酶学与酶工程

Lecture1 酶学与酶工程1、酶的概念，命名、酶的活性中心1）酶是由活细胞产生的，具有催化活性和高度转移性的特殊蛋白质，是一类生物催化剂。

酶工程：将酶学理论与化工技术相结合，研究酶的产生和应用的一门新的技术性学科，包括了酶制剂的制备、酶的固定化、酶的修饰与改造及酶反应器等方面。

主要:酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和酶生物反应器。

化学酶工程：用化学手段修饰、改造、模拟天然酶，使其更适合人们的需要，主要包括天然酶、化学修饰酶、固定化酶以及化学人工合成酶的研究与应用。

生物酶工程：用生物学的方法，特别是基因工程、蛋白质工程和组合库筛选法改造天然酶，创造性能优异的新酶，主要是抗体酶、杂合酶、进化酶和核酸酶的研究与应用。

2）命名：系统命名法！！催化下列反应酶的命名：ATP+D—葡萄糖→ADP+D—葡萄糖-6-磷酸该酶的正式系统命名是：ATP：葡萄糖磷酸转移酶，表示该酶催化从ATP中转移一个磷酸到葡萄糖分子上的反应。

它的分类数字是：E.C.2.7.1.1E.C代表按国际酶学委员会规定的命名第1个数字(2)代表酶的分类名称(转移酶类)第2个数字(7)代表亚类(磷酸转移酶类)第3个数字(1)代表亚亚类(以羟基作为受体的磷酸转移酶类)第4个数字(1)代表该酶在亚-亚类中的排号(D葡萄糖作为磷酸基的受体）3）活性中心必需基团：酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基因酶的活性中心：必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。

2、酶的分类、组成、结构特点和作用机制分类：按酶促反应的性质分类（六大类）：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶类、异构酶类、合成酶类全酶=酶蛋白+辅因子辅因子包括：有机辅因子（辅酶非共价结合/辅基非共价结合或共价结合）和金属辅因子（金属酶/金属激活酶）3、酶作为催化剂的显著特点强大的催化能力：可以加快至1017倍；没有副反应，酶在较温和的条件下催化反应的进行；高度的专一性，各种酶都有专一性但是专一程度的严格性上有所差别；可调节性，包括了抑制剂和激活剂的调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等；易变性，大多数的酶是蛋白质，在极端环境中会受到破坏。

4、酶活力的调节调节对象：关键酶！！！——一般位于代谢反应途径的起始或分支位点；催化单向不可逆反应；活性较低（限速酶）；是可调节酶。

方式：酶活性的调节——快速酶含量的调节——缓慢（两种方法：同工酶/控制酶基因的表达和酶分子的降解）酶的质变：酶原调节，变构调节，共价调节酶原调节：避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，使得酶在特定的环境中发挥作用；另外酶原可以认为是酶的储存形式；水解激活是不可逆的。

变构调节：代谢物可以和酶分子活性中心之外的部位可逆性的结合，使酶的构象发生改变，从而改变酶的催化活性。

这类酶一般具有四级结构，存在协同效应/含有催化亚基和调节亚基。

共价修饰：酶蛋白肽链在其他酶的催化下，化学集团可以与酶发生可你的共价修饰，影响了酶的活性。

PS：磷酸化与脱磷酸化等。

（有级联效应）5、核酶的概念及核酶的应用核酶：化学本质是RNA，催化底物包括RNA、DNA、肽键等，还有的具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。

具有反应特异性识别碱基；核酶的催化效率比较低是一种较为原始的催化酶。

PS：核酶是金属依赖酶（特异的结构作用；促进RNA分子的折叠；参与过渡中间复合物的形成）作用：核苷酸转移作用；水解反应，磷酸二酯酶作用；磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用；脱磷酸作用，酸性磷酸酶作用；RNA内切反应，RNA限制性内切酶作用。

脱氧核酶：利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段，称为酶性DNA。

（根据催化功能的不同可以分为五大类：切割RNA的脱氧核酶、切割DNA的脱氧核酶、具有激酶活力的脱氧核酶、具有连接酶功能的脱氧核酶、催化卟啉环金属螯合反应的脱氧核酶）应用：1）核酶可以特异性地识别并结合目标基因，使其断裂失活，从而阻断或降低目标基因的表达，起到基因沉默的作用；2）核酶不会对细胞基因组产生任何副作用，因而可以作为安全有效的分子生物学工具；3）可以应用于基因治疗核酸酶：指所有可以水解核酸的酶，本质为蛋白质。

在细胞内催化核酸的降解。

可分为DNA酶和RNA酶；外切酶和内切酶；其中一部分具有严格的序列依赖性，称为限制性内切酶6、同工酶的概念原级同工酶：同一种属中由不同基因或（复）等位基因编码的多肽链多组成的单体、纯聚体或杂交体，其理化及生物学性质不同而能催化相同反应的酶称为同工酶。

不同基因可以是在不同染色体或在同一染色体的不同位点上，分子结构差异，彼此间无交叉免疫。

次生性同工酶：由同一基因、同一mRNA转译生成原始的酶蛋白，再经过不同类型的共价修饰（如糖基化等）而造成的多种酶分子形式，严格来说不属于同工酶而称为次生性同工酶。

Lecture2 酶促反应1、酶促反应的特点和机理：①极高的效率；②特异性（绝对特异性、相对特异性、立体结构特异性）；③作用条件温和；④具有可调节性。

2、三个假说：1）影响酶促反应的因素，Km值的意义①Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一般时的底物浓度；Km表示酶与底物分子的亲和力，值越大亲和力越小。

②当反应条件恒定时，Km只和酶及底物的性质有关，与酶的浓度无关；③一种酶能催化几种底物时就有不同的Km，其中Km最小的底物一般认为是该酶的天然底物或最适底物；④分辨同工酶：测定几个同工酶对同一底物的Km，可估计这组同工酶是原级同工酶还是次生性同工酶，前者的Km常有差异，后者的则比较接近或相同。

⑤有助于寻找限速步骤；在进行生化试验时根据米氏公式计算工具酶的用量。

4、影响酶促反应的因素：1)底物浓度2)酶浓度3)温度4)pH5)激活剂（必需激活剂/非必需激活剂）6)抑制剂（使酶的催化活性下降但不引起变性的物质）5、酶活性的测定和酶活性单位酶的活性单位：在规定条件下，酶促反应在单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。

国际单位,在特定条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位。

催量单位，在特定条件下，每秒钟使1mol底物转化为产物所需要的酶量。

1IU=16.67×10-9kat方法：①选择适宜的底物②确定酶催化反应的温度，pH值，底物浓度，激活剂浓度等反应条件③在一定条件下，将一定量的酶与底物混合液混合均匀，适时记录反应开始的时间④反应到一定时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，检测产物的生产量和底物的减少量Lecture 3 基因工程的酶学基础&基因克隆表达的过程1、基因克隆常用的酶、应用及注意事项2、重组DNA技术操作的主要步骤3、酶工程：酶的生产、改性和应用的技术过程ZFN锌指蛋白+Fok1识别DNA的酶和Fok1核酸内切酶锌指蛋白结构域负责识别靶位点, 依赖FokI的作用打DNA双链,从而造成双链断裂，断开不是任意三联碱基组合都有对应的模块；上下文效应；脱靶现象严重；难度大Lecture5 酶的发酵生产Lecture6 酶的分离纯化6.1了解酶在细胞中的分布6.1.1胞外酶：由细胞产生后分泌到胞外发挥作用的酶，大部分属于水解酶，通常含量高容易得到。

6.1.2细胞内酶：在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性6.2 材料的获取微生物作为酶源的优越性：价格低廉，产量高；容易培养和管理：生长迅速，适应性强；产酶稳定性好；利于分离纯化。

6.3分离纯化的技术路线：离心分离：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程要根据欲分离物质以及杂质颗粒大小密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。

过滤与膜分离：非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质电泳分离：纸电泳用滤纸作为支撑介质多用于核苷酸的定性定量分析。

醋酸纤维素薄膜电泳常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存琼脂糖凝胶电泳一般用于核酸的分离分析聚丙烯酰胺凝胶电泳核酸和蛋白质的分离纯化及检测，分辨率较高蒸发浓缩超滤浓缩浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的吸水浓缩利用葡聚糖凝胶的吸水特性，干胶直接加入样品溶液，吸水嘭润后在过滤或离心。

聚乙二醇PEG反复冻融浓缩利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。

沉淀法盐析法，有机溶剂法6.6酶的干燥6.7酶的结晶常用的结晶方法是：透析平衡结晶法——将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。

6.8 纯化方案的设计与评价6.8.1纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据1、根据有效成分和杂质之间理化性质的差异调节溶解度：沉淀法2、根据分子大小、形状的不同：离心分离，膜分离，凝胶过滤2、根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳4、根据专一性结合的方法：亲和层析5、其它：吸附层析，疏水层析（二）纯化方法的排序先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。

精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。

6.8.2纯化方案的评价酶的定量并非是对按白虎进行定量而是对它的催化能力进行定量；所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶的促反应速度。

酶活力的测定：在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应液，用适当方法停止其反应后，再根据产物和底物在物化性质上的差别进行分析，求得单位时间的酶促反应变化量。

常用的方法：化学分析法（比色法）：产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液。

分光光度法：利用底物和产物光吸收性质的不同。

量气法：酶促反应中产物或底物之一为气体。

滴定法（pH值测量法）：产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。

多用pH电极测。

提纯倍数与回收率：每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数酶比活力=酶活力单位数/酶蛋白质量纯化倍数=提纯后比活力/提纯前比活力（方法的有效程度）总活力=酶活力单位数*酶液总体积回收率=提纯后酶总活力/提纯前酶总活力×100%（反应酶的损失情况）Lecture7 酶的修饰1.原因——天然酶的缺陷易于变性失活；酶的活性不够；容易受产物和抑制剂的影响；工业生产的条件达不到酶的最适反应条件；底物不溶于水或者酶的米氏常数过高；酶作为药物在体内的半衰期等因素限制酶制剂的应用；具有抗原性。

2.化学酶工程——通过分子修饰的方法改变已分离出来的天然酶的活性定义：对酶在分子水平上用化学方法进行改造，在体外通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术。