狂犬病病毒-分子生物学基础

3’leader和 5’trailer互补链均含有复制起始信号，但 5’的 trailer互补链的复制信号强度大于3’ leader，造成-ssRNA： +ssRNA=50:1 ， 因 此 包 装 成 熟 的 病 毒 粒 子 含 有 -ssRNA 与 含 有 +ssRNA的比例也约为50:1
VSV转录和复制模型
病原
狂犬病病毒：Rabies virus, RV。 有两种主要抗原：一种是外膜上的糖蛋白 抗原，为主要抗原，决定病毒的嗜神经性 、致病性和产生中和抗体；内层的核蛋白 抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀 素，无保护作用。 从患者或患病动物体内分离的毒株成为自 然毒株或街毒株（street virus），毒力 强；经过脑组织多次传代后，成为固定毒 株（fixed virus），毒力弱，可以用于疫 苗制备。
病毒粒子的装配
研究发现，RV的基因组两端不存在特定的包装 信号，-ssRNA或+ssRNA包装入病毒粒子完全由 两种RNA在细胞内的丰度决定(Finker et al., 1997)。 然而，对VSV的研究发现，VSV基因组-ssRNA 5’端的trailer区含有包装信号，使-ssRNA被 选择性包装入核衣壳 (Whelan and Wertz , 1999)。
RV ss (-) RNA genome
3’
RT 5’
5’ 3’
genome (-)
antigenome (+)
PCR
5’ 3’ 3’ 5’
dsDNA
转录
5’
3’ 5’
3’ 5’
3’ 5’
3’ 5’
3’
mRNA
蛋白翻译
狂犬病病毒分子生物学基础
狂犬病（Rabies）
俗称“疯狗病”，是由狂犬病病毒引起的 一种接触性传染病，呈世界性流行，死亡 率几乎为100%。 每年造成超过55,000人死亡，其中99%在亚 洲，印度具首位，中国第二位。 临床特征是前期神经兴奋，后期意识障碍 ，局部和全身麻痹而死。 因采取疫苗接种及综合防治措施，目前已 有日、韩、马来、澳等36个国家消灭了狂 犬病。
狂犬病病毒属的分类
根据 N基因 5’端 500 bp碱基的同源性分析，可以将狂 犬病病毒属分为7种基因型（Genotype，GT）：
GT I II III IV V 病毒名称 狂犬病病毒 Lagos蝙蝠株 Mokola病毒 Duvenhage病毒 欧洲蝙蝠病毒-1 缩写 RV LagV MokV DuvV EBL-1
逆轴突运输机制
(Cited from Dietzschold et al., 2005)
小结
狂犬病病毒RV是弹状病毒科(Rhabdoviridae )狂犬病 病毒属 (Lyssavirus )的模式病毒种。 RV 呈子弹状，长约为 180 nm (60-400 nm) ，直径约 为75 nm (60-85 nm) 。 具有囊膜包被，基因组为12 kbp大小的单股负链 RNA (-ssRNA)。 高度嗜神经性，且逆轴突传播。 含有5个结构基因，从3’到5’依次为N、P、M、G和L。 病 毒 粒 子 大 小 ： 5×105—8×105 kDa ， 沉 降 系 数 为 600S。
Stop-start model
一个基因转录的终止是下一个基因转录起 始必须的。 RNA聚合酶在终止上一个基因转录时，大约 有30%的RNA聚合酶不能起始下游基因的转 录，造成转录依次递减30%。 研究发现，-ssRNA基因表达的调控主要是通 过基因与3’端启动子的位置来控制的。
RV基因组的复制
病毒的分类
国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses：ICTV）
弹状病毒科病毒结构示意图
弹状病毒科成员
水泡性病毒属
VSV
弹状病毒科
狂犬病病毒属 RV 短暂热病毒属  非毒粒弹状病毒属  细胞核弹状病毒属  植物病毒 细胞质弹状病毒属 
狂犬病疫苗的历史
经历五代疫苗 1. 神经组织疫苗 2. 禽胚培养疫苗 3. 细胞培养疫苗 4. 亚单位及精致疫苗 5. 基因工程疫苗
人用狂犬病疫苗生产流程
细胞制备及培养
接种毒株 分装及冻干 原液检定
培育 收获病毒上清
病毒纯化 病毒灭活
RV的灭活
病毒对H2O2、KMNO4、新洁尔液、来苏儿、 肥皂水、70%酒精、碘酒以及β-丙内酯敏 感。 目前通用β-丙内酯来灭活疫苗收获液中的 活毒，用量为1:4000，方法：4℃过夜， 37℃水浴2h水解残留的β-丙内酯。
两种状态的RNA聚合酶：RNA转录酶和RNA复制 酶。 RNA转录酶：L、P、EF-1αβγ、Hsp60、GT（ 鸟苷转移酶），从N基因处直接开始转录。 RNA复制酶：L、P、可溶性的N蛋白（N-P复合 物形式存在，为复制必须），从基因组的第一 个bp处开始合成leader RNA和复制基因组。
Gregor Johann Mendel 1822 -1884
1
：
1
反向遗传学技术
基因型（genotype） 表型（phenotype）
基因重组技术
-ssRNA反向遗传学建立的基础
L、P、N和病毒-ssRNA或+ssRNA包装形成核糖核蛋 白复合体( ribonucleoprotein, RNP)。 RNP负责病毒进入细胞后的所有复制过程，包括病 毒基因的转录和基因组的复制等。 体外构建具有活性的病毒单位必须提供：1.病毒ssRNA或+ssRNA；2.L、P和N三种蛋白。
RV G蛋白主要抗原位点
II 34-42 I IV III
膜内区：462-505 aa
198-200 231 264 244-281 G5
330-357
342-343 a
膜
膜外区：1-439 aa 跨膜区：440-460 aa
反向遗传学技术
经典遗传学技术
表型（phenotype） 基因型（genotype）
病毒-ssRNA或+ssRNA的提供： 提取病毒基因组 反转录得到cDNA 插入 合适的载体 转入细胞，在外源提供RNA 聚合酶的情况下转录出全长的-ssRNA或 +ssRNA。 病毒三种蛋白的提供： 提取病毒基因组 分别克隆相应的基因 插入合适的载体 转入细胞，表达出相应 的蛋白。
-ssRNA or +ssRNA？
G 蛋白简介
狂犬病病毒G蛋白参与病毒的组织趋向性和致病性，是主 要的保护性抗原，负责诱导病毒中和抗体的产生。 整个G蛋白分为四个结构域：信号肽(signal peptite, SP)膜外区(ectodomain, ECTO)，跨膜区(transmembrane region, TM)和膜内区 (endodomain, ENDO)，成熟的G蛋 白包括后面三个结构域。 G 全长: 522-533 aa 成熟G蛋白: 503-514 aa SP: 19 aa, TM: 22 aa, ECTO: 439 aa, ENDO: 42-53 aa
RV基因的转录
转录重要的顺式作用元件：启动子、转录起 始位点和转录终止信号。 RV基因转录调控模式：stop-start model。
RV转录元件
RV基因组仅有一个启动子，5个基因有相同的转录起始位 点：UUGU和转录终止信号：A/UCUUUUUUU。 通用模式：-间隔区UUGU---ORF---A/UCUUUUUUU间隔区。
病毒的形态
⑴球状病毒；⑵杆状病毒；⑶砖形病毒； ⑷冠状病毒；⑸丝状病毒；⑹链状病毒； ⑺有包膜的球状病毒；⑻具有球状头部的 病毒；⑼封于包含体内的昆虫病毒等。 病毒粒的对称体制： 病毒粒的对称体制只有两种，即⑴螺旋对 称（代表烟草花叶病毒） ⑵二十面体对称 （等轴对称，代表腺病毒）。一些结构较 复杂的病毒，实质上是上述两种对称相结 合的结果，故称作复合对称（代表T偶数噬 菌体）。
杆状病毒
HIV
丝状病毒
腺病毒
病毒的分类
从遗传物质分类：DNA病毒、RNA病毒、蛋 白质病毒（如：朊病毒）。 从病毒结构分类：真病毒（Euvirus，简称 病毒）和亚病毒（Subvirus，包括类病毒 、拟病毒、朊病毒）。 从寄主类型分类：噬菌体（细菌病毒）、 植物病毒（如烟草花叶病毒）、动物病毒 （如禽流感病毒、天花病毒、HⅣ等）。 从性质来分：温和病毒（HⅣ）、烈性病毒 （狂犬病病毒）。
-ssRNA vs +ssRNA
定义：一般来说根据RNA能否直接起mRNA作 用而分成单股正链RNA病毒(正股RNA病毒) 与单股负链RNA病毒(负股RNA病毒)两种。 RV属于单股负链RNA病毒，即-ssRNA病毒。
RV感染周期
(Cited from Dietzschold et al., 2005)
VI
VII
欧洲蝙蝠病毒-2
澳大利亚蝙蝠病毒
EBL-2
ABL
……….
两个遗传谱系
疫苗的 交叉保护 作用仅存 在与同一 个遗传谱 系内的病 毒中！
病毒感染的一般步骤
吸附 进入 脱壳 病毒基因转录和Βιβλιοθήκη Baidu制 子代病毒装配 释放
RV感染的一般步骤
RV的复制和转录
RV基因转录vs复制
病原学
病毒主要存在于中枢神经系统、唾液腺和唾液 内。在唾液腺、海马角、大脑皮层细胞浆内形 成嗜酸性包涵体，称为Negri bodies (NB)， 是病毒复制和装配的场所。 病毒可以在大鼠、小鼠、家兔和鸡胚等脑组织 内增殖、致弱，也可以通过驯化，适应于非脑 组织细胞。
狂犬病疫苗
疫苗：所有用减毒或者杀死的病原生物（包 括细菌、病毒、立克次氏体等）或其抗原性 物质所制成，用于预防接种的生物制品。 目的：预防、控制疾病（如狂犬病）的发生 、流行。 1881年法国巴斯德最早应用连续传代减弱病 毒毒力，成功制造出狂犬病疫苗。 目前接种狂犬病疫苗是预防狂犬病唯一有效 的手段。由于狂犬病几乎100%的致死性，人 用狂犬病疫苗必须是灭活苗。
58种植物病毒未归类 
狂犬病病毒：Rabies virus, RV
75 nm (60～85 nm)
180 nm (60～400 nm)
RV基因组构成
大小：约12 kbp。 单股负链RNA (-ssRNA)。 基因排布（3’to 5’）：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质 蛋白（M）、糖蛋白（G）和大蛋白（即依赖RNA的RNA聚合酶， L）。其中N基因最保守，常用于进化分析；G基因编码的G蛋白 是病毒唯一暴露在外表面的蛋白，是病毒的主要抗原，同时也 是引起宿主免疫应答的主要组分。
里程碑：分子生物学的诞生
1962 Nobel prize in Physiology or Medicine
中心法则
蛋白质
原核生物和真核生物在基因表达上的区别
什么是病毒？
生物病毒是一类个体微小，结构简单，只含 单一核酸（DNA或RNA），必须在活细胞内寄 生并以复制方式增殖的非细胞型微生物。 特点：不具细胞结构，具有遗传、复制等生 命特征，既无能能量代谢系统也无蛋白质和 核酸合成系统……