植物病毒载体

植物病毒载体的类型及应用

摘要：植物病毒载体可分为5种类型，烟草花叶病毒载体是最常用植物病毒载体。植物病毒载体应用广泛，有诸多优点，也存在一些问题。本文对植物病毒载体进行综述。

关键词：植物病毒载体；类型；烟草花叶病毒载体；应用

The Types and Application of Plant Virus Vectors

Abstract: Plant virus vectors can be divided into five types. Tobacco Mosaic Virus vector is the most commonly used plant virus vector. Plant viral vectors are widely used. They have many advantages，as well as some problems. This article provides an overview of plant virus vectors. Key words: plant virus vectors; type; Tobacco Mosaic Virus vector;application

DNA 体外重组是基因工程技术的重要步骤之一，它是将外源目的基因与适当的载体相连。要把一个目的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，这个携带目的基因进入受体细胞中的工具就称为载体(V ector)。载体有很多种，病毒载体是其中的一种。病毒载体是利用病毒的基因组序列元件构建的真核基因转录工具[1]。植物病毒载体的研究开展得较晚，1984 年才诞生了第一例由植物DNA病毒——花椰菜花叶病毒(Califlower mosic virus，CaMV)构建的载体。但是植物病毒载体具有很多优点，例如短时间内可以生产大量成本低廉的外源蛋白，满足医药及工业用蛋白的需求。因此，1984年之后，人们尝试了多种植物病毒载体构建方法。目前已经构建了多种类型的植物病毒载体，已有用植物病毒载体pClYVV 表达了绿色荧光蛋白基因[2]、Nodulin gene基因、人的α-干扰素基因及小球状病毒抗原蛋白基因等的报告[3]。近年来也逐步利用植物病毒载体作为探针，用于研究植物和植物病原基因的表达调控、编码产物的功能以及植物与病原的相互作用。

一植物病毒载体的类型

植物病毒载体可分为置换型载体、插入型载体、互补型载体、抗原展示型载体和融合/释放型载体5 种。

1置换型载体

置换型载体是最原始的载体类型，由外源基因置换对植物病毒基因组复制影响不大的基因构建而成，一般用于转染原生质体进行瞬时表达以验证构建载体的可行性，较少接种于植株来系统地表达外源基因。CaMV 首先被用于构建置换型载体的研究。用外源基因置换CaMV 的基因Ⅱ(蚜传因子)后不影响其侵染性，成功地表达了细菌二氢叶酸还原酶(DHFR)和人α-D 干扰素基因[4]，IFN-αD 的表达量可达到2μg/g(鲜叶)。

DEC 2012

2 插入型载体

插入型载体是在病毒基因组中引入额外的亚基因组启动子，将外源基因插入此启动子下游，随病毒的增殖使外源基因得以大量表达。

构建插入型载体至少要考虑外源基因的插入位置、外源基因的大小和外源基因的启动子3个因素。外源基因的插入不能影响病毒正常基因的表达，外源基因不能过大，否则可能会影响病毒外壳的组装和运动而使外源基因不能表达。对于球状或二十面立体等轴对称病毒来说，包装限制决定了插入的外源编码序列不能太大。丝状或杆状植物病毒，如CaMV、马铃薯Y 病毒(Potato virus Y，PVY)和豇豆花叶杆状DNA 病毒(Cowpea mosaic virus，CPMV)等植物病毒因为不存在包装限制，适于构建插入型载体[5]。通常用病毒的CP （衣壳蛋白）或复制酶亚基因组启动子，为了避免同源重组，需采用亲缘关系较远病毒的亚基因组启动子。目前主要有马铃薯X病毒(Potato virus X，PYX)[6]、烟草花叶病毒、豇豆花叶病毒和番茄丛矮病毒(Tomato bushystunt virus，TBSV)这4种植物病毒用于构建插入型载体，其中PYX 载体多用做探针，研究植物和植物病毒基因结构与功能，以及病毒与宿主之间的相互作用。烟草花叶病毒和豇豆花叶病毒载体主要用于展示医药用的外源小肽。

3 互补型载体

为了弥补置换型载体和插入型载体的不足，研究人员设计了互补型载体。互补型载体是将外源基因插入缺陷型病毒或亚病毒粒子中，通过转基因植物或与辅助病毒共侵染而互补缺陷。利用转基因植物表达病毒基因是由转基因植株提供失活基因产物，弥补缺陷型病毒载体失去的功能。亚病毒互补载体系统利用亚病毒表达外源基因，与辅助病毒共接种，由辅助病毒提供失活基因产物。构建亚病毒互补载体系统是一个很有希望的方向，但需要进一步研究外源基因插入的位点、载体的稳定性及对寄主植物症状和病毒运动的影响。4 抗原展示型载体

抗原展示是将外源基因选择性地插入病毒CP 基因中融合表达，而正好使外源多肽呈现在病毒粒子表面，通过提纯重组病毒即可获得大量的抗原[7]。这种方法避免了双亚基因组启动子可能的同源重组，增强了外源多肽的抗原性，因而适用于抗原性较差、难以用其他方法表达和纯化的小肽。但构建抗原展示型载体需要在原子水平了解病毒的结构，因而仅用于结构较为清楚的几种病毒，应用较多的是TMV、CPMV 和TBSV。

5融合/释放型载体

这是新近发展的病毒载体类型。它建立在插入型载体的基础之上，为了避免双亚基因组启动子可能带来的不稳定性和融合表达可能影响病毒的系统侵染，在插入外源基因的同时在病毒基因组中引入病毒自身蛋白酶的切割加工位点或口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白酶序列，使外源基因与CP的融合表达产物能被蛋白酶切割而释放。Santa等构建了PVY 的融合/释放载体，研究表明该载体不仅能系统侵染和表达游离的绿色荧光蛋白(GFP)和CP(能提供系统侵染功能)，也产生大量的GFP-CP 融合蛋白，并组装成病毒粒子，子代病毒粒子的浓度约为野生型PVY 的2 倍。

二烟草花叶病毒载体

烟草花叶病毒(TMV)是目前研究最为广泛的一类植物病毒，病毒粒子为短杆状，能在被侵染的植物细胞中大量积累，具有作为表达载体的潜力[8]。迄今，TMV 载体成功表达的外源基因至少已有150 种。

1TMV的基因组结构

TMV是单链RNA 病毒，基因组长6395个核苷酸，包括4个编码区，至少编码4种多肽，分别是126ku、183ku、30ku 和17.5ku 蛋白[9]。其中126ku 和183ku两种病毒蛋白参与病毒的复制，而30ku 蛋白质则与病毒从一个细胞转移