FT cells.6.Day 6 or 7, split target cells to 100 mm plate with fresh target growth medium.7. On the Day 7or 8, select cells using drug.。
慢病毒感染细胞 操作手册
慢病毒感染细胞实验方法一、实验概述培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。
若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。
若为抗性基因（如Puromycin）标记的慢病毒感染，感染48 h-72h后，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。
二、实验材料1.主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.胎牛血清Ausbian VS500TDMEM Corning 10-013-CVR胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50G Puromycin Clontech 631305D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制2.主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.荧光显微镜奥林帕斯IX71CO2培养箱日本三洋SANYO MCO-175倒置显微镜上海蔡康光学仪器有限公司XDS-100离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司Fresco 21生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio 1200-Ⅱ-A2三、实验步骤1．准备目的细胞（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。
（2）完全解冻后，1300 rpm，离心3 min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。
（3）吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。
（4）24 h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。
2．目的细胞慢病毒感染（1）贴壁细胞：a.处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×104个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右。
慢病毒专用转染试剂说明书
慢病毒专用转染试剂LentiFit TM使用说明书产品简介：LentiFit TM脂质体转染试剂是一种高效的阳离子脂质体转染试剂。
与其他脂质体转染试剂相比，汉恒生物独立研发的LentiFit TM脂质体转染试剂具有转染效率高，重复性好，操作简单，无明显细胞毒性，抗血清干扰等优点。
对于大多数细胞，用LentiFit TM转染后72小时内不更换培养液无明显细胞毒性。
同时，血清的存在不影响LentiFit TM的转染效率，这样可以减小无血清对细胞的损伤。
基于以上优点，LentiFit TM常用做慢病毒包装的转染试剂。
包装清单以及储存条件：试剂名货号储存条件规格有效期LentiFit TM转染试剂Let10004℃保存 1 mL12个月使用方法：1.细胞培养：以1个10 cm培养皿转染293T细胞为例，转染前一天接种细胞(20-24小时)，接种细胞约3.5×106，接种体积10 mL，确保第二天转染时细胞汇合度（confluent）能达到约50%~70%。
2.在进行转染步骤前，把10 cm培养皿中的培养液更换成新鲜细胞培养液，培养液的体积为5 mL，放回培养箱中继续培养，并准备转染体系（步骤3-6）。
3. 把LentiFit TM脂质体转染试剂轻轻混匀。
4. 对于待转染的10 cm培养皿中的细胞，取一只洁净无菌离心管，加入24 µg质粒（目的质粒和辅助质粒的比例根据不同包装系统进行调整）到500 µL DMEM溶液，用枪轻轻吹打混匀。
5. 取另一只洁净无菌离心管，加入500 µL DMEM溶液，再加入40 µL LentiFit TM，用枪轻轻吹打混匀,室温放置5分钟。
6. 将步骤4与5中的质粒溶液与LentiFit TM溶液混合，用枪轻轻吹打混匀。
不可V ortex 或离心。
室温孵育20分钟。
有可能出现絮状沉淀物，属正常现象，不会影响转染效率。
7. 将转染复合物逐滴加入到培养皿中，轻轻“8”字形摇晃混匀后，放回培养箱继续培养。
贴壁细胞慢病毒转染步骤及方法
贴壁细胞慢病毒转染步骤及方法
一、细胞培养Panc-1 细胞，常规培养使用含10% FBS (GIBCO) 的DMEM 培养基（含1.5 mg/L-Glutamine，100 U/mL penicillin，100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。
二、病毒侵染实验材料及试剂DMEM培养基+ 10% FBSPBS（Life Science Products&Services）Trypsin-EDTA Solution (Gibco)24孔板（Corning）Lentivirus-NC 病毒液（GenePharma，1×109 TU/mL）
三、步骤
1. 将状态良好的Panc-1 消化后重悬，取适量细胞接种至24 孔板中，37°C培养箱中过夜；
2. 取阴性对照病毒，按1:10、1:100、1:1000 与DMEM培养基混合稀释，总体积约500 μL，并加入终浓度5 μg/mL Polybrene；
3. 吸去24 孔板中原培养基，换入阴性对照病毒梯度稀释液，37°C培养箱中培养；
4. 24h 后吸去阴性对照病毒稀释液，换入500 μL新鲜培养基，37°C培养箱中培养；
5. 48-96h 于荧光倒置显微镜下观察并记录结果。
悬浮细胞慢病毒转染步骤及方法
悬浮细胞慢病毒转染步骤及方法
实验材料与方法
一、细胞培养人红白血病细胞Kasumi-1，常规培养使用含10% FBS(GIBCO)的RPMI 1640 培养基（Hyclone）（含1.5 mg/L-Glutamine，100 U/mL Penicillin，100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。
二、病毒侵染实验材料及试剂
DMEM培养基+ 10% FBSRPMI 1640培养基+10% FBSD-Hank’s Solution96孔板（Corning）24孔板（Corning）Lentivirus-病毒液（GenePharma，1×108 TU/mL）步骤1. 稀释病毒：稀释液（靶细胞维持液培养基）400 μL + 终浓度5 μg/mL Polybrene，将慢病毒原液按1:20、1:10、1:5 加入到稀释液中；
2. 24-well，按4×105 cells/well（根据细胞种类调整），1000 RPM 3min，取细胞沉淀。
将Step 1 中各份病毒稀释液分别与每份细胞沉淀重悬，同时建立对照（blank、negative），37°C 5% CO2中培养；
3. 12~24h 后离心移去细胞侵染后的病毒液，加入0.5 mL 完全培液，37°C 5% CO2过夜
4. 根据细胞状态和类型，如果必要分出1/3~1/5，加入0.5 mL完全培养，继续培养24~48h；荧光倒置显微镜下观察结果。
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
慢病毒包装及质粒转染手册
使用Fugene进行慢病毒包埋步骤
注意：所有操作必须在BSL-2实验室环境进行
第一节：制作慢病毒存储液
293FT细胞的培养：细胞每周按照1:4 - 1:6的比例传代3次，保持其融合度在50%以下
第1天293FT铺板
以30%融合度左右进行10cm皿铺板，37°C, 5% CO 2条件下培养24小时
第2天转染
本实验中pcmv△R8.91:PLP-VSVG :DNA=2:2:2, Total DNA:PEI=1:3
2. 试管2：对每管的转染试剂，加入570ul Opti-MEM,将30ul Fugene加入试管正中
心，避免接触任何管壁，轻轻振荡（不能使用移液器），室温下孵育5min.
3. 将加入Opti-MEM- Fugene混合液加入试管1(DNA)，轻轻震荡混匀。
4．短暂离心使管壁液体流下。
5.室温下孵育15分钟
6. 15分钟后，将Optimem/DNA/Fugene加入细胞，摇动培养皿混匀。
7. 37°C, 5% CO 2培养过夜（12-16小时）
第3天换液
第4天。
慢病毒转染
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA 启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
慢病毒转染操作
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
吉玛慢病毒使用手册(genepharma)
量法
Vg/ml
滴度
和操作要求高 倍 2
TU/ml（估计）
GFP 荧光计数 FACS（流式细胞 TU/ml
感染滴度 经典方法，简单、-
法
计数）
重复性好
抗性克隆计 细胞克隆计数 TU/ml
感染滴度 克隆形成需约 2 周 低估 5~10 倍 3
数法
Dot-blot 法 RNA dot-blot RNA/ml
Lentivirus 表达时间较长，但在一般代谢较旺盛的细胞（如 293T， BHK21 等）上，病毒感染 24hrs 后可以观察到 GFP 荧光；代谢比较缓慢 的细胞（如原代培养细胞，神经干细胞，胚胎干细胞等）GFP 蛋白表达 时间较长，感染后 72-96hrs 甚至更长时间才可以观察到 GFP 荧光。感染 后的细胞可以连续培养一周，通过观察 GFP 的表达时间和表达强度来确 定 Lentivirus 对目的细胞的感染情况。感染后期请根据细胞生长的情况对 细胞进行及时换液和传代，以保证细胞良好的生长状态。
生物安全
1、安全性 （1）删除了全部 HIV-1 的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任 何 HIV-1 蛋白的表达； （2）对 5’和 3’ LTR 分别进行了删除改造，5’LTR 缺失 U3，换上 RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖 Tat；3’LTR 删除 U3，使其不 再具有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体； （3）病毒包装必需的 3 个蛋白 Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替 HIV-1 的 Env）分别独立放置在 3 个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相 之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率； （4）与 MuLV 等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主 细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转 录病毒载体低； （5）慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，全世界有 4 千万人感染了 HIV-1，
金拓思慢病毒产品说明书
金拓思慢病毒产品说明书一、产品简介慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体，由于其结构和功能的特点，慢病毒载体作为一种重要的基因转移工具应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。
区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型细胞，达到良好的基因治疗效果。
我公司生产的重组慢病毒均以国际通用的第三代载体四质粒体系生产，通过重组改造后将含有目的基因的慢病毒骨架及其相应的作用元件组合为新质粒，并通过辅助质粒将病毒包装的元件组成重组病毒。
通过自我灭活的方式，阻止病毒自我复制。
保证了慢病毒使用过程中的良好生物安全性。
二、重要说明2.1安全操作说明1.应在Ⅱ级及以上级别生物安全柜中使用慢病毒产品。
2.虽经过改造后病毒安全性极大提高，操作中仍需佩戴口罩、手套等安全防护措施以免产生潜在危害。
3.操作中所有接触慢病毒试剂的样品、耗材、器皿等均需通过84消毒液（1:20）浸泡后，高温121℃灭活15min以上。
4.实验过程中有病毒液洒落的情况时，应用纸巾将病毒液吸干后喷洒70乙醇，并将擦干的纸巾一并高温处理以免造成其它伤害、污染环境。
2.2使用注意事项所有慢病毒产品均通过干冰低温运输，请收到产品后立即转入-80℃冰箱保存。
每次使用时提前取出病毒液放置在4℃冰箱待融化，并保存于4℃冰箱。
每次融化后请尽快使用，病毒液应尽量避免反复冻融降低病毒滴度。
三、慢病毒制备与使用3.1实验材料细胞：人贴壁细胞293T培养基：高糖DMEM培养基血清：胎牛血清抗生素：青链霉素转染试剂：Transfection-mate增强剂：Polybrene3.2病毒制备方法3.2.1细胞准备细胞复苏：1.将液氮保存细胞取出后，迅速放入37℃水浴锅内，应及时轻柔摇动加快解冻速度。
2.将完全溶解的细胞离心，1500rpm，3min。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。
本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。
一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。
慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。
这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。
二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。
2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。
三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。
2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。
3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。
4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。
5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。
6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。
四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。
2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。
3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。
4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。
5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。
6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。
如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。
慢病毒使用手册
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Lentiviral Vector Particle 使用操作手册
E． 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板， 用 70%乙醇清理培养瓶外壁后拍照，离开显微镜实验台之前，用 70%乙 醇清理显微镜载物台。
F． 废弃的含过病毒的培养基中加入 84 消毒液（1:20 左右），浸泡一天后丢 弃。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用 84 消毒液稀释 液处理，也可以用煮沸处理半小时或常规灭菌（121℃，20 min）。
2. 目的细胞感染预实验
实验材料： 96 孔板一块，20-200 µl 移液枪，1-10 µl 移液枪，10 µl 和 200 µl 枪头，1.5Ep
管，Polybrene、ENi.S.，废液缸，口罩，手套等 说明： MOI：是“multiplicity of infection”的缩写，中文为感染复数或者复感染指数，含
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Lentiviral Vector Particle 使用操作手册
Medium
TU/ml 1x108 1x107 1x106
表 1．感染预实验中的实验组和感染条件
Complete Medium
Complete Medium + 5 µg/ml Polybrene
Eni.S
上海吉凯基因化学技术有限公司
中国上海张江高科技园区爱迪生路 328 号 2 楼 邮编 201203 电话：（86）21 51320189 传真：（86）21 51370635
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慢病毒转染实验流程
慢病毒转染实验流程英文回答：Lentiviral Transduction Protocol.Materials:Lentiviral vector.Target cells.Transfection reagent (e.g., Polybrene)。
Culture medium.Selection reagent (optional)。
Procedure:1. Prepare virus and target cells:Thaw the lentiviral vector and aliquot it into appropriate volumes for your experiment.Count and prepare the target cells at a suitable density for transduction.2. Add the transfection reagent:Add the transfection reagent (e.g., Polybrene) to the virus-containing solution according to the manufacturer's instructions. Incubate for the recommended time.3. Incubate virus with cells:Add the virus solution to the target cells and incubate for 24-72 hours. The optimal incubation time may vary depending on the target cell type and lentiviral vector used.4. Remove virus and select for transduced cells:Remove the virus-containing medium and wash the cells with fresh culture medium.If desired, select for transduced cells using an appropriate selection reagent (e.g., antibiotic resistance marker or fluorescent protein).5. Culture and analyze transduced cells:Culture the transduced cells in the appropriate medium and conditions.Analyze the cells for transduction efficiency and transgene expression using methods such as flow cytometry, microscopy, or Western blotting.Additional Notes:Optimization of the transduction protocol may be necessary for different target cell types and lentiviral vectors.Safety precautions should be taken when handling lentiviral vectors, as they contain potentially infectious material.The use of a spin infection protocol can enhance transduction efficiency.Transduction can be scaled up or down as needed by adjusting the volumes used.中文回答：慢病毒转染实验流程。
lentivirus generation 慢病毒转染手册
Generation o f L entivirusReagents•293T: ATCC•Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001•FBS: Invitrogen cat# 16000-044•DMEM: Invitrogen cat# 11965-118•Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155•L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156•Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050•Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024•Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058293T/fibroblast media (500 mls):DMEM (450 ml)10% FBS (50 ml)Pen/strep (5ml)L-glutamine (5ml)NEAA (5 ml)Reagent setupLentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectorsA. Production of Virus1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cellsreach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection.2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorftube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.Second generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMD2.G 5 ugpsPAX2 5 ugThird generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMDL g/pRRE 5 ugpRSV-Rev 2.5 ugpMD2.G 2.5 ug3. Add transfection mixture dropwise to cells; incubate 4 hrs to overnight (16 hours) andreplace with fresh medium.4. Collect virus-containing medium 48 hours after transfection and replace with freshmedium. Collect virus every 12 hours for up to 3 times total. Keep all viral media at 4Cuntil all collections are done. Pass viral media through a 0.45uM low protein-binding filter.At this point, the viral supernatant can be used to infect cells, frozen at -80C orconcentrated.Concentration using Amicon Ultra Centrifugal Filters:Transfer viral supernatnat to Amicon Filter and spin filter in tabletop centrifuge at 3000 rpm for 10-20 min at 4C. Concentrated virus can be aliquoted and stored at -80C. Thaw analiquot on ice before use; do not refreeze.Concentration by ultracentrifugation:1. Transfer viral supernatant to 33ml Beckman ultracentrifugation tubes and spin for 2hrs at 24,000 rpm using SW32Ti or SW28Ti.2. Pour off supernatant carefully and resuspend viral pellet using 100-ul pipette tip withappropriate amount of DMEM to concentrate virus 100x. It may take 30 min toovernight at 4C for the pellet to completely dissolve.3. Store virus in aliquots at -80C. Thaw an aliquot on ice before each use; do notrefreeze.。
上海吉玛制药技术 吉玛重组慢病毒 说明书
1、 通常在转移载体中最大能够插入多大的目的基因序列？ 基于 HIV 基因骨架的原因，通常插入的目的基因序列要小于 4kb， 否则会影响病毒滴度甚至基因表达。
2、 Lentivirus 对目的细胞的感染效率很低，如何提高病毒的感染效率？ 一般，我们通过提高 MOI 值来提高病毒的转染效率，必要时以在 培养基中加入 Polybrene（4-8µg/ml）来提高病毒的感染效率。同时， 目的细胞良好的生长状态是获得正常感染效率的保证。
同实验室测得滴度数值会有所差异（1~5 倍），但基本不会影响正常实验 流程； （3）病毒滴度(BT = TU/ml, transducing units)计算公式： TU/μl = (P × N / 100 × V) ×1/DF， P = % GFP+ cells， N = 转染时的细胞数，V =每孔加 入病毒稀释液体积（μl），DF =稀释因子（dilution factor）= 1 (undiluted)、 10–1 (diluted 1/10)、 10–2 (diluted 1/100)。
生物安全
1、安全性 （1）删除了全部 HIV-1 的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任 何 HIV-1 蛋白的表达； （2）对 5’和 3’ LTR 分别进行了删除改造，5’LTR 缺失 U3，换上 RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖 Tat；3’LTR 删除 U3，使其不 再具有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体； （3）病毒包装必需的 3 个蛋白 Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替 HIV-1 的 Env）分别独立放置在 3 个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相 之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率； （4）与 MuLV 等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主 细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转 录病毒载体低； （5）慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，全世界有 4 千万人感染了 HIV-1，
病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步调之羊若含玉创作在细胞相关的实验操纵中，对于一些按通例办法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验可以或许大大提高基因的转导效率，以达到目标基因的高效瞬时表达.病毒转染包含以下步调：1构建载体2包装提纯病毒3沾染靶细胞.以慢病毒为例.慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基本成长起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体，它对决裂细胞和非决裂细胞均具有沾染才能.慢病毒载体的研究成长得很快，研究的也异常深入.该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达.在沾染才能方面可有效地沾染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到优越的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果异常幻想，因此具有辽阔的应用前景.一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分.包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，可以或许反式提供产生病毒颗粒所必须的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子掌握下的多克隆位点及在此位点拔出的目标基因.将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目标基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒.慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息.慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有帮助蛋白.为产生高滴度的病毒颗粒，需要应用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒排泄到细胞外的造就基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的沾染，目标基因进入到宿主细胞之后，经由反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子.对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目标基因转导效率，并且目标基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及陈述基因的研究提供了一个有利的途径.对进行稳转细胞株的筛选，为活体动物模子实验提供高质量的包含目标基因的病毒液提供基本.二、慢病毒载体构建及包装流程：（一）实验流程（1和2为并列步调）1.慢病毒过表达质粒载体的构扶植计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采取高保真KOD酶，3K 内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目标基因CDS区（coding sequence）连入T载体.将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体.2.慢病毒干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环构造，退火后连入慢病毒干扰质粒载体3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化制备慢病毒穿梭质粒及其帮助包装原件载体质粒，三种质粒载体分离进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 改换为完全造就基，造就24和48h后，分离收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒.（二）实验资料：慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2.其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）.细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长造就基为DMEM(含10% FBS).贴壁细胞经造就生长增殖形成单层细胞.菌株大肠杆菌菌株DH5α.用于扩增慢病毒载体和帮助包装载体质粒.三、慢病毒转染细胞实验办法（一）慢病毒转染贴壁细胞实验办法1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中.使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右.2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜造就基替换原造就基，参加适量病毒悬液.37℃孵育.3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步调)4小时后参加2ml新鲜造就基以稀释polybrene.4、持续造就24小时，用新鲜造就基替换含有病毒的造就基.5、持续造就.如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见显著荧光表达，72小时后加倍显著.如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行.如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开端加药.（二）慢病毒转染悬浮细胞实验办法1、在2×105/ml悬浮细胞中参加polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀.37℃孵育.或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采取此步调可以提高转染效率).2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步调)4小时后(或离心停止后)参加等体积新鲜造就基以稀释polybrene.3、持续造就3-4天.中间视细胞生长情况可传代或换液.病毒沾染细胞原本效率就较低，一定要注意以下几点：1.沾染时的造就基尽量少些；2. 每1ml的造就基中参加5-10ul的Polybrene（储存液浓度为2mg/ml ），可以提高效率约3-5倍.不过病毒沾染效率的问题都是相对的，达到自己的研究目标即可.北京英格恩生物公司最新研发合成一种新型纳米聚合物病毒沾染增强试剂(病毒转染试剂)EnvirusTM，具有对病毒吸赞同独有的浓缩功效.EnvirusTM通过物理作用将病毒大量富集在细胞概况，大大增加病毒与细胞的接触，最大限度促进病毒沾染细胞，可大大提高腺病毒，慢病毒，腺相关病毒，逆转录病毒等病毒的沾染效率，并且细胞毒性很小.通常情况下，比不必EnvirusTM增强剂，提高沾染效率20-50倍.病毒沾染细胞原本效率就较低，整个进程相对庞杂难操纵，一般一次消费周期至少两三个月，多则几个月到十几个月不等，经费也是几万到十几万.万一实验失败需要重复操纵会消费更多的时间和开支.所以有效提高病毒转染效率是病毒转染细胞的症结.。
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Generation o f L entivirus
Reagents
•293T: ATCC
•Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001
•FBS: Invitrogen cat# 16000-044
•DMEM: Invitrogen cat# 11965-118
•Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155
•L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156
•Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050
•Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024
•Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058
293T/fibroblast media (500 mls):
DMEM (450 ml)
10% FBS (50 ml)
Pen/strep (5ml)
L-glutamine (5ml)
NEAA (5 ml)
Reagent setup
Lentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectors
A. Production of Virus
1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cells
reach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection.
2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorf
tube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.
Second generation packaging system
Transfer vector 10 ug
pMD2.G 5 ug
psPAX2 5 ug
Third generation packaging system
Transfer vector 10 ug
pMDL g/pRRE 5 ug
pRSV-Rev 2.5 ug
pMD2.G 2.5 ug
3. Add transfection mixture dropwise to cells; incubate 4 hrs to overnight (16 hours) and
replace with fresh medium.
4. Collect virus-containing medium 48 hours after transfection and replace with fresh
medium. Collect virus every 12 hours for up to 3 times total. Keep all viral media at 4C
until all collections are done. Pass viral media through a 0.45uM low protein-binding filter.
At this point, the viral supernatant can be used to infect cells, frozen at -80C or
concentrated.
Concentration using Amicon Ultra Centrifugal Filters:
Transfer viral supernatnat to Amicon Filter and spin filter in tabletop centrifuge at 3000 rpm for 10-20 min at 4C. Concentrated virus can be aliquoted and stored at -80C. Thaw an
aliquot on ice before use; do not refreeze.
Concentration by ultracentrifugation:
1. Transfer viral supernatant to 33ml Beckman ultracentrifugation tubes and spin for 2
hrs at 24,000 rpm using SW32Ti or SW28Ti.
2. Pour off supernatant carefully and resuspend viral pellet using 100-ul pipette tip with
appropriate amount of DMEM to concentrate virus 100x. It may take 30 min to
overnight at 4C for the pellet to completely dissolve.
3. Store virus in aliquots at -80C. Thaw an aliquot on ice before each use; do not
refreeze.。