发酵工程实验讲解
发酵工程实验讲解
发酵工程实验目录实验一发酵罐的结构系统及使用方法实验二微生物的诱变育种实验三乳酸菌的分离及乳酸饮料制作实验四大肠杆菌生长曲线的测定实验五摇床培养枯草芽孢杆菌发酵条件的优化实验一发酵罐的结构系统及使用方法一、实验目的：1．了解发酵罐（气升式、搅拌式）的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。
2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法二、实验原理：1．蒸汽系统：三路进汽——空气管路、补料管路、罐体2．温度系统：(1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。
(2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。
3．空气系统：取气口→空压机：往复式油泵获得高脉冲的压缩空气粗过滤器：由沙布包裹棉花压实成块状叠加制得，作用是去除部分细菌及大部分灰尘（贮气罐）：空压机压缩使气体温度升高，经贮气使气体保温杀菌；压缩空气中有油污、水滴，且压力不稳，有一定的脉冲作用，会冲翻后面的过滤介质，贮气后可使油滴重力沉降，减小脉冲。
（冷却塔）：有降温并稳定作用，同时经旋风分离器进行气液分离(丝网分离器)：通过附着作用，逐步累积沉降而分离5微米以上的微粒其作用介质为铜丝网(加温器)：对压缩空气升温，除湿，使湿度达50%-60%总过滤器：纱布包裹棉花加活性炭颗粒，逐层压紧而成。
分过滤器：平板式纤维，中间为玻璃纤维或丝棉，下面放水阀应适时打开放出油、水，再用压缩空气控干。
种子罐或发酵罐4．补料系统：补培养基、消泡剂、酸碱等。
5．在线控制系统：热电偶（温度探关）、溶氧探头、pH探头（后二者实消时才安装，为不可再生探头，有限定使用次数，pH探头使用前要先校准）、控制柜、数据采集系统。
6、进出料系统：进料口(接种口)、出料口(取样口)。
7．蒸汽过滤器：在蒸汽进入空气系统时应用，以免蒸汽中携带的杂质颗粒堵塞分过滤器微孔。
三、方法与步骤：(一)原则：1．通蒸汽前先关闭所有阀门。
发酵工程实验讲义2
实验三产淀粉酶培养条件的优化一．实验目的掌握发酵工艺参数的单因素优化实验设计和操作方法。
二．原理在工业化发酵生产中，培养条件的设计是十分重要的，因为培养基的成分和培养条件对菌体生长和产物浓度都有重要的影响。
单因素方法的基本原理是保持培养基组分和培养条件中其余参数不变，每次只研究一个参数的不同水平对发酵过程的影响。
这种策略的优点是简单易操作，结果明了而不需要统计分析。
这种策略的主要缺点是：忽略了组分间的交互作用，可能会完全丢失最适宜的条件；不能考察因素的主次关系；当考察的实验因素较多时，需要大量的实验和较长的实验周期。
三．材料与仪器1. 活材料出发菌株选取复筛实验中酶活最高的一株。
2. 器材三角瓶、容量瓶、吸管、烘箱、试管架、吸耳球、称量纸、分光光度计、烧杯、恒温水浴锅、离心机、电磁炉、接种环、酒精灯、无菌操作台、灭菌锅和恒温振荡培养箱。
四．方法与步骤1. 摇瓶培养基的配制1) 种子培养基：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，NaCl 5 g，加蒸馏水定容至1 L，调节pH 至7.0，每瓶装20 mL培养基，121 ℃灭菌20 min备用。
2) 基础发酵培养基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨10 g，酵母膏3 g，加蒸馏水定容至1 L，调节pH至7.0。
3) 发酵培养基：每组进行相应序号的实验，每个水平重复2瓶，碳氮源培养基分开灭菌，碳源部分为可溶性淀粉（或其余替代碳源），每个试管装液15 mL，其余组分为氮源部分，每瓶装液体培养基35 mL，121 ℃灭菌20 min备用。
2. 接种从保存的甘油管中取50 μL菌液，转接至装有种子培养基的三角瓶中培养24小时，培养温度37 ℃，摇床转速200 rpm。
24小时后以4%接种量，转接至装有发酵培养基的三角瓶中进行扩大培养24 h，培养温度37 ℃，摇床转速200 rpm。
3. 离心取发酵液1 mL于高速离心机12000 rpm离心10 min，取上清即为粗酶液。
发酵工程实验讲义
发酵⼯程实验讲义发酵⼯程实验（适合发酵⼯程原理与技术）张建国⽤前沿发酵⼯程（Fermentation Engineering）属于⽣物技术的范畴，⽣物技术⼜称⽣物⼯艺学现代⽣物技术作为⼀门新兴的⾼科技术产业，它的⽣命⼒在于他对社会经济和发展的各个⽅⾯都带来了极⼤冲击和影响。
发酵⼯程是指在最适发酵条件下，发酵罐中⼤量培养细胞和⽣产代谢产物的技术。
发酵⼯程由于涉及到⽣物催化剂，因⽽与化学反应有关。
由于⽣物技术的最终⽬标是建⽴⼯业⽣产过程为社会服务，因⽽该⽣产过程可称为⽣物反应过程（亦称为⽣化反应过程）。
在发酵技术中⼀般包括微⽣物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利⽤固定化酶，固定化细胞所做的反应器加⼯底物（即有⽣化催化剂参加），以及培养加⼯后产物⼤规模的分离提取等⼯艺。
主要是在⽣物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。
如酸碱度、湿度、底物浓度、通⽓量以及保证⽆菌状态等研究内容。
⽣物技术产品具有多样性，各个学校的教学资源和课时不同，所进⾏的实验种类不同。
本实验内容根据本校的具体条件进⾏安排。
安排的思路是以最简洁有效的⽅式针对发酵过程的重要要素进⾏实验，便于学⽣对教学内容有个较好的认识，理顺学习思路，为进⾏社会科学实践打下良好基础。
第⼀篇野⽣型菌株的筛选经典的发酵产物来⾃微⽣物，⼟壤是微⽣物的⼤本营。
⽣产菌株的选育源头都来⾃于⾃然界。
如何从⾃然界中筛选⽬的微⽣物，可以根据⽬的微⽣物和产物的特性作为筛选条件，进⾏筛选提⾼筛选效率，从⽽有效的解决菌株从⽆到有的问题。
实验⼀产淀粉酶菌株的筛选（4学时）⼀．实验⽬的筛选⼀株能够合成分解淀粉的微⽣物。
⼆．原理⾃然界微⽣物种类繁多，有些微⽣物能够以淀粉作为碳源进⾏⽣长繁殖是因为它们能够合成分泌淀粉酶，因此我们能够从⾃然界中定向分离出合成淀粉酶的微⽣物。
当能合成淀粉酶的微⽣物在固体培养基中⽣长时，会将淀粉酶分泌到菌体周围，将菌落周围的淀粉⽔解成为⼩分量的糊精、聚糖和单糖。
发酵工程实验讲义(含生技生工)
实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时）实验类型：综合性实验目的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。
2、了解市售酸奶的生产工艺。
3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。
实验原理：乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。
乳酸菌属于兼性厌氧微生物，其在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。
实验内容：（一）酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热水（80℃左右）中，充分搅拌均匀，配成调制乳；2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶的口味，在调制乳中加人4-8％的蔗糖。
3、灭菌：方法有两种：将乳加热至90℃，保温5min；4、接种：往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加入乳酸菌，接种量为2%-5%。
5、分装：酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进行分装，须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到小容器中，加盖后送入恒温室培养，在小容器中发酵制成酸奶。
6、发酵：发酵的温度保持在40-43 ℃，一般发酵时间为3-6h。
发酵终点的确定有两种方法：1）检测发酵奶的酸度，达到65-70 T°。
2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，而且瓶中部有细微颗粒出现。
7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，用冷风迅速将其冷印到10℃以下，一般2 h，使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。
8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。
9、感官指标1）色泽：色泽均匀一致，呈乳白色，或稍带微黄色。
2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。
3）气味、味道：具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。
（二）乳酸菌活菌检测①、检测培养基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉10g，水1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。
发酵工程实验的实验报告
一、实验目的1. 了解发酵工程的基本原理和操作方法。
2. 掌握发酵过程中菌种培养、培养基配制、发酵条件控制等基本技能。
3. 熟悉发酵过程中产物生成的监测方法。
二、实验原理发酵工程是指利用微生物的代谢活动，将生物质资源转化为人类所需产品的一门综合性工程技术。
本实验以谷氨酸棒杆菌为研究对象，通过摇瓶发酵的方式，探究其在适宜条件下对葡萄糖的转化率及谷氨酸的生成情况。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：摇床、锥形瓶（250ml）、移液管、pH计、生物传感仪、分析天平、发酵培养基、葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、EDTA钠、氯化钠等。
2. 试剂：葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、EDTA钠、氯化钠等。
四、实验步骤1. 培养基配制：按照实验要求，称取葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、EDTA钠、氯化钠等试剂，加入适量的去离子水，充分溶解后，调节pH至7.0，定容至1000ml。
2. 菌种活化：从菌种保藏管中取出谷氨酸棒杆菌，接种于装有适量培养基的锥形瓶中，置于摇床上，37℃恒温培养24小时。
3. 接种：将活化后的菌种以1%的接种量接种于新鲜培养基中，置于摇床上，37℃恒温培养。
4. 发酵过程监测：每隔2小时取样，测定还原糖含量、谷氨酸含量、pH值等指标。
5. 数据处理与分析：将实验数据绘制成曲线，分析发酵过程中还原糖消耗、谷氨酸生成、pH值变化等规律。
五、实验结果与分析1. 还原糖消耗曲线：在发酵过程中，还原糖含量逐渐降低，表明谷氨酸棒杆菌在消耗葡萄糖的同时，产生谷氨酸。
2. 谷氨酸生成曲线：在发酵过程中，谷氨酸含量逐渐升高，表明谷氨酸棒杆菌在适宜条件下能够高效地将葡萄糖转化为谷氨酸。
3. pH值变化曲线：在发酵过程中，pH值逐渐下降，表明谷氨酸棒杆菌在代谢过程中产生酸性物质。
六、实验结论1. 本实验成功实现了谷氨酸棒杆菌的摇瓶发酵，为谷氨酸生产提供了实验依据。
发酵工程实验指导
实验一淀粉酶生产菌的筛选一、实验目的学习淀粉酶产生菌的筛选方法。
二、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域有广泛用途。
淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。
三、实验用品1．样品淀粉含量丰富的土样。
2．培养基肉汤培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至1000ml，pH7.0。
121℃灭菌20min。
初筛平板培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂18g，加水至1000ml，pH7.4。
121℃灭菌20min。
Lugol碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。
先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水即可。
3．器材高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，电子天平，电炉，恒温振荡器，恒温培养箱；烧杯，量筒，三角瓶，培养皿，移液管，洗耳球，试管，试管架，接种针，涂布棒。
四、实验方法1．培养基制备：配制肉汤培养基45ml，分装于250ml三角瓶中，纱布封口，灭菌。
配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。
2．倒平板：将融化的初筛平板培养基冷却至50～60℃，以无菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，至盖满底部。
冷却凝固待用。
3．样品预处理：取5g土样接入45ml肉汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。
另取4支试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每支试管内加入9mL 无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液，加入到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-3试管中，依此类推直至10-5试管。
4．平板涂布分离：分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24～48h。
发酵工程实验讲义2010129
----10升发酵罐的分批发酵［实验目的］通过本实验加深对发酵罐结构原理和分批发酵原理的认识，了解工业发酵的基本工艺和方法并掌据相关发酵参数的测定方法。
［实验原理］一、分批发酵原理分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内，在此简单系统内所有液体的流量等于零。
它的一个显著特点是培养基一次性加入，产品一次性收获，分批发酵是目前广泛采用的一种发酵方式。
分批发酵过程一般可以粗分为四期：停滞期、对数生长期、稳定期和衰退期。
停滞期，即刚接种后的一段时间，细胞数目和菌量不变，因菌对新的生长环境又一适应过程，其长短主要取决于种子的活性、接种量和培养基的可利用性和浓度。
当细菌已经适应新的环境，养料充足而又无抑制生长的物质，便进入对数生长期，其比生长速率达到最大。
随着养料的减少，有害代谢产物的积累，生长不可能再无限制地继续。
此时比生长速率为养分、代谢产物和时间的函数，其细胞量仍在增加，但其比生长速率不断下降，细胞在代谢与形态方面逐渐退化，经短时间的减速后进入稳定期，此时净生长速率为零。
当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入死亡期，此时生长呈负增长。
工业发酵一般不会等到菌体开始自溶时结束培养。
（图例）微生物四个时期的生长曲线其优点是：①对温度的要求低，工艺操作简单；②比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；③对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。
缺点是：①人力、物力、动力消耗较大；②生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段；③生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中代谢产物的g 数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。
二、发酵罐结构原理（工作原理）发酵系统由发酵罐、空气处理系统、蒸汽净化系统、电气控制系统、恒温系统及管道、阀门等组成。
发酵工程实验方案
发酵工程实验方案1. 实验目的：通过对发酵工程的影响因素进行研究，探究各个因素对发酵过程的影响，为发酵工程的优化提供理论依据。
2. 实验原理：发酵工程是一种利用微生物、酶或细胞来合成有机物的过程。
在发酵过程中，影响因素包括温度、pH值、氧气浓度、营养物质和微生物种属等。
这些因素对发酵过程有着重要的影响，可以影响发酵产物的产率和品质。
3. 实验步骤：3.1 实验材料准备：- 试验用微生物：选择一种常见的发酵微生物，如酵母菌或乳酸菌。
- 培养基：根据微生物的需要选择合适的培养基，如葡萄糖、蛋白胨等。
- pH计、温度计、氧气传感器等实验仪器。
3.2 实验设计：- 实验方案一：对温度的影响将培养基和微生物接种到培养瓶中，并设置不同的温度条件（如25℃、30℃、35℃、40℃），观察发酵产物的产率和品质。
- 实验方案二：对pH值的影响将培养基和微生物接种到培养瓶中，然后调节培养基的pH值分别为5、6、7、8，观察发酵产物的产率和品质。
- 实验方案三：对氧气浓度的影响使用氧气传感器监测不同氧气浓度下的发酵过程，观察发酵效率和产物的产率。
- 实验方案四：对营养物质的影响在培养基中添加不同浓度的营养物质，比如氮源、碳源等，观察其对发酵产物的影响。
- 实验方案五：对微生物种属的影响改变培养基中的微生物种属，观察不同微生物对发酵产物的影响。
3.3 数据记录和分析：- 对每组实验数据进行记录，并进行数据分析，比较各个因素对发酵过程产物的影响。
4. 实验结果预期：通过对以上实验设计，可以得出不同因素对发酵工程的影响程度，找出最适合的发酵条件。
5. 实验结论：通过数据分析和实验结果，得出各个因素对发酵过程的影响程度，并得出最优的发酵条件。
6. 实验风险评估：实验过程中需要注意微生物的无菌操作，避免污染，确保实验安全。
7. 实验总结：通过对发酵工程的影响因素进行研究，可以为工业生产的发酵工艺提供参考和优化方案，为生产高品质的发酵产品提供理论支持。
发酵工程实验讲义1
实验一产淀粉酶菌株的复筛一．实验目的从琼脂平板上划线分离的单菌落中进行筛选定量确定一株为高产淀粉酶生产菌。
二．原理自然界有些微生物能够利用淀粉作为碳源，是因为它们能够合成分泌淀粉酶，因此我们能够从自然界中定向分离出合成淀粉酶的微生物。
琼脂平板活性测定方法，可以简便、快速地进行初筛，但是难以得到确切的产量水平，要进一步确定生产优良性状的菌株就有必要对其进行摇瓶复筛，定量确定其生产水平，更准确的确定优良性状的菌株。
三．材料与仪器1. 材料（出发菌株每组选取3个单菌落）蛋白胨，酵母抽提物，NaCl，可溶性淀粉，葡萄糖（分析纯），甘油，蒸馏水和DNS 试剂。
2. 仪器三角瓶、容量瓶、吸管、烘箱、试管架、吸耳球、称量纸、分光光度计、烧杯、恒温水浴锅、离心机、电磁炉、接种环、酒精灯、无菌操作台、灭菌锅和恒温振荡培养箱。
四．方法与步骤1. 摇瓶培养基的配制种子培养基：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，NaCl 5 g，加蒸馏水至1L，调节pH=7.0，每瓶分装20 mL，121 ℃灭菌20 min备用。
发酵培养基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，加蒸馏水定容至1000 mL，调节pH=7.0，每瓶分装50 mL，121 ℃灭菌20 min备用。
2. 接种从琼脂平板上选取若干单菌落，以接种环挑入装有种子培养基的三角瓶中进行培养24小时，培养温度37 ℃，摇床转速200 rpm。
24小时后以4%接种量，转接至装有发酵培养基的三角瓶中进行扩大培养48 h，培养温度37 ℃，摇床转速200 rpm，另外保存种子液于甘油管并做好标记。
3. 离心取发酵液12500 rpm离心10 min，取上清。
4. 淀粉酶活力的测定比色法测定淀粉酶的活力。
五．结果本组数据确定最优生长性状的淀粉酶菌株为________实验二DNS法测定发酵液中淀粉酶活力一．原理淀粉酶与可溶性淀粉在一定条件下反应，生成还原糖，在碱液中还原糖3,5-二硝基水杨酸反应后生成棕红色3-氨基-5-硝基水杨酸化合物，在一定的还原糖浓度范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测定样品中的含糖量，从而计算出酶活力的大小。
发酵工程实验技术
发酵工程实验技术乳酸发酵工艺及过程检测乳酸及其乳酸盐，在化工、医药和食品加工等各行各业有这广泛的用途。
作为一种传统的多用途精细化学品，乳酸可作为酸味剂、芳香剂、防腐剂、植物生长调节剂、生物可降解性材料、药物和农药等，广泛用于食品、制药、酿造、制革、纺织、环保和农业中。
乳酸的生产方法主要有化学合成法和发酵法。
化学合成法只能合成DL-乳酸，而发酵法根据所采用的菌株的不同，可以合成单一的L-乳酸，D-乳酸或者DL-乳酸。
L-乳酸的光学纯度对聚乳酸的聚合至关重要。
与化学法生产乳酸相比，发酵法生产乳酸具有产物光学纯度高、原料来源广泛、生产成本低等优点，是生产乳酸的主要方法。
根据菌株的不同，微生物发酵法可以合成单一的L-乳酸、D-乳酸或者DL-乳酸。
发酵法生产乳酸的菌种主要有细菌和根霉菌两类，与根霉相比，虽然细菌乳酸发酵营养要求较复杂，但其大多属于厌氧或微厌氧发酵，动力消耗小，产酸量高，糖酸理论转化率可达100%，更有利于降低成本。
1.材料与方法1.1材料1.1.1仪器常温离心机Unico2100可见分光光度计30L发酵罐40c SBA生化分析仪（山东省农科院研究所）1.1.2药品葡萄糖为工业葡萄糖，琼脂粉，酵母粉，蛋白胨，碳酸钙均为分析纯。
1.1.3培养基（1）斜面培养基：葡萄糖20g/L，琼脂粉18g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳酸钙10g/L。
pH 6.5~7.0。
（2）种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳酸钙10g/L。
pH 6.5~7.0。
（3）发酵培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳酸钙40g/L。
115℃，30min灭菌。
pH 6.5~7.0。
葡萄糖浓度：第一组50g/L,第二组60g/L,第三组70g/L,第四组80g/L。
1.2方法1.2.1发酵培养方法（1）菌株活化从斜面上刮一环菌体接种到新鲜的斜面培养基上，50℃静置培养10h以上至生长良好。
发酵工程实验指导课件
（通过产酸特性直接鉴定）
发酵工程实验指导
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实验三 乳酸菌菌种的培养与保藏
分离得到的乳酸 菌菌株（编号）
斜面移接与 培养(每一株）
注意点： 注明菌种编号与日期；
如Lcd131,Lcd132；
（例：陈丹，第一组第3位同学）
第一阶段结束，总结
安排一周完成
发酵工程实验指导
1株保藏 1株待以下
实验用
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发酵工程实验指导
2
实验内容设计
第一部分：乳酸菌的分离、筛选与保藏
第二部分：乳酸菌的培养与发酵测定
附上：实验原始记录 实验一：实验准备 实验二：乳酸菌的分离与筛选 实验三：菌种培养与保藏 实验四：乳酸菌的发酵培养 实验五：乳酸菌发酵测定与产物分析
实验报告撰写基本格式
一、实验目的与意义及原理等 二、材料与方法（或步骤） 三、结果与分析 问题回答
发酵工程实验指导
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第二部分 实验四 乳酸菌培养与发酵测定
总实验流程
实验乳酸 菌菌株
斜面移接 活化
菌种移接至发酵 三角瓶，培养
细胞生长测定
（自选）
（细胞生物量g/L：离心测菌体重量； 混浊度描述）
产酸变化
（测定pH变化：酸度计）
发酵产物乳酸定 性分析（E3）
（薄层层析法）
注意点：
新保存的菌株可直接发接酵工种程实，验指导不必再活化。10Biblioteka 说明发酵培养基的配制
接种3环
培养瓶包扎方法
发酵工程实验指导
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细胞生长的测定
细胞湿密度：单位体积(ml)发酵液菌体的重量g（湿重）; 方法：取一定量(ml)发酵液，经离心去除上清液，菌
体称重。
细胞浓度：单位体积(ml)活细胞数(cfu)，单位:cfu/ml 方法：取一定量(ml)发酵液，经适当稀释后。倒平板培养
发酵工程实验
西南民族大学
生命科学与技术学院
实验一 发酵罐安装使用及其KLa的测定
一、发酵罐的安装及使用 1.实验目的和要求： 学习发酵罐的安装调试，掌握发酵罐的 使用方法。 2.实验步骤： 1）发酵罐的整体结构介绍 2）发酵罐的安装 3）发酵罐的调试
二、发酵罐KLa的测定
1.实验目的和要求： 了解发酵过程中Kla的测定及其影响因素。 2.原理 3.实验步骤： 1）将配置好的1.6升亚硫酸钠和硫酸铜倒 入发酵罐，开始通气搅拌，定时取样。 2）用碘量法测定剩余的亚硫酸钠的量，最 后用硫代硫酸钠进行测定，记下消耗的 硫代硫酸钠的量。
实验三
固定化细胞发酵
1.固定化技术的发展 固定化酶技术的发展 固定化微生物细胞技术的发展 2术与固定化酶技术的比较 固定化细胞技术的优势在于以下四个方面： 1）不需提纯和精制
2）发酵过程易于控制 3）能够允许高负荷载体 4）适合多系统反应 3.实验目的和要求 了解和掌握固定化细胞发酵的方法 4.实验原理 本次实验是用海藻酸钠包埋法 包埋法是将微生物细胞均匀地包埋在水
常用菌种
– 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌 – 嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌和乳酸菌
凝固型酸奶的制作流程 鲜奶 净化 脂肪含量标准化 配料 过滤 预热 均质 杀菌 冷却 接种 分装 发酵 冷却 后熟 净化：除去白血球和其它异物
脂肪含量标准化：脂肪含量过高，会使 发酵后在酸奶表面有脂肪析出。可以在 高脂肪的牛乳中加入脱脂奶等。 均质：使乳脂肪充分分散，酸奶的硬度 和黏度都有所提高。 杀菌：90℃，5min或85 ℃,30min UHT法：135 ℃,2~3s 后熟：低温放置。
一、实验的目的和要求 了解发酵过程中各个因素对微生物生长 的影响，掌握微生物生长过程中的生长 规律及外界因素对其的影响。 二、原理 三、实验步骤： 1. 菌种：枯草芽孢杆菌
微生物发酵工程实验
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❖ 周四上午，取样测定（细菌数量、pH、还原 糖、杂菌率等）
❖ 周四下午，取样测定（细菌数量、pH、还原 糖、杂菌率等）
❖ 周五上午，放罐，清洗发酵罐；计数摇瓶实验 结果
❖ 周五下午，喷雾干燥。
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优化磷细菌发酵培养基的碳源（单因子实验）
❖ 菌种：无机磷细菌 ❖ 培养基
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灭菌培养基无菌度测定
❖ （1）显微镜观察法
▪ 利用刚果红染色法可以在显微镜下快速区别死活菌。 ▪ 原理：活菌具有排斥染液的能力，而死菌失去了排斥染液的
能力，因此，无色透明的是活菌，死菌为蓝色或浅蓝色。 ▪ 方法：将待测稀释液与一滴刚果红染色液很薄的均匀涂在载
玻片上，风干后滴盐酸1-2滴，涂片变蓝，风干后在高倍镜或 油镜下观察。 ▪ 刚果红溶液：称取刚果红0.1-0.2 g，溶于10 mL水中。 ▪ 盐酸酒精溶液：95%酒精1-2 mL，蒸馏水10 mL，再加入浓 盐酸0.25-0.3 mL混合即成。
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❖ 实验步骤
▪ 配制培养基，分装于150或250 mL三角瓶，包扎 后，115 ℃灭菌20 min。发酵培养基A/B/C/D各3 瓶。
▪ 接种，接种量1%。 ▪ 培养，28 ℃、150 rpm培养18-24 h. ▪ 测定细胞数量，取发酵液1 mL系列稀释，取0.1
mL菌液涂布无机磷培养基， 28 ℃恒温培养3 d 后计数。
① 问题：用于接种发酵罐，接种量5%，请问7L培 养基需要多少菌种用量？
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❖ 种子接入发酵罐
▪ 种子质量检查（包括哪些项目？分别用什么方 法？）
▪ 接种前还需要做什么？
▪ 火圈接种法
培养基灭菌质量检查
① 接种后需要做什么？
发酵工程实验(1)
发酵工程实验指导前言发酵工程是整个生物工程的核心，是工业微生物实现实验室与工厂化生产的具体操作，是生物技术在生产实践中应用的原理及方法的一部分，是基因工程及酶工程等生物技术工业化的过程与方法。
同时随着生物技术的发展，发酵工程技术理论已广泛应用于生物制药技术、植物细胞培养及动物细胞培养技术等新兴领域。
因此，通过对发酵工程课程的学习，不仅掌握发酵工程原理及发酵优化控制过程，而且对系统了解生物技术及其工业化应用都具有深远的意义。
通过发酵工程实验及发酵工程各论的学习，不仅能够掌握发酵工艺操作的具体过程及反应过程控制方法，而且进一步了解目前发酵行业的具体产品生产工艺，对发酵生产能够进行指导与分析。
为学生将来进入研究生阶段的课题研究、进入发酵及相关行业工作以及新产品开发打下基础。
本实验根据发酵工程的共性技术选编了代表性的实验，涉及工业菌种分离、诱变选育、发酵过程优化、流加发酵技术、发酵罐使用及发酵实验等，基本上覆盖了发酵工程基本实验技术和发酵理论，其中主要以课题组研究成果为基础，通过对出芽短梗霉菌株的自然界筛选、富集、分离等手段，获得特定目的产物的高产菌株，大部分为创新性设计实验。
本实验指导可可用于制药工程专业微生物制药课程的实验指导参考，亦可应用于生物技术专业发酵工程课程的配套实验指导书。
课题组研究生阳静、李虹庆、李天夫等同学参与编写和指导，同时收集了与实验有关的参考书，供同学们参考。
发酵工程实验涉及水、电、气、蒸汽的使用及发酵设备安全操作，每位实验参与者应遵守实验室规章制度和实验要求。
实验一高产聚苹果酸菌株筛选分离一、实验目的（1）在自然界中筛选高产聚苹果酸的出芽短梗霉菌株。
（2）掌握并学习筛选及鉴定出芽短梗霉的方法二、实验原理出芽短梗霉属于真菌界，半知菌门，丛梗孢目，暗色丛梗孢科，短梗霉属。
出芽短梗霉是一种腐生真菌，广泛存在于自然界中，出芽短梗霉在自然界中分布比较广泛，主要集中在植物叶片、花瓣、树皮以及海洋中，自然界分离到的不同亚种在各种培养条件下菌落形态有所差异，主要表现在不同色素和胞外多糖的分泌引起的变化，一般情况下，培养前期菌落圆润而粘稠随着菌龄增加会出现粉红色、黄色或者黑色，菌落逐渐平整圆滑(图 1.2)。
发酵工程实验指导
一、实验目的1、熟悉泡菜加工的工艺流程，掌握泡菜加工技术。
2、在实践中验证理论上泡菜加工中发生的一系列变化。
二、实验原理利用泡菜坛造成的坛内嫌气状态，配制适宜乳酸菌发酵的低浓度盐水（6-8%），对新鲜蔬菜进行腌制。
由于乳酸的大量生成，降低了制品及盐水的PH值，抑制了有害微生物的生长，提高了制品的保藏性。
同时由于发酵过程中大量乳酸，少量乙醇及微量醋酸的生成，给制品带来爽口的酸味和乙醇的香气，同时各种有机酸又可与乙醇生成具有芳香气味的脂，加之添加配料的味道，都给泡菜增添了特有的香气和滋味。
三、实验材料与设备（1）泡菜坛子（2）不锈钢刀（3）案板（4）小布袋（用以包裹香料）等四、实验方法和步骤1、盐水参考配方（以水的重量计）：食盐 6-8%、白酒 2.5%、黄酒 2.5%、红糖或白糖 2%、干红辣椒 3%、草果 0.05%、八角菌香 0.01%、花椒 0.05%、胡椒0.08%、陈皮 0.01% 。
2、工艺流程配制盐水入坛泡制泡菜管理原料预处理（4）泡菜的管理①入坛泡制1-2日后，由于食盐的渗透作用原料体积缩小，盐水下落，此时应再适当添加原料和盐水，保持其装满至坛口下1寸许为止。
②注意水槽：经常检查，水少时必须及时添加，保持水满状态，为安全起见，可在水槽内加盐，使水槽水含盐量达15%-20%。
③泡菜的成熟期限：泡菜的成熟期随所泡蔬菜的种类及当时的气温而异，一般新配的盐水在夏天时约需5-7天即可成熟，冬天则需12-16天才可成熟。
叶类菜如甘蓝需时较短，根类菜及茎菜类则需时较长一些。
六、讨论题影响乳酸发酵的因素有哪些？实验二淀粉水解糖的制备一、目的学习并掌握淀粉水解糖的酶法制备工艺。
二、实验原理发酵生产中，部分产生菌不能直接利用淀粉，也基本上不能利用糊精作为碳源。
因此，当以淀粉作为原料时，必须先将淀粉水解成葡萄糖才能供发酵使用。
在工业生产上将淀粉水解为葡萄的过程为淀粉的“糖化”，所制得的糖液称为淀粉水解糖。
发酵工程试验指导资料
实验 1 K L a 的测定方法氧是难溶气体，在25℃和1个大气压下，纯水中溶解度为0.25 mol/m 3左右。
在好氧发酵过程中，氧气由气相传递到液相，为微生物消耗。
氧的传递过程限速阻力位液膜阶段，此时K l a 是描述氧的传递性能的重要参数。
1.目的掌握利用亚硫酸盐测定容积氧体积传递系数的方法，了解氧传递在好氧发酵过程中的重要作用。
2原理以Cu 离子为催化剂，溶解于水中的O 2能立即将水中的SO 32-氧化为SO 42-，其氧化反应的速度几乎与SO 32-浓度无关。
实际上是O 2一经溶入液相，立即就被还原掉。
这种反应特性使溶氧速率成为控制氧化反应的因素。
其反应式如下：2Na 2SO 32 2SO 4 剩余的Na 2SO 3与过量的碘作用 Na 2SO3 + I 2 + H 2O Na 2SO4 + 2HI 剩余的I 2用标准Na 2S 2O 3溶液滴定。
I 2+ 2Na 2S 2O 3 Na 2S 4O 6+2NaI∆O 2 ~ ∆Na 2SO 3 ~ ∆I 2 ~ ∆Na 2S 2O 3 1 2 2 4可见，每溶解1mol O 2，将消耗2mol Na 2SO 3，将少消耗2mol I 2，将多消耗4mol Na 2S 2O 3。
因此可根据两次取样滴定消耗Na 2S 2O 3的摩尔数之差，计算体积溶氧速率。
公式如下：090036004tV VMtV VM N V ∆∆=⨯∆∆=式中 N V ：两次取样滴定消耗Na 2S 2O 3体积之差，M ：Na 2S 2O 3浓度， t ：两次取样时间间隔，h V 0：取样分析液体积。
将上述N V 值代入公式CC N a k VL -=*即可计算出k L a由于溶液中SO3-2在Cu2+催化下瞬即把溶解氧还原掉，所以在搅拌作用充分的条件下整个实验过程中溶液中的溶氧浓度C=0。
在0.1Mpa(1atm)下，25ºC时空气中氧的分压为0.021MPa，根据亨利定律，可计算出C*=0.24mmol/L，但由于亚硫酸盐的存在，C*的实际值低于0.24mmol/L，因此一般规定C*=0.21mmol/L。
发酵工程实验实验指导书
发酵工程实验实验指导书发酵工程实验指导书（2022年版）宁波大学海洋学院二千零二十一点零九发酵工程实验指导书目录实验一乳酸菌的分离与初步筛选实验实验2实验三实验4实验五实验6乳酸菌的初步鉴定实验乳酸菌菌种保藏实验乳酸菌的培养与发酵实验乳酸菌发酵产物的分析与测定发酵罐操作培训发酵工程实验指导书（2021版）实验一乳酸菌的分离与初步筛选一、实验目的及要求1.掌握从环境样品中分离所需微生物的一般操作。
2.掌握平板划线分离应变的原理和操作方法。
3.掌握透明圈法获得单菌落菌株的原理。
2、实验原理自然样品中存在混杂的微生物，通过选择性培养基及样品稀释使形成细胞分散液，再通过固体培养基在合适的培养条件下培养形成单菌落，由此得到分离的纯培养菌株。
乳酸菌最基本的代谢特性是发酵产酸，待分离样品在合适的培养基和培养条件下，乳酸菌在特定设计的培养基中由于生长产酸产生溶钙形象，从而在培养基中产生透明圈，透明圈直径大小可反映菌落生长产酸量的大小，而不是乳酸菌或不产生酸积累的细菌不能产生透明圈。
三、实验器材1.使用单独的样品（泡菜、各种泡菜、酸奶、植物汁等）；2.培养基：MRS培养基或改良乳酸菌分离培养基；无菌水；3、器皿与设备：培养皿、移液管、试管、三角瓶、接种环、涂布棒、超净工作台、天平、采样瓶，培养箱等4、方法和步骤1。
分离样品的采集和采样说明：结合乳酸菌的特性（文献综述），获得乳酸菌在自然界或相关产品中的分布规律，设计样品的采集范围。
采集样品经适当保存或立即处理。
2、菌种的分离称取5g或5ml样品？将其添加到45 ml无菌三角烧瓶中（最好30℃恒温处理20分）？充分振动（包括玻璃珠）使其自然沉淀？用1ml移液管将1ml上清液悬浮液吸入9ml无菌水试管中？连续稀释10次至10-4~10-5？用移液管将1ml细菌悬浮液移到含有碳酸钙的MRS培养基中，并均匀涂抹？30℃恒温培养2~3天？观察菌落，挑出生长良好的带透明环的可疑乳酸菌单菌落，转移到普通乳酸菌培养基的倾斜试管中，对菌株进行编号，在30℃恒温下培养1~2天，并在4℃冰箱中保存，以备生长后使用。
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发酵工程实验目录发酵罐的结构系统及使用方法实验一实验二微生物的诱变育种乳酸菌的分离及乳酸饮料制作实验三实验四大肠杆菌生长曲线的测定摇床培养枯草芽孢杆菌发酵条件的优化实验五实验一发酵罐的结构系统及使用方法一、实验目的：1．了解发酵罐（气升式、搅拌式）的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。
2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法二、实验原理：1．蒸汽系统：三路进汽——空气管路、补料管路、罐体2．温度系统：(1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。
(2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。
3．空气系统：取气口→空压机：往复式油泵获得高脉冲的压缩空气粗过滤器：由沙布包裹棉花压实成块状叠加制得，作用是去除部分细菌及大部分灰尘（贮气罐）：空压机压缩使气体温度升高，经贮气使气体保温杀菌；压缩空气中有油污、水滴，且压力不稳，有一定的脉冲作用，会冲翻后面的过滤介质，贮气后可使油滴重力沉降，减小脉冲。
（冷却塔）：有降温并稳定作用，同时经旋风分离器进行气液分离(丝网分离器)：通过附着作用，逐步累积沉降而分离5微米以上的微粒其作用介质为铜丝网(加温器)：对压缩空气升温，除湿，使湿度达50%-60%总过滤器：纱布包裹棉花加活性炭颗粒，逐层压紧而成。
分过滤器：平板式纤维，中间为玻璃纤维或丝棉，下面放水阀应适时打开放出油、水，再用压缩空气控干。
种子罐或发酵罐4．补料系统：补培养基、消泡剂、酸碱等。
5．在线控制系统：热电偶（温度探关）、溶氧探头、pH探头（后二者实消时才安装，为不可再生探头，有限定使用次数，pH探头使用前要先校准）、控制柜、数据采集系统。
)取样口(、出料口)接种口(、进出料系统：进料口6．7．蒸汽过滤器：在蒸汽进入空气系统时应用，以免蒸汽中携带的杂质颗粒堵塞分过滤器微孔。
三、方法与步骤：(一)原则：1．通蒸汽前先关闭所有阀门。
2．粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。
3．活蒸汽，灭过头，即尾汽不能关死，要保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分压。
4．罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。
5．空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。
但空消一结束，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避免染菌。
6．进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门，结束时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，结束时先关主阀后关尾阀。
8．蒸汽一停，即由无菌空气充入保持罐内正压。
（二）空消：先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行：1．先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。
2．蒸汽先进空气系统，蒸汽→蒸汽过滤器→分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。
3．再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统（两边）。
4．罐压升至0.12Mpa(此时控制系统中温度读数约为120℃左右)时开始计时，保温保压，30分钟。
保压方式：（1）调节主汽路进汽阀门控制进汽量；（2）调节排气口排气量大小或尾阀放汽量。
5．结束空消：（1）逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。
（2）同时准备好压缩空气确保蒸汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。
近罐空气阀的尾阀要一直微开启。
注意：空消前应检查夹套中是否残留了冷水，若有，影响罐体升温，须自夹套出水口将水放出。
（三）进料及升温1、调大排气口排气量，至罐压掉零，开启进料口，加料。
装上溶氧探头及pH探头。
2．夹套升温：蒸汽由夹套蒸汽管路进入夹套进行升温（有表压可读出进入夹套的气压），温度可由控制面板上读出，升至90℃，关闭夹套蒸汽。
*升温目的：冷的物料和罐体中直接冲入蒸汽，极易产生大量冷凝水而使培养基中水分过大；另外，对淀粉质的物料，则直接通入蒸汽很容易使物料结球不溶，表面糊化结团，影响灭菌效果；升温还可以利于淀粉质原料液化。
*说明：(1)培养基配制时，考虑实消时会产生水分，因此，若考虑用7升的装液量(10 。
70%升需量称量。
装料系数一般为7升左右，其余物料按6，则加液量应为)升罐．（2）通蒸汽对夹套升温时，必须排空夹套内水(可用蒸汽冲出)，但可微开启出水口阀门适当减压，避免夹套内压力过大。
(四) 实消：1．关闭气路入罐阀，主汽路进汽→补料口进汽（方法同空消）→罐压升至0.12Mpa（121℃），保压、保温30分钟→实消结束。
（五）冷却接种：蒸汽关闭的同时，即通入压缩空气（罐压表头掉至0.05MPa时接入无菌空气）→夹套通入自来水冷却（下进水，上出水阀门，送水排水）→冷却至约32℃→接种（放大排气口出气量，至表头掉零，开启接种口，火圈接种）→接种后拧紧接种口，将排气阀调小，接上玻璃转子流量计，使流量计读数在8.0左右，同时保持罐压0.06Mpa→在控制系统中设定好发酵温度→保温保压发酵24hr（六）数据采集、取样、放罐数据采集：系统自动采集，每2分钟采集一组数据并存贮，包括：温度、溶氧、pH、等，系统可自动给出有关曲线。
同时由值班者每20分钟记录一次，准确填表，获取数据制作过程曲线。
中间取样：每取样前，将取样口蒸汽灭菌半小时→弃去始放出的样液约10毫升，再用无菌空容器取样约100毫升→无菌封存→取样口再灭菌30分钟→样液冷藏待测。
(具体步骤见电脑桌面文件)放罐：调节无菌空气量放罐，方法同取样。
(七) 罐体清洗放罐后，加大排气，使表压掉零，取出各探头，加盖，由进料口加入净水关好，罐内升压，放罐，如此重复两次。
*实验二紫外线诱变育种一．目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，学习微生物诱变育种的基本方法。
二．基本原理由于微生物自发突变率一般很低，为了提高突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变，紫外线是目前使用最方便且十分有效的物理诱变剂之一。
紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
三．菌种与仪器．菌种：枯草芽孢杆菌；培养基：仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机、培养皿、三角瓶、涂布棒等四．操作步骤（1）菌悬液的制备（a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。
（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
8个。
）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升10（c（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。
（3）紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。
（b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。
（c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。
-1-6（具体可10-10将上述经诱变处理的菌悬液以(4) 稀释在红灯下，10倍稀释法稀释成按估计的存活率进行稀释）。
-4-5-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板310只，每只平板加、10(5)涂平板取10、稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。
以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
(6)培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。
注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
(7)计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。
同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。
(8)观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。
分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。
与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。
并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。
此斜面可作复筛用。
五．实验结果1．结果将实验结果填入下表。
．稀释倍数平均菌落-4-5-6存活率% 致死率10%1010 处理时间（数/皿）诱变剂min）（对照紫外1U3比透明圈和菌落直径大小（㎜）及H652314HHHHHH处理处UV理对照实验三乳酸菌的分离及乳酸饮料的制作一、实验目的掌握从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化的方法和制作乳酸菌饮料技术，了解乳酸发酵的条件及乳酸菌的生长特性。
二、实验材料和用具嗜热乳酸链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus casei），乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。
BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基（MRS）、脱脂乳粉、蔗糖、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶（200 - 280mL）、培养皿、试管、300mL三角瓶、恒温水溶锅、酸度计、涂布棒等。
BCG牛乳培养基（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500Ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。
（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH 6.8，121℃湿热灭菌20min。
以无菌操作趁热将（A)、（B）溶液混合均匀后倒平板。
三、实验步骤（一）乳酸菌的分离纯化1、流程倒平板→制备梯度稀释液→涂布（或划线法）→培养→挑单菌落→保存。
2、步骤：稀释涂布平板法（1）制作MRS培养基乳酸菌培养基（MRS）配方：蛋白胨5g；牛肉膏5 g ；酵母浸膏 2.5 g ；葡萄糖10g；土温80 0.5ml；磷酸氢二钾1g ；柠檬酸氢二铵1g ；七水硫酸镁0.29g；四水硫酸锰0.125g；琼脂条9g；；乙酸钠2.5g加入500ml蒸馏水中加热溶解，调pH值为 6.8（6.2~6.6），115℃，灭菌15分钟。
（2) 倒平板将MRS培养基分离乳酸菌加热溶化待冷至55～60℃时，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，15ml缝，迅速倒人培养基约．然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
（3）制备酸乳稀释液（最好在无菌操作台上进行）取市售新鲜酸乳反复摇匀，用无菌吸管吸取1ml，放入盛9ml无菌水的试管中，振摇约20min，使充分混合，将细胞分散。
用一支lml无菌吸管从中吸取1ml悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4不同稀释度的乳酸溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。