重组蛋白的表达系统(详细版).ppt
重组蛋白的表达
重组蛋白的概述1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。
目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。
选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破碎表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离保护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。
重组蛋白质表达、复性与纯化.ppt
• Flag-tag (DYKDDDDK)
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有前景的特殊用途的tag
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100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. • 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯)
在大肠杆菌中表达 重组蛋白质
• 如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构, 尽可能进行可 溶性表达;
• 如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清, 采用包含体表达 比较好;
• 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达: pel/ompT分泌肽
• 质粒不稳定，尚无商品化的表达 载体
其他
•乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
两种主要的分子伴侣
Type I: chaperones which are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide– HSP family,GroELS,ect.
第五章 重组蛋白质表达与纯化
第五章重组蛋白质的表达、复性与纯化为什么要重组基因表达？1.蛋白质功能研究2.生物制药和疫苗生产3.疾病的基因治疗4.食品、化工用酶制剂5.抗虫、抗逆植物改良6.细胞代谢产物的富集•基因表达体系及优劣势•大肠杆菌表达体系•蛋白质的复性•工作中经常碰到的问题基因表达体系1.原核体系2.真核体系大肠杆菌(Escherichia coli)•遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；•基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰枯草杆菌(Bacillus subtilis)•分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；•无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；•质粒不稳定，已有商品化的表达载体（枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌）。
其他•乳酸菌(Lactic acid bacteria)•沙门氏菌(Salmonella typhimurium)•苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)真核细胞表达体系酵母细胞昆虫细胞植物细胞/组织哺乳动物细胞/组织酵母细胞•可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有糖基化修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;•糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;•商品化表达体系：酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）;毕氏酵母(Pichia pastoris);裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）蛋白质糖基化的分类1.O-糖基化:糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser 或Thr等侧链的羟基处2.N-糖基化:糖链连接在Asn-X-Ser或Asn-X-Thr （X是除Pro以外的任何氨基酸）中Asn的氨基侧链处3.GPI-Anchor糖基化:蛋白质通过肽链的C端共价连接的糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。
昆虫细胞•可以病毒感染的形式在成虫中生产，也可在体外培养细胞生产蛋白;•适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；•糖链有所区别，表达量有限；•作为药物宿主细胞未被FDA认可CHO细胞•可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；•表达量不够高，培养成本较高植物组织•植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；•转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；•表达量较难提高，分离纯化不方便动物乳腺组织•分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；•转基因动物制作花费巨大，实验周期长鸟类输卵管组织•分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；•实验成本低，饲养费用低；•加糖方式可能与人有所不同体系选择研究基因功能:大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:大肠杆菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:杂交瘤细胞工业酶生产:各种微生物有可能以后能做到的事∙在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素∙在大肠杆菌中生产人凝血IX因子∙在大肠杆菌生产Calcitonin类C端酰胺化短肽∙在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰∙在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化∙在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化∙提高乳腺分泌表达的Factor IX类因子的活性∙在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化在大肠杆菌中表达重组蛋白质•如果目的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构, 尽可能进行可溶性表达;•如果目的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清, 采用包含体表达比较好;•如果目的多肽的分子量小于10 kDa, 一定要进行融合表达大肠杆菌表达载体分类按蛋白质类型分•单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体•融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc •分泌表达: pel/ompT分泌肽按启动子分•lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子IPTG诱导•lamda phage P L和P R启动子热诱导•T7 启动子IPTG诱导•T5 启动子IPTG诱导•ara启动子阿拉伯糖诱导常用表达载体•pJLA50X 系列; pcDNAII; etc •pET 系列(T7 promoter, Novagen 公司)•pQE系列(T5 promoter, Qiagen公司)•pMAL系列(周质表达, BioLabs公司)•pGEX系列(GST融合表达, Pharmacia公司)•pBAD系列(Arabinose诱导型)•pTYB系列(CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)各种融合蛋白表达载体•Protein A•GST（glutathione S-transferase）•CBD (chitin-binding domain, BioLabs;cellulose-binding domain, Novagen)calmodulin-binding domain, Stratagene)•MBP (maltose-binding protein)•GFP (green fluorescence protein)•Thioredoxin **帮助二硫键形成•Dsb (periplasmic enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与•SUMO (small ubiquitin-related modifier) •KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀可用亲和层析纯化帮助可溶化帮助分泌到周质让表达产物可溶化•采用MBP融合•采用GST融合•采用CBD融合•采用thioredoxin融合•采用Origami等宿主菌•降低菌体培养的速度温度(15-30℃), 降低转速让蛋白质分泌到间质去•采用CBD 融合(pET36/37)•采用Dsb融合(pET39/40)•采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22)•采用带MBP融合(pMAL载体, Biolabs)•采用带SUMO融合(pET SUMO, Invitrogen)纯化方便: 先用EDTA/蔗糖溶液处理, 然后5 mM MgSO4 洗出•His-tag (6-8 Histidine )•T7-tag (MASMTGGQQMG )•HSV-tag (QPELAPEDPED )•S-tag (KETAAKFERQHMDS )•VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK )•HA-tag (YPYDVPDYA )•Flag-tag (DYKDDDDK ) •Myc-tag (EQKLISEEDL )各种用于抗体识别的标记为什么要加tag ?有前景的特殊用途的tag •Biotinylation-tag100多AA的结构域,在大肠杆菌中被识别为生物素化的位点. Promega的PinPoint TM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST.•未命名DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合(个人通讯)•未命名一些病毒外壳蛋白的片段, 破坏细胞膜的结构导致容易进入细胞融合蛋白的专一性切割•DTT: intein的↓Cys •溴化氰: Met↓•Thrombin: LVPR↓GS •Factor Xa: IEGR↓•Enterokinase: DDDDK↓•PreScission TM protease:LEVLFQ↓GP •Genenase I TM PGAAHY↓•TEV protease:ENLYFQ↓G特殊的表达用菌株•BL21(DE3)/pLysS : 自身表达T7 RNA polymerase 适用pET系列等带T7启动子的载体•M15/SG13009 : 自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体•BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突变•Origami(DE3): thioredoxin reductase/ glutathione reductase 双突变适合带thioredoxin reductase的融合表达载体, 帮助形成更多的二硫键•BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达•BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达重要的原核表达质粒提供商•Novagen•Stratagene•Invitrogen•BioLabs•Qiagen•Pharmacia•Promega•Clontech•Roche•Gibco/BRLThe protein folding Problem How to get to the bottom of the funnel? And,what is at the bottom?包含体蛋白质的复性方法•透析法: 简单; 但费时, 费缓冲液, 蛋白质量少，浓度不能过高(容易产生沉淀) •快速稀释法:最常用的小规模复性方法; 但比较费时,费缓冲液, 蛋白质的浓度不能高(容易产生沉淀)•超滤透析法: 比较省缓冲液, 处理量大; 但费时, 要控制好蛋白质浓度•凝胶过滤法:快速, 可重复性高, 不会产生沉淀, 操作复杂一点•亲和层析复性法, 水相二相法, etc工作中经常碰到的问题•表达量不够高；•包含体在8M尿素中不能溶解；•重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；•带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上；•Ni-chelating分离纯化的效果不好；•GST融合蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上；•包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；•Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？•贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？•某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高尝试不同表达载体，特别是N端有融合蛋白的载体•是不是忘了加还原剂（DTT 或巯基乙醇）？•是不是在－20℃冻存过？•用4M盐酸胍试试•是不是酸性蛋白质？•是不是蛋白质的合成提前中止了？（富含Arg, Ile, Leu, Pro这几种氨基酸）•可以尝试用BL21 CodonPlus RIL 或RP 作宿主菌(Stratagen)；•使用C端带His-tag的融合表达载体（如pET21, Novagen）以便纯化全长的融合蛋白•His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加0.5 mM EDTA来去除重金属离子的干扰；•His-tag被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较罕见）;•其他不明原因导致弱结合•样品没有很好细心去除不溶性物质•重复使用前树脂没有洗干净•蛋白质之间存在相互作用•可以提高盐浓度, 改变pH, 添加2-6 M尿素等方法来洗去杂蛋白质是不是在进行复性时用了Redox buffer尝试用Urea gradient /Gel filtration来解决尽快用0.1 N HCl冲洗用0.1 N NaOH / 0.1% SDS洗主要是溶氧量的问题, 可以通过在摇瓶中加入不同量的培养基的方式来确定最佳体积。
重组蛋白的大量表达
一、原理
1、E . coli 表达系统
E . coli 是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达
提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、步骤
1、一活：从-80℃取菌株，50 mL LB+50 uL抗生素（pet32:AMP，pet28:Kana）+50uL菌种（根据菌活性可多加），置于恒温振荡器中（37℃，150 rpm）培养过夜（约12 小时）。
2、二活：1 L LB+1 mL抗生素+50mL菌种，于恒温振荡器上（37℃，200 rpm）培养2小时。
3、取1.5 mL诱导前菌种，标记，加1 mL IPTG至二活后的LB培养基中根据相应条件诱导表达（低温(125rpm)，高温(150rpm)，8h，12h，20h）
4、诱导后取1.5mL菌，12000rpm离心2min，弃上清，加100uL PBS（可根据情况加50uL），吹打均匀(诱导前保留的菌也同样处理)，煮样，跑电泳。
详述重组蛋白表达系统
详述重组蛋白表达系统一、重组蛋白表达系统概述蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。
通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。
一般由以下几个部分组成：1、宿主。
表达蛋白的生物体。
可以为细菌、酵母、动物细胞，植物反应器、动物反应器等。
由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。
2、载体。
载体的种类与宿主相匹配。
根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。
载体中含有外源基因片段。
通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。
3、辅助成分。
有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。
比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。
二、大肠杆菌表达系统在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。
优点：表达水平高，低成本，易培养和大规模工业生产，生产迅速培养周期短，转化操作简单，蛋白表达量高且可以通过多个参数进行优化，容易形成二硫键。
缺点：蛋白折叠性较差（包括细菌蛋白），易形成包涵体，与真核生物不同密码子体系，真核蛋白表达后很少的翻译后修饰，分泌大量内毒素。
三、酿酒酵母不产生毒素，已被美国FDA确认为安全性生物，但酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。
因此，酿酒酵母一般不用做重组蛋白质表达的宿主菌。
优点：表达水平较高，分泌蛋白或细胞表达的良好选择，易培养且培养低成本。
拥有大多数真核生物的翻译后修饰，蛋白表达后有效折叠，无内毒素分泌。
缺点：比毕赤酵母的表达水平低，分泌能力可能低于毕赤酵母，糖基化与哺乳动物细胞不同。
过糖基化，N-端糖基链结构具有致敏性四、甲醇酵母表达系统（毕赤酵母）甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在该基因的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。
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1.2 质粒载体
• 大肠杆菌表达系统采用质粒为表达载体，质粒上的重要 元件包括复制子，启动子，终止子，多克隆位点，信号 肽，融合标签，筛选标记等（图1）。原核表达载体已 经发展得比较完善，有多种质粒可供选择(表4)。
• 复制子： • 复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数。通常情况下
• P突在L、变42c体s℃p菌A时启株诱动中导子，重使P组L宿等蛋主启白菌动表能子达够使；进得cs行宿pA温主启度在动依3子0赖℃则型时被的抑高表制温达重（。组37在蛋℃温白）度表抑敏达制感，，型而低 温（10℃）启动。温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入，降低了 使用成本，同时也降低了诱导剂对细胞的伤害。
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图1：大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点
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• 早期大肠杆菌表达体系中，常见的启动子是lac和lacUV5。lac是一个弱 启动子，很难使外源基因得到高表达。目前使用的含有需要小量共表 达的蛋白(如分子伴侣，蛋白抑制剂等)的载体，有很多都采用了经典 的lac启动子。
• 启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中 有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真 核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的 基因的高效表达。
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• 融合标签： • 融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组
标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本 身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也 不必引入标签。 • 融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、 pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。 • His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0）， 免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯 度。 • 如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮 助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困 难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白 产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。 • 标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮 助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度， 对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签； C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中 心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免 影响重组蛋白的结构和功能。
重组蛋白的表达系统详细版
优化培养条件：优化 培养温度、pH、营养 物质等条件，提高重 组蛋白的表达水平。
开发更高效的亲和层析技术，提高目标蛋白的纯度和回收率。 引入连续层析技术，缩短纯化时间和降低成本。 利用蛋白质结晶技术，提高重组蛋白的结晶效率和纯度。 开发新型的蛋白去垢剂和清洗剂，减少对重组蛋白的损害和污染。
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常用方法：离心、过滤、沉淀、亲 和层析等
注意事项：避免蛋白降解和活性丧 失
重组蛋白用于蛋白质晶体学研究，解析蛋白质结构 重组蛋白表达系统能够高效表达和纯化蛋白质，提高晶体学研究效率 通过重组蛋白表达系统，可以生产具有生物活性的蛋白质，用于药物筛选和开发 重组蛋白表达系统在蛋白质晶体学研究中具有广泛的应用前景，为生命科学研究提供有力支持
载体构建：选择合适的载体分子，将重组DNA分子插入到载体分子中，形成重组载体。
转化：将重组载体导入受体细胞中，使目的基因在受体细胞中复制和表达。
克隆筛选：通过筛选和鉴定，从众多的转化子中选育出含有目的基因的阳性克隆。
宿主细胞类型：原核细胞、真核细胞、昆虫细胞等 选择依据：表达产物的纯度、表达量、安全性等 转化方法：电击法、化学法、显微注射法等 转化后筛选：抗性筛选、互补筛选等
重组蛋白表达系统用于生产抗 体药物
高效、可重复的抗体药物研发 过程
重组蛋白表达系统在抗体药物 研发中的优势
抗体药物的种类和应用领域
用于研究病毒结构、功能和 传播机制
重组蛋白表达系统在疫苗生 产中的应用
用于开发新型疫苗和治疗策 略
提高疫苗产量和纯度，降低 生产成本
用于研究蛋白质 之间的相互作用， 帮助科学家更好 地理解生命活动 的本质和疾病的
发生机制。
重组蛋白的表达系统
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昆虫细胞表达系统：以Sf9和Bm5细胞为代表优点是 能够进行真核翻译后修饰表达的蛋白具有生物活性； 缺点是操作较为复杂且表达量有限。
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哺乳动物细胞表达系统：以CHO和HEK293为代表 优点是能够高度模拟真核生物的翻译后修饰表达的蛋 白具有高度生物学活性；缺点是操作复杂成本高且表 达量有限。
宿主细胞的选择与培养
宿主细胞的选择：根据重组蛋白的特性选择适合的宿主细胞如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺 乳动物细胞等。
宿主细胞的培育：通过培养基和生长条件的优化提高宿主细胞的生长速率和蛋白表达水平。
宿主细胞的遗传改造：通过基因敲除、基因沉默等技术手段对宿主细胞进行遗传改造以实现重 组蛋白的高效表达。
重组蛋白表达系统的分类
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原核表达系统：以大肠杆菌为代表优点是操作简便、 成本低适用于大规模生产；缺点是表达的蛋白缺乏真 核生物特有的翻译后修饰且表达量不稳定。
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酵母表达系统：以酿酒酵母和毕赤酵母为代表优点是 能够进行真核翻译后修饰表达的蛋白具有生物活性； 缺点是表达量相对较低且产物大多为包涵体。
宿主细胞的反应条件：通过调节温度、pH、营养物质等反应条件实现对重组蛋白表达过程的精 细控制。
重组蛋白的表达诱导与检测
诱导方法：使用诱导剂诱导目的基因的表达 检测方法：通过免疫印迹法、荧光检测等技术检测目的蛋白的表达情况 目的：验证重组蛋白表达系统的可行性 意义：为进一步研究重组蛋白的结构和功能奠定基础
重组蛋白表达系统的改进方向
优化宿主细胞：选择更合适的宿主细胞以提高重组蛋白的表达水平和产量。 基因工程改造：通过基因工程手段对重组蛋白进行改造以提高其表达效率和稳定性。 添加分子伴侣：利用分子伴侣的作用提高重组蛋白的折叠效率和分泌能力。 开发新型表达系统：不断探索和开发新型的表达系统以克服现有表达系统的限制和不足。
重组蛋白质表达、复性与纯化54页PPT
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
重组蛋白质表达、复性与纯化
51、山气日夕佳，飞鸟相与还。 52、木欣欣以向荣，泉涓涓而始流。
53、富贵非吾愿，帝乡不可期。 54、雄发指危冠，猛气冲长缨。 55、土地平旷，屋舍俨然，有良田美 池桑竹 之属， 阡陌交 通，鸡 犬相闻 。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招Байду номын сангаас人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈