重组蛋白的表达系统(详细版).ppt
重组蛋白的表达
重组蛋白的概述
1.概述
分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点
表达策略优点缺点
分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成
降低蛋白酶对表达蛋白的降解
可获得确定的N末端
显著减少杂蛋白水平，简化纯化
不需要细胞破碎
表达水平低
多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩
petduet1 pacycduet 原理
Petduet1和pacycduet是两种常用的双元表达系统，用于原核和真
核表达重组蛋白。它们都包含了两个不同的多克隆位点，可以用于插
入感兴趣的基因并进行表达。Petduet1使用了T7和lacUV5启动子，pacycduet则使用了T7和CMV启动子。以下是关于这两种系统的详细介绍：
Petduet1和pacycduet系统的结构
Petduet1和pacycduet系统的DNA载体结构大体相似，都包括了多个重要元件：双选择标记位点（Ampicillin和Chloramphenicol）、启动子（T7和lacUV5/CMV）、His标签、HA标签、TEV位点、定
向载体和复制起点等。
Petduet1由5429bp长的质粒构成，其中含有lacIq基因的启动子和
T7启动子，并通过MCS1和MCS2多克隆位点构建了重组基因组成，方便插入两个不同的重组蛋白基因。Petduet1还包含了His标签和
HA标签，对于蛋白的纯化和检测非常有帮助。
Pacycduet的质粒长度为5726bp，包含了Ampicillin和Chloramphenicol的双选择标记位点，T7和CMV的启动子，His标签和HA标签。与Petduet1类似，pacycduet也有MCS1和MCS2
多克隆位点，方便插入两个感兴趣的基因。pacycduet还包含了TEV
位点，方便进行蛋白纯化和切割。
Petduet1和pacycduet系统的应用
这两种双元表达系统可以广泛应用于原核和真核系统中，用于表达多
种蛋白。研究表明，它们不仅可以同时表达两个重组蛋白，而且还可
重组蛋白表达体系
表达产物的纯化问题
总结词
表达产物的纯化是重组蛋白表达体系中的另 一个挑战，它涉及到如何有效地分离和纯化 目标蛋白。
详细描述
表达产物的纯化问题通常与目标蛋白的溶解 性、稳定性以及与其他蛋白质的相互作用有 关。为了解决这一问题，研究人员可以采用 多种纯化方法，如离子交换、凝胶过滤、亲
和层析等，以获得高纯度的目标蛋白。
载体选择与构建
载体选择
根据目的基因的性质和表达需求，选择适合的载体（如质粒 、病毒等）。
载体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ建
将目的基因插入到载体中，形成重组载体，为后续的基因表 达做好准备。
目的基因插入与表达
目的基因插入
将重组载体导入到宿主细胞中，使目 的基因在细胞内得以表达。
目的基因表达
在宿主细胞内，目的基因通过转录和 翻译过程，合成相应的重组蛋白。
VS
详细描述
免疫学检测方法包括酶联免疫吸附试验 （ELISA）、免疫荧光技术、免疫沉淀等。 这些方法利用抗体与抗原之间的特异性结 合反应，能够灵敏地检测重组蛋白的表达 产物。其中，ELISA方法具有操作简便、灵 敏度高和特异性强等优点，是常用的免疫 学检测手段之一。
05
重组蛋白表达体系的挑战与解决方案
重要性
重组蛋白表达体系是现代生物技术中的重要组成部分，为药物研 发、生物制品生产、基因功能研究等领域提供了关键的技术支持 。
重组蛋白的概述
重组蛋白的概述
1.概述
分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点
表达策略优点缺点
分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成
降低蛋白酶对表达蛋白的降解
可获得确定的N末端
显著减少杂蛋白水平，简化纯化
不需要细胞破碎
表达水平低
多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩
重组蛋白的表达
重组蛋白的表达
1.概述
分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）时期，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面阻碍到下游的分离纯化，因此在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的阻碍，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著阻碍下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依靠于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间能够幸免破裂细胞的步骤，同时由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对集合的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的阻碍，关于其中的有些缺点能够通过一定的方法进行克服和幸免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能爱护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点
表达策略优点缺点
分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成
降低蛋白酶对表达蛋白的降解
可获得确定的N末端
显著减少杂蛋白水平，简化纯化
不需要细胞破裂
表达水平低
多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩
重组蛋白的表达
重组蛋白的概述
1.概述
分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点
表达策略优点缺点
分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成
降低蛋白酶对表达蛋白的降解
可获得确定的N末端
显著减少杂蛋白水平，简化纯化
不需要细胞破碎
表达水平低
多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩
蛋白表达及纯化PPT课件
萃取法
液-液萃取法
利用两种不混溶的溶剂，将目标蛋白 质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中 。
反胶团萃取法
利用反胶团形成的微环境，选择性分 离和纯化蛋白质。
色谱法
凝胶色谱法
利用凝胶介质对不同大小的蛋白质颗粒的分离作用，将目标蛋白质与其他杂质 分离开。
离子交换色谱法
利用离子交换剂对不同带电状态的蛋白质的吸附作用，将其与其他蛋白质分离 开。
目标蛋白活性保持问题
保持目标蛋白活性的方法
在纯化过程中，可以采用多种方法保持 目标蛋白的活性，如选择合适的缓冲液 、控制温度、避免机械搅拌等。这些方 法可以有效减少目标蛋白的失活。
VS
目标蛋白活性检测
在纯化过程中和纯化后，需要定期检测目 标蛋白的活性，以便了解其保持情况。活 性检测可以通过生物学活性检测、荧光检 测等方法进行。
03
蛋白纯化流程
细胞破碎
细胞破碎是蛋白纯化的第一步，通过物理或化学方法将细胞破碎，释放出细胞内的 蛋白质。
常用的物理方法包括超声波破碎和高压破碎，化学方法包括使用表面活性剂或酸碱 溶液。
细胞破碎后，需要将破碎的细胞碎片与蛋白质分离，以便进行后续的纯化步骤。
初步分离
初步分离的目的是去除大部分 的杂质，使目标蛋白质得到初 步的纯化。
01
03
蛋白质相互作用研 究
研究蛋白质之间的相互作用对 于理解生物学过程、疾病机制 和治疗策略具有重要意义。通 过纯化技术可以获得高纯度的 蛋白质，进而研究其相互作用 。
蛋白质表达系统课堂PPT
1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、 酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特 性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。
2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿 主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载 体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达 载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导， 外源基因可以在宿主中表达。
8
哺乳动物表达系统
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的 感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时 间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源 基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出 目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、 增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。
7
杆状病毒系统的主要有点包括
1，组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白 的正确折叠、二硫键的搭配
蛋白质重组表达过程
蛋白质重组表达过程
蛋白质重组表达是指将外源基因插入宿主细胞中进行蛋白质的高效表达，常用的表达宿主包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。蛋白质重组表达的过程通常包括以下步骤：
1. 获取目标基因：通过DNA克隆技术，将目标蛋白质的基因序列从源生物中扩增得到。
2.构建表达载体：将目标基因插入到合适的表达载体中。表达载体通常包括启动子、转录终止子和选择性标记基因等。
3.转化宿主细胞：将表达载体导入宿主细胞中，常用的方法有化学方法、电穿孔法和细胞感染法等。
4.筛选重组细胞：利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的重组细胞。
5.优化表达条件：通过调控培养条件、温度、培养基组分等方法，优化蛋白质表达水平。
6.蛋白质纯化：利用亲和层析、柱层析和电泳等方法，从细胞裂解液中纯化目标蛋白质。
7.蛋白质鉴定和检测：利用酶联免疫吸附测定法、质谱和Western blot等方法，对蛋白质进行鉴定和检测。
通过以上步骤，可以实现外源蛋白质的高效表达和纯化。
蛋白质表达PPT课件
基因转染技术
基因转染技术是一种将外源DNA或RNA导入细胞的技术。通 过基因转染技术，可以将目的基因导入到细胞中，实现目的 基因的表达。
基因转染技术是蛋白质表达的重要手段之一，通过基因转染 技术可以将目的基因导入到各种类型的细胞中，如原代细胞 、干细胞、肿瘤细胞等，实现目的基因的表达和功能研究。
基因敲除技术
蛋白质表达
目录 CONTENT
• 蛋白质表达概述 • 蛋白质表达系统 • 蛋白质表达技术 • 蛋白质表达的应用 • 蛋白质表达研究展望
01
蛋白质表达概述
蛋白质表达的定义
蛋白质表达
是指基因经过转录和翻译，将DNA中的遗传信息转变成蛋白质的过 程。
转录
是指以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成RNA 的过程。
基因敲除技术是一种通过特定手段将细胞中的某个基因去 除或沉默的技术。通过基因敲除技术，可以研究特定基因 在细胞中的作用和功能。
基因敲除技术也是蛋白质表达的重要手段之一，通过基因 敲除技术可以研究特定基因对蛋白质表达的影响和作用机 制，为蛋白质表达的研究提供重要的实验依据。
基因编辑技术
基因编辑技术是一种对DNA进行精确 修改和编辑的技术。通过基因编辑技 术，可以实现对特定基因的敲除、插 入、突变等操作。
酵母表达系统在工业生产中具有一定的应 用价值，可以用于生产酶制剂、生物材料 等。
重组蛋白的表达系统详细版
降低外源基因的 污染
减少重组蛋白的 免疫原性
提高重组蛋白的 稳定性
优化重组蛋白的 表达条件
汇报人：XX
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开发新型的宿主细胞：寻找或改造适合目的蛋白表达的宿主细胞，以提 高表达效率和产物纯度。
优化基因工程技术：利用基因编辑技术，对目的基因进行改造和优化， 以提高重组蛋白的表达量和稳定性。
开发新型的表达载体：设计和构建新型的载体，如病毒载体、质粒载体 等，以促进目的基因在宿主细胞中的转录和翻译。
技术支持。
高效表达：重组蛋白表达系统能够高效地表达出目标蛋白，提高实验效率和实验结果的 可重复性。
方便操作：重组蛋白表达系统操作简单，易于实现自动化和规模化生产，适合大规模应 用。
安全性高：重组蛋白表达系统能够避免使用天然病毒或细胞系等危险物质，降低实验风 险。
可重复性强：重组蛋白表达系统具有高度可重复性，有利于实验结果的比较和验证。
安全性问题：在 某些情况下，重 组蛋白表达系统 可能存在宿主细 胞毒性、免疫原 性等问题，影响 其应用安全性。
优化宿主细胞：选 择更合适的宿主细 胞，以提高重组蛋 白的表达水平。
基因工程改造：通过基 因敲除、基因突变等技 术手段改造重组蛋白基 因，提高表达水平。
重组蛋白的表达系统
生物制药中的应用实例
用于生产疫苗
用于生产生长因子等生物活 性物质
用于生产治疗癌症的药物
用于生产单克隆抗体
新药研发中的应用实例
用于生产单克隆抗体药物 用于研究蛋白质相互作用和信号转导 用于开发疫苗和诊断试剂 用于药物筛选和药物靶点验证
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昆虫细胞表达系统：以Sf9和Bm5细胞为代表优点是 能够进行真核翻译后修饰表达的蛋白具有生物活性； 缺点是操作较为复杂且表达量有限。
添加 标题
哺乳动物细胞表达系统：以CHO和HEK293为代表 优点是能够高度模拟真核生物的翻译后修饰表达的蛋 白具有高度生物学活性；缺点是操作复杂成本高且表 达量有限。
重组蛋白的表达系统
目录
单击此处添加文本 重组蛋白表达系统的概述 重组蛋白表达系统的原理 重组蛋白表达系统的技术方法 重组蛋白表达系统的优缺点 重组蛋白表达系统的应用实例
重组蛋白表达系统的定义
重组蛋白表达系统是一种用于生产重组蛋白的生物技术平台 它通过基因工程技术将外源基因在宿主细胞中进行表达 重组蛋白表达系统广泛应用于生物医药、农业、工业等领域 常见的重组蛋白表达系统包括原核表达系统、真核表达系统等
试剂等。
医学研究中的应用实例
疾病诊断：重组蛋白表达系统可用 于制备特异性抗体用于诊断各种疾 病。
疫苗研发：利用重组蛋白表达系统 可以制备出各种病毒的抗原用于疫 苗的研发和生产。
蛋白表达概述课件
《蛋白表达概述》PPT课件
目的蛋白的应用
分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制 备抗原等。大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。可能有多 种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是， 能用于大量纯化的载体-宿主菌-培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。如果要 连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体-宿主菌-培养条件的 组合以便找到最佳条件，是非常值得的。
缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②培养上清多糖浓度高，不利于纯化。
《蛋白表达概述》PPT课件
昆虫细胞表达系统
利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。
优越性： ①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配； ②可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体； ③可进行分泌表达。
常用蛋白表达系统(host)
原核细胞：大肠杆菌。 真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞
《蛋白表达概述》PPT课件
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解； ②商品化的载体和菌株种类非常齐全； ③表达效率高； ④易培养，成本低。
蛋白诱导表达_2017年分子生物学实验 PPT
➢ 乳糖+阻遏蛋白，改变阻 遏蛋白的形状。
9.1.4 诱导原核表达的原理
E.Coli BL21（DE3）：DE3是整合在细菌基因组上的一
种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，其 基因型为：lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5
几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白, 数小时后达细胞总蛋白的50%以上 • 非诱导条件下:
可使目的基因完全处于沉默状态而不转录
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
9.1.3 乳糖操纵子
➢ 结构基因：编码-半乳 糖苷酶（Z）、透性酶 （Y）和硫半乳糖苷乙酰 转移酶（A）的基因。
➢ 操纵子：包括启动子、 操纵基因和结构基因
干净,且要充分悬浮。 每个时间点的样品要立即制样
并做好标记。
思考题
如何通过调节IPTG的浓度和温度来 控制蛋白表达速度，从而提高蛋白的 可溶性？
下次实验
诱导表达蛋白的 SDS-PAGE 电泳检测
• 还必须具有用于外源基因表达的启动子、 SD序列、及转录终止子等元件。
• pET系列：6 His Tag （660Da-2kDa） pGEX系列：GST （26kDa） pMAL系列：Maltose Binding Protein
（52kDa）
pET系列
pet系统原核表达详细总结精品PPT课件
用于克隆的宿主菌
用于克隆的宿主菌通常是Novablue， JM109以及DH5a。这些菌株是rec-end-型， 转化效率高，且质粒产量也高，适合用于 保存带有克隆目的基因的PET载体。
用于表达的宿主菌
BL21(DE3) 基因型： F– ompT hsdSB (rB– mB–) gal dcm (DE3) 无抗性 重组质粒转化到带有T7RNA聚合酶基因 的大肠杆 菌中，即可开始产生蛋白了。这些菌株都是DE3 溶原菌。噬菌体DE3是一种衍生噬菌体，带有噬 菌体21抗性区和lacI基因，lacUV5启动子，以及 T7RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因 此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体 上或从染色体切出，一旦形成DE3溶原状态，就 只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7RNA聚 合酶基因转录。
不依赖连接反应的克隆方法（LIC）
用LIC法制备的pET载体有不互补的单链粘端，与目的插 入片段上相应的粘端互补。扩增目的插入片段的引物5,端 序列要与LIC载体互补。T4DNA聚合酶的3 , -5 , 外切酶活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由 制备好的插入片段和载体互相形成退化产物，这种方法十 分快速高效且为定向克隆。pET载体上编码的氨基酸序列 可通过肠激酶或X因子去掉。
pET载体
pET载体最初是由Studier及其同事构建。 (Studier and Moffatt,1986; Rosenberg et al., 1987; Studier et al., 1990). 包括两种载体——转录载体（用于表达本 身含有核糖体结合位点和起始密码子目的 基因）和翻译载体（载体上带有核糖体结 合位点）。一般来说，转录载体用于表达 来自原核的基因，而翻译载体表达真核基 因。