植物病毒载体
植物可能携带病毒吗
植物可能携带病毒吗植物在日常生活中扮演着重要的角色，它们不仅为我们的生活提供氧气和食物，还能增添美感，但我们是否意识到植物可能成为病毒的潜在携带者呢？这个问题值得我们深入探讨。
植物与病毒病毒是一种微小的病原体，可以感染动植物、细菌和真菌等生物。
在动植物中，病毒可以引发各种疾病，对其生长和发育造成不良影响。
而植物是否可能携带病毒呢？答案是肯定的。
植物可能携带病毒主要通过以下几种途径：1.昆虫传播：一些昆虫，如蚜虫、白粉虱等，可能是植物病毒的载体。
它们通过叮咬受感染植物，将病毒传播到其他健康植物上，导致病毒在植物种群中传播。
2.土壤传播：一些植物病毒可以通过土壤中的微生物介导传播。
当感染植物的根系接触到携带病毒的土壤时，病毒可能被吸收并传播到植物体内。
3.疾病携带：一些植物表面可能携带一些病毒，这些病毒可能来源于外界环境。
当其他植物与携带病毒的植物接触时，这些病毒可能通过接触传播。
植物携带病毒对人类的影响植物携带病毒可能对人类和生态系统产生一定的影响：•农业生产：植物病毒对农作物的破坏可能导致农业产量下降，影响人类的粮食安全。
•生态平衡：一些植物病毒可能会影响野生植物的生长和繁殖，对生态系统产生不利影响。
•人类健康：虽然大多数植物病毒对人类无害，但一些病毒可能会通过接触植物传播给人类，造成人类健康问题。
预防和控制为了减少植物携带病毒的可能性，我们可以采取以下措施：•培育抗病品种：通过选择或培育抗病品种，可以降低植物感染病毒的几率。
•加强病虫害防治：及时清除受感染的植物，控制病原体传播的途径，可以有效减少病毒在植物间的传播。
•加强卫生管理：保持种植环境的清洁，减少病原体在植物表面的积累，可以有效降低病毒传播的风险。
综上所述，虽然植物可能携带病毒，但通过科学防控和管理，可以有效减少植物病毒的传播，保障农作物产量和生态环境的稳定。
我们应该加强对这一问题的认识，共同努力保护植物的健康与安全。
病毒在生物科学中的应用
病毒在生物科学中的应用病毒是一种无细胞结构的物质，只能在其他活的细胞内进行繁殖。
病毒寄生在生物的主细胞内可以引起细胞发生裂解反应，还可以改变生物体内的DNA整合，使得DNA内的细胞出现溶源化的情况，这些都会给生物带来一定的危害。
但是病毒并不是只会给生物带来危害，通过对病毒的研究，科学家发现了病毒的利用价值，主要体现在基因工程的载体、促进动物细胞融合和制造新的疫苗方面，病毒的利用价值对于科学研究工作是非常有利的。
标签：生物科学；病毒；利用价值人们一听到病毒这个词，最直接的反应就是一种可以使人们生病的物质，病毒这个词已经慢慢被人们误解了，其实，病毒在人类的科学研究中是很有利用价值的，主要是因为，科学家可以通过研究病毒得到对人类社会发展有利的方面。
在病毒的研究方面，可以通过它来进行疫苗的开发，这是一项非常大的贡献。
1 基因工程的运载体在基因工程中，使用的应用载体都是一些噬菌体或者是动植物的病毒，病毒可以成为基因工程的运载体主要是由于它的特点决定的。
首先，病毒具有可以被细胞识别的有效的启动子，这些启动子可以使基因工程中一些常见的标记表达发生变化，进而引起克隆的外源基因的表达；其次，许多的病毒都具备在感染周期内持续复制的能力，这样就可以使得基因组的数量达到一定高的水平；再次，病毒在进行复制的时候是可以控制自己进行顺式或者是反式复制的，决定顺式或者是反式的作用因子在经过基因的造作以后会出现变化，可以改变细胞与外源基因之间的关系；最后，病毒在进行复制的时候是可以对主基因组进行高效稳定的整合，利用病毒的这一特性，可以提高基因中染色体的效率。
病毒可以作为不同生物的基因载体。
1.1 动物基因工程的载体在动物基因工程中常见的病毒载体有很多，主要是猿猴空泡病毒和人的腺病毒，这些病毒可以与基因中的细胞重新组合DNA分子，病毒成为动物的基因载体主要是通过显微镜注射的方式来实现的。
猿猴空泡病毒是一种环形双链的结构，这种病毒是非常小的，是非常适合基因的操作，这种病毒有些是通过实验室研究得到的，有些是野生的。
植物基因转化
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Ti质粒结构
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T-DNA区：T-DNA是根瘤农 杆菌侵染植物细胞时从Ti 质 粒上切割下来转移到植物细 胞的一段DNA，含有编码植 物激素和冠瘿碱的基因
Vir 区：Vir 区上的基因 能激活T-DNA 转移，使 根瘤农杆菌表现出毒性
Con 区(接合转移编码区)：该 区段上存在与细菌间接合转移 的有关基因，调控Ti 质粒在农 杆菌之间的转移
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三亲交配法
无论是整合载体系统还是双元载体系统，把中间载体质粒由 大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都需要三种细菌参与，通常把这 一过程称为三亲交配法。
1.受体农杆菌 2.协助菌（带有协 助质粒的大肠杆菌） 3.供体菌（带有重 组植物表达载体的 大肠杆菌）
原理：三种菌混合 时，协助质粒游动 进入供体菌中，将 供体菌中的表达载 体转移到受体菌中， 最后经过适当的抗 生素筛选即可获得 土壤农杆菌转化结 合体
RNA病毒载体 烟草花叶病毒 马铃薯病毒X
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改造后的Ti质粒的基本结构
右边界序列 DNA复制起始位点 选择标记基因 T-DNA的边界序列 多克隆位点
左边界序列
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Ti质粒介导转化的过程
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植物表达载体构建—中间载体的构建
带有重组T-DNA的大肠杆 菌质粒衍生载体称为“中 间载体”。
基本原理是把T区（即Ti质粒能整合到植物基因组中去的一 段DNA，总长度约为23kb）片段克隆到普通载体pBR322 上，把外源基因插入到该T区后再导回受体细胞中，使外 源DNA转移到Ti质粒上，再经根癌土壤杆菌转化植物把该 外源片段导入植物体内。
Ori区(复制起始区)：Ori 区上的基因调控Ti 质粒 的自我复制
植物病毒有哪些传染或传播方式
植物病毒传染与传播方式植物病毒是引起植物疾病的重要病原体之一，通过不同的传染或传播方式，病毒可以迅速传播并严重危害植物生长。
在实际农业生产中，了解植物病毒的传染与传播方式对预防和控制病毒病具有重要意义。
下面将详细介绍植物病毒主要的传染与传播方式。
直接接触传播直接接触传播是一种常见的植物病毒传播方式，通常发生在植物体内，通过感染的植物部位（如根、茎、叶、果实等）直接接触健康植物的相应组织，将病毒传播给健康植物。
这种传播方式常见于农作物之间或同一植物体内不同组织间的病毒传播。
叶蝉传播叶蝉是一类常见的昆虫，它们以植物汁液为食，同时也是植物病毒的重要传播者之一。
当叶蝉叮咬感染病毒的植物后，再飞到健康植物上叮咬，就会将病毒传播给健康植物。
在农田中，叶蝉的传播是导致病毒病蔓延的重要途径之一。
病毒土传一些植物病毒可以通过土壤传播，即病毒存在于土壤中，通过土壤颗粒、水分或根系等途径，感染健康植物。
这种传播方式在植物生长环境中尤为常见，对于一些地下茎蔓延的作物病毒病具有重要的传播意义。
种子传播某些植物病毒还可以通过植物种子传播，这种方式又称为垂直传播。
当植物种子携带感染病毒时，种子萌发或生长过程中就可能将病毒传播给后代植物。
因此，在植物种子的生产和繁殖过程中，要对种子进行严格的检疫和消毒，以防止病毒通过种子传播。
昆虫传播除叶蝉外，还有一些昆虫如蚜虫、介壳虫等也是植物病毒的重要传播媒介。
这些昆虫在吸食植物汁液的过程中，会将植物病毒传播给健康植物。
昆虫传播是植物病毒传播的一种重要途径，因此在农田中要加强对病毒传播昆虫的监测和防治。
综上所述，植物病毒具有多种传染与传播方式，其传播途径的多样性使得植物病毒疾病在一定程度上难以控制。
在实际生产中，必须根据具体情况采取相应的防控措施，减少病毒病对植物生长的影响，保障农作物的产量和质量。
植物生物技术：第九章 植物遗传转化载体
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems（含Ti质粒 ）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含Ri质粒） ，在植
物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。
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病毒载体感染植物细胞以后只是利用寄主细胞的功能在细胞质进 行复制和表达；同时又由于病毒具有高效自我复制能力，故在转 化植物中可得到高拷贝外源基因，从而十分有利于外源基因的表 达和功能的实现
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Ti质粒结构
毒性区（vir区）：激活T－DNA的转移
T－DNA区： 侵染植物时，从Ti质粒上 被切割，转移到植物细胞中，带有与 肿瘤形成有关的基因
接合转移区：存在与细菌间进行接合有 关的基因
复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制
T-DNA 区
Cytokinin
Auxin
Opine
左边界
右边界
Ti 质粒
第九章 植物遗传转化载体
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第9章 植物遗传转化载体
本章主要内容
• 第一节 植物遗传转化载体的种类及特点 • 第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建 • 第三节 植物病毒载体 • 第四节 叶绿体转化载体 • 第五节 遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系统
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第9章 植物遗传转化载体
本章教学目的与要求
含子、信号肽等）连接在一起构成基因。
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启动子
Ti质粒
Nos（胭脂碱合成酶基因）、Ocs（章鱼碱合成酶基因）等
基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植 物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建 嵌合基因的启动子。
植物遗传转化的载体系统
2．植物遗传转化的载体系统。
作为植物遗传转化的载体必须是能进入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子。
目前的载体系统有病毒的载体系统和质位的载体系统两大类。
（1）病毒载体系统：植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。
以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源基因整合到植物细胞基因组中。
植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。
但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。
作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。
目前已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中；包括椰菜叶病毒（CaMV）、烟草花叶病毒（TMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）和马铃薯X病毒（PVX）等。
其中在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。
（2）农杆菌质粒载体系统：质粒载体系统中最常用的质粒有：Ti质粒和Ri质粒。
Ti 质粒存在于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，Ri质粒存在于发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenis）中。
Ti质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有基本一致的特性。
但实际工作中，绝大部分采用Ti质粒。
农杆菌质粒是一种能实现DNA转移和整合的天然系统。
Ti质粒有两个区域：T-DNA区（是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域）和Vir区（编码能够实现T-DNA转移的蛋白）。
T-DNA长度为12-24kb之间，两端各有一个含25hp重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。
Vir区位于T-DNA以外的一个35kb内，其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。
植物病毒依靠哪些传播方式传播
植物病毒的传播方式及防控措施植物病毒是一种侵害植物的微生物病原体，其传播方式主要有三种：昆虫传播、物理传播和种子传播。
了解植物病毒的传播方式对于有效防控病害具有重要意义。
昆虫传播植物病毒的主要传播方式之一是通过昆虫进行传播。
一些昆虫如蚜虫、介壳虫等，在吸食感染病毒的植物汁液时，会将病毒携带到健康植物上，从而传播病毒。
昆虫传播是植物病毒传播最为普遍和有效的方式之一，因此对昆虫的防控至关重要。
物理传播植物病毒也可以通过物理传播的方式传播。
例如，当植物受到伤害或操作时，使用未经消毒的工具接触多个植物，就会导致病毒的传播。
因此，在农业生产中，应加强对工具、器皿等物理器具的消毒，以减少病毒传播的可能性。
种子传播另一种植物病毒的传播方式是通过种子传播。
当种子上携带有病毒时，种子在萌发和生长过程中就会将病毒传播给新植物。
种子传播是植物病毒长距离传播的一种重要方式，因此植物种子的消毒处理和来源的审查非常重要。
防控措施为了有效控制植物病毒的传播，我们可以采取以下防控措施： 1. 合理管理农田，保持地块清洁，减少害虫栖息地，从而降低昆虫传播病毒的可能性。
2. 定期对种植的植物进行检查，发现病毒病变及时隔离并进行病害防控。
3. 加强物理器具的消毒，避免病毒通过工具传播。
4. 对植物种子来源进行审查，确保种子没有病毒感染，并进行适当的消毒处理。
通过有效的防控措施，可以降低植物病毒的传播风险，保护作物的生长，提高农业生产效益。
以上是关于植物病毒传播方式及防控措施的介绍，希望能对您有所帮助。
感谢阅读！。
黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析
第2卷第6期植物医学2023年12月V o l.2N o.6P l a n tH e a l t h a n dM e d i c i n e D e c.2023D O I:10.13718/j.c n k i.z w y x.2023.06.003黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析吴娟,李佳燕,李伟,曾紫怡,竺锡武湖南人文科技学院农业与生物技术学院,湖南娄底417000摘要:病毒诱导的基因沉默(V i r u s-i n d u c e dG e n eS i l e n c i n g,V I G S)已被广泛应用于植物基因功能研究,具有操作容易㊁较短时间内即可观察到沉默效果㊁成本较低的特性.黄瓜花叶病毒(C u c u m b e rM o s a i cV i r u s,C MV)V I G S载体已经应用于沉默辣椒㊁烟草㊁大豆等植物基因,对于研究植物基因功能有重要作用.研究以C MV的F n y株系(C MV-F n y)R N A2中2b基因缺失载体C MV-F209ә2b和表达2b基因N端61个氨基酸的载体C MV-F2092b61a a为对象,插入不同长度的外源基因g f p片段后,分析C MV V I G S载体在本氏烟植株上的病毒表达含量及诱导产生的病毒症状.结果表明,插入外源基因片段后,病毒外壳蛋白(C o a tP r o t e i n,C P)基因R N A表达水平均明显降低.携带不同长度g f p序列的重组病毒C MV F2092b61a a-g f p100㊁C MV F2092b61a a-g f p200和C MV F2092b61a a-g f p350其C P R N A 含量比装载最适长度g f p序列的C MV F209ә2b-g f p350高10倍左右,且同样不引发明显病毒症状.由此可见,C MV F2092b61a a相比C MV-F209ә2b更适合作为高效的V I G S载体,且初步探明它的最适插入片段长度为200~350n t.关键词:病毒诱导的基因沉默;黄瓜花叶病毒;2b;病毒含量中图分类号:S432文献标志码:A文章编号:20971354(2023)06002107A n a l y s i s o fV i r u sC o n t e n t a n dS y m p t o m s o fC u c u m b e rM o s a i cV i r u s-b a s e dG e n e S i l e n c i n g V e c t o rWUJ u a n, L I J i a y a n, L IW e i,Z E N GZ i y i,Z HU X i w uI n s t i t u t eo f A g r i c u l t u r ea n dB i o t e c h n o l o g y,H u n a nU n i v e r s i t y o f H u m a n i t i e s,S c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,L o u d i H u n a n417000,C h i n a收稿日期:20230923基金项目:湖南省教育厅科研创新平台开放基金(18K100).作者简介:吴娟,博士,讲师,主要从事植保生物技术研究.通信作者:竺锡武,研究员.22植物医学h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第2卷A b s t r a c t:V i r u s-i n d u c e d g e n e s i l e n c i n g(V I G S)h a s b e e nw i d e l y u s e d f o r p l a n t g e n e f u n c t i o n a l a-n a l y s i s.I t i s e a s y t o o p e r a t e,t o o b s e r v e t h e s i l e n c i n g e f f e c t i n s h o r t t i m e a n d l o wc o s t.C u c u m-b e rM o s a i cV i r u s(C MV)h a s b e e n s u c c e s s f u l l y d e p l o y e d a s aV I G S v e c t o r i n p l a n t s s u c h a s c h i l-i,t o b a c c o a n d s o y b e a n,p l a y i n g a n i m p o r t a n t r o l e i n p l a n t g e n e f u n c t i o n a l a n a l y s i s.I n t h i s s t u d-y,G F P g e n e f r a g m e n t s o f d i f f e r e n t l e n g t h sw e r e i n s e r t e d i n t o t h e2b g e n e d e l e t i o n v e c t o r C MV-F209ә2ba n dC MV-F2092b61a aw i t h t r u n c a t e d2b t o a n a l y z e t h e v i r u s e x p r e s s i o n l e v e l a n d i n-d u c e dv i r u s s y m p t o m s o f t h e s eC MV V I G S v e c t o r s i n N i c o t i a n a b e n t h a m i a n a.T h e r e s u l t s i n d i-c a t e d t h a t t h ea c c u m u l a t i o no fC P R N A w a ss i g n i f i c a n t l y r e d u c e da f t e r i n s e r t i n g f o r e i g n g e n e f r a g m e n t s.T h e C P R N A c o n t e n t s o f r e c o m b i n a n t v i r u s e s C MV F2092b61a a-g f p100,C M-V F2092b61a a-g f p200,a n d C MV F2092b61a a-g f p350c a r r y i n g d i f f e r e n t l e n g t ho fG F Ps e q u e n c e s w e r e a b o u t10t i m e sh i g h e r t h a nt h a to fC MV F209ә2b-g f p350c a r r y i n g t h eo p t i m a l l e n g t ho f G F P s e q u e n c e,a n d t h e y a l s o d i d n o t c a u s e o b v i o u s v i r u s s y m p t o m s.T h e r e f o r e,C M-V F2092b61a a i sm o r e s u i t a b l e a s a n e f f i c i e n tV I G S v e c t o r t h a nC MV-F209ә2b,a n d i t s o p t i m a l f r a g m e n t l e n g t ho f i n s e r t i o nh a s b e e n p r e l i m i n a r i l y d e t e r m i n e d t ob e200~350n t.K e y w o r d s:v i r u s-i n d u c e d g e n e s i l e n c i n g;c u c u m b e rm o s a i c v i r u s;2b;v i r u s c o n t e n t病毒诱导的基因沉默(V i r u s-i n d u c e dG e n eS i l e n c i n g,V I G S)是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后在植物体内产生d s R N A,被宿主的R N A干扰(R N A i n t e r f e r e n c e,R N A i)体系将携带有植物基因片段的重组病毒的转录产物降解为21~30n t的s i R N A s,然后s i R N A s靶向降解与其序列同源的植物内源靶基因的转录产物,瞬间下调靶基因的表达,从而使植物在2~3周内快速出现功能缺失表型[1].它是一种转录后水平的基因沉默现象,病毒介导的基因沉默技术与转基因介导的基因沉默技术因其双链R N A来源不同而作为R N A干扰(R N A i)技术的两个分支存在.这种方法操作简便㊁快速㊁有效,适用于进行高通量操作,所以V I G S成为进行大规模靶基因功能筛选的重要研究工具,尤其对于那些难以进行转基因的物种.研究发现,至少有50多种来自不同科属的病毒能作为各种模式植物和一些农作物的V I G S载体[2].黄瓜花叶病毒(C u c u m b e rM o s a i cV i r u s,C MV)是一种球形的二十面体病毒,直径为28~ 30n m,存在于细胞的细胞质和细胞核中[3].黄瓜花叶病毒属于雀麦花叶病毒科㊁黄瓜花叶病毒属的一个典型成员.它可以感染1200多种植物,是自然界分布最广㊁宿主最多的植物病毒之一[4].黄瓜花叶病毒是三分体病毒类型,其遗传信息库包括有3条正单链(R N A1㊁R N A2和R N A3),可合成1a蛋白㊁2a蛋白㊁3a蛋白㊁外壳蛋白(C o a t P r o t e i n,C P)等;2b蛋白翻译自亚基因组R N A4A,参与病毒细胞间移动㊁R N A沉默的抑制及对抗植物体S A诱导的抗性,也与病毒症状的产生密切相关[5].2b蛋白是C MV最小的蛋白,只有约110个氨基酸,它是最早被称为病毒R N A沉默抑制子(V i r a lS u p p r e s s o ro fR N A S i l e n c i n g,V S R)的病毒蛋白,其N端61个氨基酸就是抑制活性部位,对于结合s i R N A双链是必需的[6-7].目前C MV病毒载体的研究都已将C MV的R N A s1㊁2和3的全长c D N A片段分别连入p C B301等植物表达载体双35S 启动子的下游,构建C MV侵染性克隆,该侵染性克隆可以通过农杆菌浸润的方法接种至植物,造成系统侵染[8].C MV V I G S载体的构建主要是对R N A2进行改造,去掉部分或全部2b基因序列,引入终止密码子和M C S,由于改造过程中,2b蛋白遭到破坏,降低了其对R N A沉默的抑制,使其更适合于病毒诱导基因沉默[9-10].姚敏等[8]的研究表明,2b缺失突变体C MV-F n yΔ2b在本氏烟上虽然早期有微弱的曲叶症状,但中后期无任何症状,R T-P C R检测表明F n y2b缺失突变体可系统侵染本氏烟,这与D i n g等[11]早期报道2b 缺失后能够系统侵染普通烟相一致.2b 基因缺失后,C MV -F n yΔ2b 能系统性侵染寄主植物,但病毒基因组R N A 大大降低[12].程晓东等[10]用C MV 不同株系的R N A 2与C MV -F n y 基因组R 1和R 3进行组合接种,获得在本氏烟中症状轻的病毒组合F 1T s h R 2F 3,T s h R 2的2b 基因缺失3'端的95n t 碱基(T s h 2V I G S )后病毒能系统性侵染寄主植物,但降低病毒外壳蛋白(C o a t P r o t e i n ,C P )含量.2b 基因完全缺失也有可能影响C MV V I G S 载体在一些植物上的复制和系统移动,导致无侵染性,所以报道的C MV 载体一般保留了2b 蛋白的N 端60~94个氨基酸序列[9].也有观点认为,保留的2b 序列内含R N A 沉默抑制子活性的功能域,有可能会影响病毒诱导的基因沉默[9].向志丹等[13]的研究发现,基于沉默的效率和稳定性,完全缺失2b 基因的载体C MV -F n yΔ2b 的最适插入片段是350n t 左右.本试验分析了C MV -F n y Δ2b 载体插入350b p 的g f p 外源基因片段,以及C MV -F 2092b 61a a 载体分别插入100b p ㊁200b p 和350b p 的g f p 外源基因片段,其病毒外壳蛋白R N A 水平的变化,及诱导产生的病毒症状的变化.1 材料与方法1.1 试验试剂限制性内切酶㊁T a q P C R 酶㊁P y r o b e s t D N A 聚合酶㊁M -M L V 反转录酶(R N a s e H -)㊁重组R N a s e 抑制剂㊁T 4D N A 连接酶购于宝日医生物技术(北京)有限公司;D N A 清洁回收试剂盒㊁D N A 凝胶回收试剂盒㊁质粒提取试剂盒购于爱思进生物技术(杭州)有限公司;2ˑq P C RM i x (S Y B R G r e e n Ⅰ)㊁引物购于北京擎科生物科技股份有限公司;T r i z o l 试剂购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;其他试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司.1.2 寄主植物本氏烟幼苗于25ħ㊁16h 光照/8h 黑暗的植物培养室中培养,生长至5~7叶期接种病毒.1.3 质粒及其构建C MV F n y 基因组R N A 1-3的侵染性克隆(p C B 301-C MV F 109,p C B 301-C MV F 209和p C B 301-C MV F 309)和2b 基因缺失质粒p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 由浙江理工大学赠与.p C B 301-F 2092b 61a a -M C S 是以质粒p C B 301-F 209ә2b -M C S 为基础构建的.以本实验室已有的p C B 301-C MV F 209质粒为模板,采用引物2b N c o I F 2和2b 61a a M l u R 通过P C R 扩增2b 61a a 的D N A 序列片段,大小为750b p 左右,p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 质粒用N c o I 和M l u I 双酶切后,切下570b p 左右片段后,约7400b p 载体片段与同样经过酶切的PC R 产物连接,获得pC B 301-C MV F 2092b 61a a -M C S 质粒.为了构建含不同长度的g f p 基因片段的重组质粒,采用不同的下游引物与G F P 350M l u F 组合,P C R 扩增获得100b p ,200b p 和350b p 的g f p 基因片段.经M l u I 和B a mHI 酶切,克隆至预先经M l u I /B a mHI 酶切的p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 和p C B 301-C MV F 2092b 61a a -M C S质粒,构建产生重组质粒p C B 301-C MV F 209ә2b -g f p 350,p C B 301-C MV F 2092b 61a a -g f p 100,p C B 301-C MV F 2092b 61a a -g f p 200和p C B 301-C MV F 2092b 61a a -g f p 350.所有重组质粒均测序正确,C MV 载体构建过程见图1.32第6期 吴娟,等:黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析图1 C MV 载体构建示意图1.4 农杆菌浸润接种病毒p C B 301-C M V F 109~F 309,p C B 301-C M V F 209ә2b -M C S ,p C B 301-C M V F 2092b 61a a -M C S ,p C B 301-C M V F 209ә2b -g f p 350,p C B 301-C M V F 2092b 61a a -g f p 100,p C B 301-C M V F 2092b 61a a -g f p 200和p C B 301-F 2092b 61a a -g f p 350质粒采用冻融法转入农杆菌GV 3101中,农杆菌浸润接种本氏烟参考张斯(2014)的方法,农杆菌G V 3101(p C B 301-C MV F 109)㊁G V 3101(p C B 301-C MV F 209,p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 等)和G V 3101(pC B 301-C MV F 309)等比例混合,用无针头注射器浸润接种于6~7叶龄本氏烟中间叶位相对的两叶片,接种后的本氏烟25ħ黑暗处理24h 后,继续25ħ㊁16h 光照/8h 黑暗温室培养.1.5 q R T -P C R 分析接种烟草C MVC P 基因m R N A 含量提取C M V ,C M V F 209ә2b -M C S ,C M V F 209ә2b -g f p 350,C M V F 2092b 61a a -M C S ,C M V F 2092b 61a a -g f p 100,C M V F 2092b 61a a -g f p 200和C M V F 2092b 61a a -g f p 350侵染本氏烟相同叶位系统叶的总R N A ,并用R N a s e -F r e eD N a s e 消化以除去D N A.总R N A 经n a n o d r o p 初步定量和1ˑTB E 琼脂糖电泳进行质量检测.以本氏烟A c t i n 为内参基因,C MV C P 基因特异的q R T -P C R 引物为F 309C P q F 2和F 309C P q R 2,具体引物序列见表1.总R N A 用M -M L V 反转录酶进行反转录,q R T -P C R 按照试剂盒的说明书进行.C P 基因的m R N A 相对表达水平通过2-ΔC t 法计算获得.表1 引物信息引物名称引物序列(5'~3')用途2b N c o I F 2C A T G C C A T G G C T G A G T T T G C C T G p C B 301-C MV F 2092b 61a a -M C S 质粒构建2b 61a a M l u RA C T C C G C C A C G T T C A C A T G A T C C A C T T G A T A G A A C G G T A G G F P M l u F C G A C G C G T G A G C T G A A G G G C A T C G A C T g f p 片段克隆共用正向引物G F P 350B a mH RC G G G A T C C T T A C T T G T A C A G C T C G T C C A T g f p 350克隆G F P 200B a mH R C G G G A T C C T C G C C G A T G G G G G T G T T C g f p 200克隆G F P 100B a mH RC G G G A T C C T C T T C T G C T T G T C G G C C A T G g f p 100克隆F 309C P q F 1G A A G C T T G T T T C G C G C A T T C q R T -P C R F 309C P qR 1C A C C T A T A T C A G C G C G C A T C q R T -P C R N b A c t i n F 1C C A C A T G C C A T T C T C C G T C T q R T -P C R N b A c t i n R 1T C C C T G A C A A T T T C C C G C T C qR T -P C R 42植物医学 h t t p ://x b b jb .s w u .e d u .c n 第2卷1.6 数据处理与统计学分析本研究所收集数据采用S P S S26.0软件进行分析.2 结果与分析2.1 C MVF n y 及重组病毒在本氏烟上的症状反应将C M VF n y RN A 2进行改造后,只表达2b 基因N 端61个氨基酸的病毒C M V F 2092b 61a a 在接种后的本氏烟上的病毒症状反应与C MV F n y 相比轻很多,植株无严重矮化和叶片卷曲症状,只是幼叶呈现浓绿与淡绿不均匀的斑驳即轻花叶症状,而完全缺失2b 基因的病毒C M -V F 209ә2b 则无明显病毒症状(图2).携带100b p ~350b p 的外源基因片段的重组病毒C M -V F 2092b 61a a -g f p 100,C MV F 2092b 61a a -g f p 200,C MV F 2092b 61a a -g f p 350和C MV F 209ә2b -g f p 350都不表现明显病毒症状反应(表2).图2 本氏烟接种病毒或缓冲液(M o c k )15d 的症状表2 C MVF n y 及重组病毒在本氏烟上的症状反应病毒本氏烟症状C MVF n y 植株严重矮化和叶片卷曲C MV F 2092b 61a a轻花叶C MV F 209ә2b 无明显病毒症状C MV F 209ә2b -g f p 350无明显病毒症状C MV F 2092b 61a a -g f p 100无明显病毒症状C MV F 2092b 61a a -g f p 200无明显病毒症状C MV F 2092b 61a a -g f p 350无明显病毒症状2.2 病毒在本氏烟上的含量分析为了分析改造后的C MV V I G S 载体C MV F 209ә2b ,C MV F 2092b 61a a 和携带外源基因片段的重组病毒是否会影响病毒基因组含量,将100n t ~350n t 不等的外源基因片段插入改造后的C MV V I G S 载体,并将C MVF n y ㊁改造后的病毒载体及重组病毒C MV F 2092b 61a a -g f p 100,C MV F 2092b 61a a -g f p 200,C MV F 2092b 61a a -g f p 350和C MV F 209ә2b -g f p 350通过农杆菌浸润法接52第6期 吴娟,等:黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析种本氏烟.在接种后15d ,通过荧光定量P C R 方法,对成功接种的本氏烟相同叶位的上部系统叶(非顶部叶片)中的C MVC P 基因m R N A 水平进行相对定量.结果如图3所示,与野生型病毒C M VF n y 相比,改造后的病毒C M V F 2092b 61a aC P 基因表达量下降了52%,而C M V F 209ә2b 下降96%;与C M V F 2092b 61a a 相比,插入外源基因片段的重组病毒2b 61a a -g f p 100,2b 61a a -g f p 200和2b 61a a -g f p 350分别下降了90%,32%和78%.已有报道C MV F 209ә2b 作为基因沉默载体,最适插入片段为350n t 左右,而装载350n t 片段后C P 基因表达量下降了66%.C P 基因的表达量代表了病毒基因组R N A 水平,以上结果说明,作为基因沉默载体,C MV F 2092b 61a a 比C MV F 209ә2b 在本氏烟上病毒含量高10倍以上,且装载外源基因片段的2b 61a a -g f p 350和2b 61a a -g f p 200其病毒量也是C M V F 209ә2b -g f p 350的10倍以上.由于C M V F 2092b 61a a 装载100~350n t 不等的外源基因片段后,在本氏烟上也不表现明显病毒症状,但其具有更高的表达量,将会产生更高的沉默效率,所以比C MV F 209ә2b 更适合作为基因沉默载体,且本研究初步发现它的最适插入片段是200n t 左右.图3 q R T -P C R 分析病毒侵染烟草中C P m R N A 含量3 结论与讨论病毒诱导基因沉默(V I G S )已经成为一种常用的基因功能研究工具,大约有50多种病毒能用于植物的基因沉默.其中,烟草脆裂病毒(T o b a c c oR a t t l eV i r u s ,T R V )㊁马铃薯X 病毒(P o -t a t oV i r u sX ,P V X )㊁苹果潜隐球形病毒(A p p l eL a t e n t S ph e r i c a lV i r u s ,A L S V )等已经建立起了稳定的用于双子叶植物基因沉默的体系.但是,在单子叶植物中,V I G S 的应用还是非常有限.黄瓜花叶病毒属于雀麦花叶病毒科㊁黄瓜花叶病毒属的一个典型成员.它可以感染1000多种植物,因此是分布最广㊁宿主最多的植物病毒之一.C MV -F n y 属于C MV 中S u b g r o u p Ⅰ,是强致病性的株系.本研究将C MV -F n y 接种于本氏烟,7d 后植株开始呈现叶片蜷曲㊁皱缩的症状,随后症状还有加重的趋势,15d 后植株还明显矮化.以植物病毒作为V I G S 载体,首先该病毒载体在寄主植物上引发的症状反应要轻微,以免引发的严重症状干扰目标基因沉默后植株表型.对C MV -F n y R N A 2进行改造后,2b 基因完全缺失的载体C MV F 209ә2b 在本氏烟上不表现明显病毒症状,保留2b 基因N 端61个氨基酸的载体C MV F 2092b 61a a 虽然表现一定的病毒症状,62植物医学 h t t p ://x b b jb .s w u .e d u .c n 第2卷但插入100~350n t 不等的外源基因g f p 片段后,也都不表现明显病毒症状.由于缺失基因沉默抑制子2b 蛋白,C MV F 209ә2b 能系统侵染本氏烟,但影响病毒C P 含量,病毒基因组含量显著降低,而C MV F 2092b 61a a 的病毒基因组C PR N A 含量高很多,这可能与2b 蛋白其抑制活性位于其N 端61氨基酸有关.虽然装载外源基因片段后,病毒C P 含量都明显降低,重组病毒C MV F 2092b 61a a -g f p 100,C MV F 2092b 61a a -g f p 200和C MV F 2092b 61a a -g f p 350均比装载最适长度的C MV F 209ә2b -g f p 350高很多,且同样不引发明显病毒症状.作为高效的V I G S 载体,不仅在寄主植物上引发的病毒症状轻微,且病毒表达含量高.所以,C MV F 2092b 61a a 更适合作为高效的V I G S 载体,且它的最适插入片段是200~350n t .参考文献:[1]郭惠珊,高峰,赵建华,等.发展基因沉默技术,控制作物土传真菌病害[J ].中国科学院院刊,2017,32(8):822-829.[2] A B R A HAM I A NP ,HAMMO N DR W ,HAMMO N DJ .P l a n tV i r u s -D e r i v e dV e c t o r s :A p p l i c a t i o n s i nA gr i c u l -t u r a l a n d M e d i c a l B i o t e c h n o l o g y [J ].A n n u a lR e v i e wo fV i r o l o g y ,2020,7(1):513-535.[3] P A L U K A I T I SP ,G A R C ÍA -A R E N A LF .C u c u m o v i r u s e s [J ].A d v a n c e s i nV i r u sR e s e a r c h ,2003,62:241-323.[4] S A L ÁN K IK ,G E L L ÉR T Á,N E M E SK ,e t a l .M o l e c u l a rM o d e l i n g f o rB e t t e rU n d e r s t a n d i n g o fC u c u m o v i r u s P a t h o l o g y [J ].A d v a n c e s i nV i r u sR e s e a r c h ,2018,102:59-88.[5] J A C Q U E MO N D M.C u c u m b e rM o s a i cV i r u s [M ]//A d v a n c e s i nV i r u sR e s e a r c h .A m s t e r d a m :E l s e v i e r ,2012:439-504.[6] HWA N G M S ,L I N D E NMU T H BE ,M C D O N A L D K A ,e t a l .B i p a r t i t e a n dT r i p a r t i t eC u c u m b e rM o s a i cV i -r u s -B a s e dV e c t o r s f o rP r o d u c i n g t h eA c i d o t h e r m u sC e l l u l o l y t i c u sE n d o -1,4-β-G l u c a n a s ea n do t h e rP r o t e i n s i n N o n -T r a n s g e n i cP l a n t s [J ].B M CB i o t e c h n o l o g y ,2012,12:66.[7] D U A N C G ,F A N G Y Y ,Z HO U BJ ,e t a l .S u p p r e s s i o no fA r a b i d o p s i sA R G O N A U T E 1-M e d i a t e dS l i c i n g,T r a n s g e n e -I n d u c e dR N AS i l e n c i n g ,a n dD N A M e t h y l a t i o nb y D i s t i n c tD o m a i n so f t h eC u c u m b e rM o s a i cV i r u s 2bP r o t e i n [J ].T h eP l a n tC e l l ,2012,24(1):259-274.[8] 姚敏,张天奇,田志超,等.农杆菌介导的C MV 侵染性克隆及2b 缺失突变体构建[J ].中国农业科学,2011,44(14):3060-3068.[9] 王蓉.用于玉米基因功能研究的黄瓜花叶病毒基因沉默载体的创建[D ].北京:中国农业大学,2016.[10]程晓东,施伟,杜志游,等.基于黄瓜花叶病毒(C MV )基因沉默载体的构建[J ].农业生物技术学报,2015,23(12):1550-1558.[11]D I N GS W ,L IW X ,S YMO N SR H.A N o v e lN a t u r a l l y O c c u r r i n g H y b r i dG e n eE n c o d e db y aPl a n tR N A V i -r u sF a c i l i t a t e sL o n g Di s t a n c eV i r u sM o v e m e n t [J ].T h eE M B OJ o u r n a l ,1995,14(23):5762-5772.[12]朱品,常发光,杜志游,等.基于黄瓜花叶病毒基因组R N A 2的外源基因表达载体研究[J ].浙江理工大学学报(自然科学版),2017,37(2):265-269.[13]向志丹,张震霄,李超,等.黄瓜花叶病毒基因沉默载体的效率和稳定性分析[J ].浙江农业学报,2017,29(4):625-630.责任编辑 苏荣艳72第6期 吴娟,等:黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析。
外源基因在植物病毒表达载体中表达策略的研究进展
随 着 植 物 基 因 工 程 的 发 展 ， 用 植 物 表 达 系 统 生 产 外 源 蛋 白 越 来 越 受 到 人 们 的 关 注 。 植 物 中 生 产 利 在
收稿 日期 ：０ ２０ — ７ 修 改稿 收到 日期 ：０ ２ ０ — １ ２ ０ —３ ２ ； ２０—７１ 基金 项 目 ： 杨凌 农业 科技 开发 基金项 目资助 （ ０ ０一 ６ ２ ０ Ｊ０ ） 作者 简介 ： 年洪 娟 （ ９ ４ ， （ 族） 在 读硕 士 ， １ ７ 一） 女 汉 ， 内蒙古赤 峰人 。
外 源 基 因在 植物 病毒 表 达 载体 中 表 达 策 略的研 究进 展
年洪娟， 杨淑慎， 张锡梅
（ 北 农林 科技 大学 生命科 学学 院 ， 西杨 陵 ７ ２ ０） 西 陕 １ １ ０
摘
要 ： 用植 物 病 毒表 达 载体 表 达外 源蛋 白是近 年来 发 展起 来 的具 有 表 达 量 大 、 利 速度 快 和
ｎ ｅ ｉ ｏ ｐ ｅ ｔ ｌ ｘ ｂ ｌ ｙ ｆ ｒ ｅ ｐ ｄ ｔｏ ｓ ａ ｐ ｉ ａ ｉ ｎ ｉ ａ ｉ ｕ ｌ ｎ ｐ ｃｅ ， ｅ ｒｎｇ ｃ ｕ ｌｄ ｗｉｈ ｆｅ ｉ ｉｉ ｏ ｘ ｅ ｉｉ ｕ ｐ ｌ ｔｏ ｎ ｖ ｒｏ ｓ ｐ ａ ｔ ｓ ｅ ｉｓ Ｔｈ ｔ ａ ｅ ｉｓ ｔ ａ ｔ ｃ ｅ ｓｒ ｔ ｇｅ ｈ ｔ ｈ ｖ ｅ ｎ ｔ ｓ ｅ ｏ ｏ ｅ ｇ ｅ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｎ ｖ ｒｏ ｓ ｖ ｒ ｓ ｂ ｓ ｄ ｖ ｃ ｏ ｓ ｉ ｃ ｕ ｅ ｇ ｎ ｅ ｌ ｃ ｍｅ ＇ ａ ｅ ｂ ｅ ｅ ｔ ｄ ｆ ｒ ｆ ｒ ｉ ｎ ｇ ｎ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｉ ａ ｉ ｕ ｉｕ — ａ ｅ ｅ ｔ ｒ ｎ ｌ ｄ ｅ ｅ ｒ ｐ ａ ｅ ｎｔ
植物病毒的形状
植物病毒的形状
植物病毒是引起植物疾病的病原体之一，它们通过感染植物细胞来破坏植物的正常功能。
病毒的形状对于其传播和致病性具有重要影响。
植物病毒的形状主要有四种类型：球形、长杆状、环形和多边形。
球形病毒
球形病毒是最常见的植物病毒形状之一。
这种病毒呈球形或类球形，具有对称的外形。
球形病毒包裹在一个蛋白质衣壳中，内含病毒基因组。
球形病毒常见于西瓜嵌紋病毒、花叶病毒等。
由于其结构稳定，球形病毒在环境中存活较长时间，传播途径多样。
长杆状病毒
长杆状病毒呈细长的形状，类似一根杆子。
这种病毒具有较大的基因组，可能同时携带多种病毒颗粒。
常见的长杆状病毒有烟草花叶病毒、苹果褐斑病毒等。
由于其形状特殊，长杆状病毒在植物体内扩散速度较快，容易引起强烈的病害症状。
环形病毒
环形病毒呈环状或圆盘状结构。
这种病毒常见于一些木质植物病毒，如核桃黑斑病毒、柚病毒等。
环形病毒在传播过程中往往依赖昆虫或其他生物载体，其封闭的结构使得病毒更容易在载体间传播。
多边形病毒
多边形病毒呈多面体结构，如正二十面体、正二十四面体等。
这种病毒结构稳定，具有对称性。
常见的多边形病毒有马铃薯Y病毒、花叶病毒等。
多边形病毒在植物细胞内复制迅速，导致植物迅速出现病害症状。
植物病毒的形状对其传播和致病性具有重要影响，不同形状的病毒在植物体内的生长、复制方式也有所不同。
因此，研究植物病毒的形状及其特点对于有效防控植物疾病具有重要意义。
植物病毒载体研究及应用进展
植物病毒载体研究及应用进展作者：王强彭日民朱品竺锡武来源：《现代农业科技》2015年第20期摘要该文概述了植物病毒载体的类型，应用病毒载体表达外源蛋白，分析和利用基因功能方面的进展。
关键词病毒载体；外源蛋白；基因功能中图分类号 S476+.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）20-0086-03Advancement on Research and Application of Plant Virus VectorsWANG Qiang 1 PENG Ri-min 1 ZHU Pin 2 ZHU Xi-wu 1，2 *（1 Institute of Agricultural and Biological Technology，Hunan University of Humanities，Loudi Hunan 417000； 2 Institute of Biological Engineering，Zhejiang University of Technology）Abstract This paper outlined the types of plant virus vector and the process of applying viral vector to express foreign proteins，as well as analyze and utilize gene functions.Key words virus vector；foreign protein；gene functions基因表达载体的构建是基因工程中的核心。
病毒载体是基因表达载体的类型之一，是利用病毒的基因组序列元件构建的真核基因转录工具，其目的是将目的基因导入受体细胞并可以表达。
病毒载体与基因遗传转化相比，病毒载体表达水平高，表达量可达基因遗传转化的100多倍[1]；试验快速，从载体的构建到植物的表达周期短；植物病毒寄主多，且一般都有很强的侵染能力和一定的寄主范围，可对一种寄主植物的多个品种或多个寄主接种，大大方便用于分析不同种植物的基因功能或在不同种植物或不同品种中表达外源蛋白。
病毒诱导的植物基因沉默详解
病毒诱导的植物基因沉默详解上个世纪20年代，科学家发现植物与病毒之间存在交叉保护现象：被病毒侵染后的植物可能产生对该病毒株系和相近株系的抗性。
但这种抗性也可能存在“恢复”的现象。
直到上世纪90年代，这些现象的产生机制才被逐渐阐释清楚：是由于病毒基因发生了转录后基因沉默而致使表达受到抑制的结果。
这种现象因此被称为“病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）”。
基于这种机制的启发，人们尝试将植物基因片段插入到病毒载体z 中，侵染植物达到实现基因表达的抑制。
经过多年的研究与发展，该技术已经逐渐成熟，并广泛用于植物基因功能研究和植物遗传改良应用。
图1.诱导的植物基因沉默实例。
VIGS的作用机制VIGS的作用机制与另一种常用的基因沉默技术——RNA干扰（RNAi）有很多相似之处。
相较于RNAi，基因沉默具有快速、高效、通量高等优点。
VIGS是利用携带目的基因的cDNA 片段的病毒载体侵染植物，病毒在植物体内的复制和转录能特异性诱导和插入片段序列同源的mRNA降解或者诱导其被甲基化等修饰，导致其不能正常翻译，从而引起植物表型或者指标发生变化。
具体地，病毒在植物体内的复制和表达过程中会形成双链RNA（double-strandedRNA, dsRNA）。
dsRNA首先被Dicer类似物（DCL，如DCL4）的RNase-III家族特异性核酸内切酶切割成小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）。
siRNAs进一步扩增，并以单链形式与Argonatute（AGO）RNA结合蛋白和RNase结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingplex，RISC）。
RISC能与同源RNA特异性互补结合，导致同源mRNA降解，发生转录后水平的基因沉默。
或者，RISC能与细胞核内的同源DNA相互作用导致其被甲基化修饰，发生转录水平的基因沉默。
什么是植物病毒载体
什么是植物病毒载体
植物病毒载体是一种被植物病毒利用的工具，用于传送和复制病毒基因组。
病
毒载体通常是由病毒的部分基因组构建而成，通过基因工程技术进行改造，使其能够携带外源基因并在植物细胞内表达。
这种技术被广泛应用于转基因植物研究和植物基因功能研究。
植物病毒载体的构建一般包括选择适当的病毒种类、提取病毒RNA并进行相
应的改造，然后将外源基因插入到载体的适当位置。
通过转化植物细胞，植物病毒载体可以在感染植物后将外源基因导入植物细胞内，使其表达目标基因，从而实现基因功能的研究和植物性状的改良。
植物病毒载体在植物遗传工程领域具有重要的应用意义。
它不仅可以用于转化
多种重要的经济植物，如水稻、小麦、玉米等，还可以用于研究植物抗病性、生长发育等重要性状。
此外，植物病毒载体还可以作为病毒疫苗的载体，用于研发植物病毒病的防治措施。
总的来说，植物病毒载体是一种重要的研究工具，为了深入了解植物基因功能、培育高产、高抗性植物品种等方面的研究提供了有力的支持。
随着生物技术的不断发展，植物病毒载体技术有望在农业生产和科学研究中发挥越来越重要的作用。
植物病毒的传播途径有哪些方式
植物病毒的传播途径有哪些方式植物病毒在农业生产中造成了严重的危害，其传播途径多种多样，了解这些传播方式对于控制病毒病害至关重要。
以下是植物病毒的主要传播途径方式：1. 昆虫传播昆虫是植物病毒传播的主要载体之一，它们通过叮咬植物来传播病毒。
一些常见的昆虫包括蚜虫、介壳虫和叶蝉等。
当昆虫叮咬感染的植物，病毒就会通过昆虫的口器传播到健康植物。
2. 种子传播种子也是植物病毒的传播途径之一。
植物病毒可以通过感染的种子在播种过程中传播到健康植株。
因此，在种植过程中，要选择病毒不受感染的健康种子，并采取适当的处理方法，以减少病毒传播的可能性。
3. 风传播风是另一个常见的植物病毒传播途径。
病毒可经由空气中的微小颗粒，如尘埃、花粉等，通过风传播到其他植物上。
在强风的情况下，病毒的传播范围可能会更广，因此应注意防止病毒通过风传播。
4. 机械传播机械传播是指当感染的植物与健康植物接触时，由于接触物体的传播而导致病毒传播。
例如，使用未经消毒的工具或器具在植物之间操作时可能会传播病毒。
因此，使用前应对工具进行彻底清洁和消毒以防止病毒传播。
5. 土壤传播有些植物病毒可以通过土壤传播到健康植物上。
这通常发生在植物根部受到损伤或感染的情况下，使病毒通过土壤中的根系传播到其他健康植物。
因此，正确管理土壤和预防损伤对于减少土壤传播的风险至关重要。
总之，了解植物病毒的传播途径对于预防和控制病毒病害至关重要。
通过采取有效的防治措施，如加强病毒监测与检测、合理施肥和灌溉、选择抗病品种等方式，可以有效减少植物病毒的传播，保障农作物的健康生长。
生物技术考试综合复习题(全面详细必考题)
1、生物技术的概念，它是如何发展起来的？生物技术（Biotechnology）:有时也称生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。
2、农业生物技术包括哪些内容？细胞工程Cell engineering 基因工程Genetic engineering酶工程Enzyme engineering 发酵工程Fermentation engineering 蛋白质工程Protein engineering3、谈谈目前农业生物技术的应用情况？农业生物技术应用包括三个方面：一、植物组织培养（细胞工程）Plant Tissue Culture (Cell engineering)1、种苗脱毒茎尖培养可以得到无病毒苗木，已成为解决病毒病危害和品种退化问题的一个重要途径。
兰花、草莓、柑橘、土豆等；脱毒方法：物理脱毒方法: 热处理生物脱毒方法：茎尖培养；愈伤组织培养；微体嫁接离体培养；珠心组织培养；化学脱毒方法：在组织培养过程中加入化学物质（三氮唑核苷等）综合脱毒方法：比如热处理与茎尖培养结合等；2、快速繁殖操作过程无菌培养物的建立；1茎芽的增殖2离体枝条的生根；3植株的移栽；3细胞工程育种:1利用培养变异，筛选优良突变体2利用远缘杂交幼胚培养，获得杂种植株，克服其杂交不亲和性3利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性4倍性育种，缩短育种年限4、离体种质保存:利用组织培养法，低温保存（－196℃）或试管保存，为保存和抢救濒临灭绝的生物带来希望。
5、细胞培养生产有用物质（生物制品）:利用细胞培养生产次生物质，如药物、色素、食品添加剂、酶、农药等。
（二）基因工程方面1、植物种子品质改良2、抗虫、抗除草剂作物育种3、生物能源生产4、转基因植物生产疫苗或治疗蛋白5、利用秸杆喂养动物发展养殖业6、遗传转化与酿酒工业7、遗传转化与花卉工业（三）分子标记辅助育种1、常用培养基由哪些成分构成？无机营养物、有机营养物、植物生长调节物质、其他（凝固剂、其他附属物（活性炭、渗压剂、硝酸银、抗生素））2、MS培养基是如何配制的？注意事项有哪些？（一）母液的配制配制母液有两个好处: 可减少每次配制称量药品的麻烦; 减少极微量药品在每次称量时造成的误差,一般需准备5种母液:A）大量元素母液:可配成10倍母液,用时每配1000ml培养基取100ml母液。
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植物病毒载体的类型及应用摘要：植物病毒载体可分为5种类型，烟草花叶病毒载体是最常用植物病毒载体。
植物病毒载体应用广泛，有诸多优点，也存在一些问题。
本文对植物病毒载体进行综述。
关键词：植物病毒载体；类型；烟草花叶病毒载体；应用The Types and Application of Plant Virus VectorsAbstract: Plant virus vectors can be divided into five types. Tobacco Mosaic Virus vector is the most commonly used plant virus vector. Plant viral vectors are widely used. They have many advantages，as well as some problems. This article provides an overview of plant virus vectors. Key words: plant virus vectors; type; Tobacco Mosaic Virus vector;applicationDNA 体外重组是基因工程技术的重要步骤之一，它是将外源目的基因与适当的载体相连。
要把一个目的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，这个携带目的基因进入受体细胞中的工具就称为载体(V ector)。
载体有很多种，病毒载体是其中的一种。
病毒载体是利用病毒的基因组序列元件构建的真核基因转录工具[1]。
植物病毒载体的研究开展得较晚，1984 年才诞生了第一例由植物DNA病毒——花椰菜花叶病毒(Califlower mosic virus，CaMV)构建的载体。
但是植物病毒载体具有很多优点，例如短时间内可以生产大量成本低廉的外源蛋白，满足医药及工业用蛋白的需求。
因此，1984年之后，人们尝试了多种植物病毒载体构建方法。
目前已经构建了多种类型的植物病毒载体，已有用植物病毒载体pClYVV 表达了绿色荧光蛋白基因[2]、Nodulin gene基因、人的α-干扰素基因及小球状病毒抗原蛋白基因等的报告[3]。
近年来也逐步利用植物病毒载体作为探针，用于研究植物和植物病原基因的表达调控、编码产物的功能以及植物与病原的相互作用。
一植物病毒载体的类型植物病毒载体可分为置换型载体、插入型载体、互补型载体、抗原展示型载体和融合/释放型载体5 种。
1置换型载体置换型载体是最原始的载体类型，由外源基因置换对植物病毒基因组复制影响不大的基因构建而成，一般用于转染原生质体进行瞬时表达以验证构建载体的可行性，较少接种于植株来系统地表达外源基因。
CaMV 首先被用于构建置换型载体的研究。
用外源基因置换CaMV 的基因Ⅱ(蚜传因子)后不影响其侵染性，成功地表达了细菌二氢叶酸还原酶(DHFR)和人α-D 干扰素基因[4]，IFN-αD 的表达量可达到2μg/g(鲜叶)。
DEC 20122 插入型载体插入型载体是在病毒基因组中引入额外的亚基因组启动子，将外源基因插入此启动子下游，随病毒的增殖使外源基因得以大量表达。
构建插入型载体至少要考虑外源基因的插入位置、外源基因的大小和外源基因的启动子3个因素。
外源基因的插入不能影响病毒正常基因的表达，外源基因不能过大，否则可能会影响病毒外壳的组装和运动而使外源基因不能表达。
对于球状或二十面立体等轴对称病毒来说，包装限制决定了插入的外源编码序列不能太大。
丝状或杆状植物病毒，如CaMV、马铃薯Y 病毒(Potato virus Y，PVY)和豇豆花叶杆状DNA 病毒(Cowpea mosaic virus，CPMV)等植物病毒因为不存在包装限制，适于构建插入型载体[5]。
通常用病毒的CP （衣壳蛋白）或复制酶亚基因组启动子，为了避免同源重组，需采用亲缘关系较远病毒的亚基因组启动子。
目前主要有马铃薯X病毒(Potato virus X，PYX)[6]、烟草花叶病毒、豇豆花叶病毒和番茄丛矮病毒(Tomato bushystunt virus，TBSV)这4种植物病毒用于构建插入型载体，其中PYX 载体多用做探针，研究植物和植物病毒基因结构与功能，以及病毒与宿主之间的相互作用。
烟草花叶病毒和豇豆花叶病毒载体主要用于展示医药用的外源小肽。
3 互补型载体为了弥补置换型载体和插入型载体的不足，研究人员设计了互补型载体。
互补型载体是将外源基因插入缺陷型病毒或亚病毒粒子中，通过转基因植物或与辅助病毒共侵染而互补缺陷。
利用转基因植物表达病毒基因是由转基因植株提供失活基因产物，弥补缺陷型病毒载体失去的功能。
亚病毒互补载体系统利用亚病毒表达外源基因，与辅助病毒共接种，由辅助病毒提供失活基因产物。
构建亚病毒互补载体系统是一个很有希望的方向，但需要进一步研究外源基因插入的位点、载体的稳定性及对寄主植物症状和病毒运动的影响。
4 抗原展示型载体抗原展示是将外源基因选择性地插入病毒CP 基因中融合表达，而正好使外源多肽呈现在病毒粒子表面，通过提纯重组病毒即可获得大量的抗原[7]。
这种方法避免了双亚基因组启动子可能的同源重组，增强了外源多肽的抗原性，因而适用于抗原性较差、难以用其他方法表达和纯化的小肽。
但构建抗原展示型载体需要在原子水平了解病毒的结构，因而仅用于结构较为清楚的几种病毒，应用较多的是TMV、CPMV 和TBSV。
5融合/释放型载体这是新近发展的病毒载体类型。
它建立在插入型载体的基础之上，为了避免双亚基因组启动子可能带来的不稳定性和融合表达可能影响病毒的系统侵染，在插入外源基因的同时在病毒基因组中引入病毒自身蛋白酶的切割加工位点或口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白酶序列，使外源基因与CP的融合表达产物能被蛋白酶切割而释放。
Santa等构建了PVY 的融合/释放载体，研究表明该载体不仅能系统侵染和表达游离的绿色荧光蛋白(GFP)和CP(能提供系统侵染功能)，也产生大量的GFP-CP 融合蛋白，并组装成病毒粒子，子代病毒粒子的浓度约为野生型PVY 的2 倍。
二烟草花叶病毒载体烟草花叶病毒(TMV)是目前研究最为广泛的一类植物病毒，病毒粒子为短杆状，能在被侵染的植物细胞中大量积累，具有作为表达载体的潜力[8]。
迄今，TMV 载体成功表达的外源基因至少已有150 种。
1TMV的基因组结构TMV是单链RNA 病毒，基因组长6395个核苷酸，包括4个编码区，至少编码4种多肽，分别是126ku、183ku、30ku 和17.5ku 蛋白[9]。
其中126ku 和183ku两种病毒蛋白参与病毒的复制，而30ku 蛋白质则与病毒从一个细胞转移到另一个细胞的运动有关，又称移动蛋白(MP)，17.5ku 蛋白为病毒的外壳蛋白(CP)。
由此可见，这3 种蛋白质是TMV在被感染的植株中传播繁殖的基本条件。
鉴于外壳蛋白质能够大量地合成，同时又是病毒繁殖的非必要成分，即使外源基因插入导致外壳蛋白突变失活，对病毒的繁殖也是无关紧要的。
因此，该基因被认为是导入和表达外源基因的理想位点[10]。
2TMV克隆载体的构建N. Takamatsu 等在1987 年发展出一种经过修饰改造的、可以在体外转录出具感染性的TMV-RNA 的全长TMV-cDNA 克隆。
把细菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，插入在该克隆中紧挨外壳蛋白基因起始密码子的下游，构成了TMV-cDNA-CAT重组体。
然后把此重组体体外转录形成的转录物接种烟草植株，结果在被接种的烟草叶片中观察到了CA T 活性。
由于TMV不存在包装限制，Dawson 等于1989 年构建了一个可复制的附加载体来弥补TMV替换载体的不足，在这个附加载体中保留了完整的野生型基因组[11]。
Dawson 及其同事在TMV 基因组的运动蛋白基因和外壳蛋白基因之间加上了一个细菌cat 基因，这个cat 基因受双倍的外壳蛋白亚基因组启动子调控。
在这种情况下，系统性感染伴随着高水平CA T 活性而发生，但是在感染植物中发生的重组会使外源转入基因产生缺失并产生野生型的TMVRNA。
用齿瓣兰环斑病毒上的等价基因替换TMV 外壳蛋白基因可以防止同源重组的发生。
这种方法已用来产生一系列非常稳定的表达载体，这些载体可用于在植物中合成许多有价值的蛋白。
三植物病毒表达载体的应用1 基础研究领域的应用植物病毒载体的出现为许多基础生物学研究提供了强有力工具，包括基因重组，植物病毒的运动，包壳和传播，鉴定和分析基因的功能以及基因沉默等。
2商业应用植物病毒载体最有价值的应用是生产医用蛋白或疫苗[12]，因而备受重视。
迄今为止，利用植物病毒载体至少已有20 多种医用蛋白或疫苗抗原获得成功表达。
例如，在大肠杆菌中表达α天花粉蛋白时，表达量仅占细菌总蛋白的0.01%，而用TMV 做载体，表达量高达可溶性蛋白的2%，而且构建的载体还可以系统侵染烟草植株。
由于α天花粉蛋白在治疗人免疫缺陷病毒(HIV)病中具有很好的疗效，因此大量生产α天花粉蛋白不仅可望用于临床治疗，还可以用于研究HIV 的分子致病机理。
四植物病毒载体表达外源基因的优点①部分植物病毒对寄主的感染是系统性的，它能够将其基因组扩散到被感染植株的所有细胞。
因此，如果在病毒的基因组上插入外源基因，那么它也就会系统地分布到整个植株，无须经过从原生质体到再生植株的繁琐程序。
病毒的这种感染方式，为简化植物基因工程中外源基因的传递过程提供了极大的可能性。
②植物病毒载体有可能解决将外源基因导入像玉米这样的单子叶植物的问题。
Ti质粒载体只能有效地转化双子叶植物，但对诸如小麦、水稻这样的单子叶植物，依然有不少困难。
而像双生病毒(geminivirus)由于具有广泛的寄主范围，有可能被发展成单子叶植物基因克隆载体。
③被感染的植株能够繁殖出大量的病毒颗粒，因此有可能通过重组病毒载体利用植物来生产大量的外源蛋白质[13]。
这也就是说，可以不必使用高成本、高投入的酵母或细菌发酵罐，就可以直接在大田种植，获取大量廉价的药用蛋白及具有重要经济意义的商品蛋白质。
五植物病毒载体存在的问题1 稳定性植物病毒载体的致命缺点是稳定性较差，常由于病毒基因的重组而导致丢失外源基因[14]。
这可能是由于插入型载体的双亚基因组启动子的同源重组造成的。
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