T-RFLP精讲

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免疫2015课件T细胞-PPT文档

ü CD40L (CD154)
主要存在于活化的CD4+T细胞，起信号转导作用。
ü LFA-1; ICAM-1
15
✓CD2（LFA-2, SRBC受体）
存在所有成熟T细胞表面的分子，可以结合绵羊红细胞，形成玫瑰花环.
T cell
16
17
18
u 丝裂原受体
T细胞表面有多种与丝裂原结合的膜分子
– ConA: T细胞 – PHA：T细胞 – PWM：T和B细胞
• CD8
存在于Tc细胞表面，主要与MHC I 类分子结合，起信号转导作用
CD4和CD8分子又称为T细胞的共受体。
11
12
u 共刺激分子
ü CD28
存在于大部分成熟T细胞，是协同刺激分子B7 的受体，提供细胞协同刺激信号。
ü CTLA-4(CD152)
表达于活化的T细胞，是协同刺激分子B7的受体，亲和力高于CD28，提供细胞抑制信号。
38
T细胞的检测
免疫荧光（Immunofluorescence）
39
荧光标记流式细胞仪检测(Flow Cytometry,FCM)
40
E-玫瑰花环实验
T cell
41
淋巴细胞转化实验
（Lymphocyte transformation reaction）淋巴细胞培养加入T细胞丝裂原观察转化为T淋巴母细胞的数量 T细胞丝裂原主要包括PHA和ConA
42
CD8+ 具有特异性杀伤靶细胞作用的T细胞
杀伤机制：
• 分泌穿孔素、颗粒酶、淋巴毒素 • Fas /FasL途径诱导细胞凋亡
34
CTL杀伤病毒感染的靶细胞
35
• 调节性T细胞（Treg, T regulatory cell）

RFLP分子标记及其在牧草研究中的应用

RFLP分子标记及其在牧草研究中的应用史威威,董宽虎山西农业大学动物科技学院,山西太谷 (030801)E-mail:shiweiwei45@摘要：RFLP分子标记是用限制性酶(RE)消化不同个体的同源DNA分子,经电泳表现的限制性片段长度的差异。

它反映了DNA 分子水平上的变异,可能是限制性内切酶识别位点的改变,也可能是部分片段的缺失、插入、易位、倒位等, 显示出丰富的多态性。

本文综述了RFLP分子标记技术在牧草个体识别、绘制遗传图谱、目的基因定位、检测群体内或群体间序列差异程度以及辅助育种研究中的应用等，并对该技术在牧草研究中的应用作了展望。

关键词：RFLP分子标记;牧草研究;应用;展望引言：分子标记技术从20世纪80年代初期发明以来在人类、动物、植物以及微生物的研究中得到了广泛的应用。

广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA 序列或蛋白质。

狭义的分子标记只是指DNA标记，而这个概念现在被广泛采纳[1]。

DNA 分子标记技术（DNA molecular markers）的本质是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA 片段。

由于DNA分子中碱基的缺失、插入、易位、倒位、重排或由于长短与排列不一的重复序列等而产生多态性，DNA分子标记便是检测这种多态性的技术，故DNA 分子标记技术又称作分子诊断技术[2]。

DNA分子标记主要指RFLP(restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性)、RAPD (random amplified polymorphic DNA 随机扩增多态性DNA)、SSR(simple sequence repeats 简单重复序列)和AFLP(amplified fragment random polymorphism 扩增片段长度多态性)。

本文主要介绍RFLP分子标记。

末端限制性片段长度多态性技术_T_省略_微生物群体分析上的应用与技术优化_李献梅

中国农业大学学报 2009,14(4):1-9Journal o f China A g ricultur al U niv ersity末端限制性片段长度多态性技术(T -RFLP)在微生物群体分析上的应用与技术优化李献梅王小芬崔宗均*(中国农业大学农学与生物技术学院/中国农业大学生物质工程中心,北京100193)摘要末端限制性片段长度多态性技术(T-RFL P)是以荧光标记引物P CR 为基础,根据末端限制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物群体图谱法。

本文综述了该方法在群体微生物分析上的应用及DN A 提取、PCR 扩增、酶切和数据分析等步骤的技巧与优化,总结了科学应用该技术的要求以及和多重PCR 、gy r B 基因等相结合的观点。

关键词 T -RF LP ;微生物群体;图谱分析;PCR;克隆中图分类号 Q 936 文章编号 1007-4333(2009)04-0001-09 文献标志码 A收稿日期:2008-10-27基金项目:国家/十一五0科技支撑计划(2006BAD07A 01;2006BA D25B04)第一作者:李献梅,博士研究生,E -mail:staro fchina@g 通讯作者:崔宗均,教授,主要从事生物质资源利用与微生物生态研究,E -mail:acuizj@Applications and optimizations of T -RFLP in fingerprintingenvironm ental microbial populationsLI Xian -mei,WANG Xiao -fen ,CUI Zong -jun *(College of Agronomy and Biotechnology/Center of Biomas s Engineeri ng,Chi na Agricul tural U nivers i ty,Bei jing,100193,China)Abstract Terminal re stric tio n fra gment leng th polymorphis m (T -RFLP)is one o f micro bia l popula tio n fing erprinting me tho ds tha t is ba sed o n labele d primers -PCR to ide ntify microbial co mposition a ccording to diffe re nt terminal re stric tio n frag me nt leng ths.The applic ations and te chnica l o ptimizations we re o ve rv iew ed o f T -RFLP thro ugh the pro cedures of DNA preparation,PCR,enzyme dig estion and da ta analysis.The sc ientific applic ation re quire me nts and new view s of combination with multiple -PCR o r g yr B g e ne we re dra wn.Key words T -RFLP;microbial po pulation;fing erprinting ana lysis;PCR;clone libra ry当前环境微生物组成及生态研究已经成为微生物领域的一大热点[1]。

酶联荧光RFLP技术标准

酶联荧光RFLP技术标准1 全血或冻溶血抽提DNA1.1 全血溶解注：1）细胞溶解液（cell Lysis Buffer）和蛋白酶K（pro-k）在使用时，置放在冰盆内。

2）蛋白溶解液（Protein Lysis Buffer）应放在室温。

3）操作中全部试剂的用量是依据0.5ml血液样本而设定的，应精确保用各试剂用量。

①移取0.5ml全血，加入标记5ml管。

②加1.8ml细胞溶解液到各试验管，加盖，倒转数次使其混匀，置于冰盆内待到全部试验样本操作完备后，准备离心。

③在水平台式离心机上离心，1250rpm，离心时间5min，注意在离心前一定要配平。

④从离心机取出样本，仔细地倒去上清液，用新华滤纸吸取残剩上清液。

注意，不要将离心沉淀物（pellet）丢掉。

假若沉淀物被悬浮，就将样本管垂直放置，小心吸弃上清液。

⑤在旋涡混合器上，用残存上清液悬浮沉淀团。

⑥每样本管加2ml细胞溶解液，加盖，在旋涡混合器上，混匀沉淀团，重复第3-4步骤。

⑦再在旋涡混合器上，混匀样本。

⑧在第6步骤离心时，按下列配方准备蛋白酶混合液。

每个样本×10 ×20 ×30 ×40 ×50 ×60 Protein233.8μl 2.338ml 4.676ml 7.014ml 9.352ml 11.69ml 14.028ml lysisBufferPro-k 3.7μl 37μl 74μl 11μl 140μl 185μl 222μl SDS 12.5μl 125μl 250μl 375μl 500μl 625μl 750μl Total 250μl 2500ml 5ml 7.5ml 10ml 12.5ml 15ml⑨每样本管加蛋白酶混合液250μl，加盖，轻轻地倒转数次，禁止剧烈振荡。

⑩将全部样本管放入恒温水浴摇床内，37±1℃培养2hrs，中速摇动。

⑾每管加50μl高氯酸钠（Sodium Porchlorate）加盖，轻轻地倒转数次，进入抽取步骤。

PCR—RFLP

三、实验目的
通过此实验操作，通过此实验操作，掌握琼脂糖凝胶电泳技术、泳技术、DNA的分离鉴定及基因型判的分离鉴定及基因型判定方法。定方法。
实验材料、四、实验材料、仪器和试剂
材料：材料：DNA样品样品仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、紫外透射仪、头紫外透射仪、Tip头试剂
PCR反应体系反应体系
DNA模板模板 dNTP Taq DNA聚合酶聚合酶引物 Mg2+ 缓冲液
PCR反应程序反应程序
预变性 94℃ 3~5min ℃ 35循环：循环：循环 30s~1min 变性 94 ℃ 退火 50~65 ℃ 30~60s 1~2min 延伸 72 ℃ 5~10min 后延伸 72 ℃
动物遗传学实验
鸡基因组的PCR-RFLP分析实验七鸡基因组的分析
一、实验方法
1、鸡基因组DNA的提取、鸡基因组的提取 2、目的基因的PCR扩增、目的基因的扩增 3、内切酶消化PCR产物、内切酶消化产物 4、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型）、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型）
鸡DNA的获取的获取
PCR产物电泳检测结果产物电泳检测结果
内切酶消化PCR产物产物内切酶消化
PCR产物缓冲液内切酶产物+缓冲液产物缓冲液+内切酶
5‘-TCATGA-3’ 3’-AGTACT-5’
电泳检测基因（）电泳检测基因（1）
A B
电泳图谱
AA BB AB
电泳检测基因（）电泳检测基因（2）
六、结果分析
1. 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平脑中观察图像；开通紫外光 3.关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像；关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像；关上紫外光电源 4.根据图像结果判定不同个体基因型。根据图像结果判定不同个体基因型。根据图像结果判定不同个体基因型

RFLP限制性内切酶片段长度多态性

一、基本原理限制性核酸内切酶（restriction end nuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能将之切断。

不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。

在同源染色体相应的DNA区段，用一种限制性核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段，然后用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异。

这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的异同，因而称为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，缩写为RFLP）技术。

它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、还是由缺失、插入造成的。

二、RFLP技术的基本步骤这一技术主要包括三大步骤：1、靶DNA的准备先将基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA，将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将D NA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，称印迹（Southernb1ot）转移，并在80℃烘烤或用长波紫外线照射，将DNA固定在膜上。

2、核酸探针的标记将准备作为探针的DNA片段纯化（这些DNA片段可以是基因组DNA的一个片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射性元素（如Dig－dUTP等）标记，经纯化后再用。

探针的获得最先用内切酶处理植物的 DNA获得DNA片段，再将其重组到质粒上，使它能插人细菌寄主细胞并在里面进行复制，通过稀释繁殖，每个菌落一般由携带某一段 DNA的细菌繁殖而来，这种在细菌细胞中扩增、纯化DNA 片段的过程称做DNA克隆,这—系列的克隆经放射性同位素标记就成了一系列的探针。

3、杂交显示将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链核酸杂交，洗膜去除未杂交的标记探针后，进行放射自显影或加入酶的底物进行显色反应，再对显示出来的谱带进行分析。

RFLP-ppt精讲

01 2)变异更稳定。其表现不受环境条件的影响, 其他变异均是从表型或基因作用产物来研究遗传和变异的 , 而 RFLP 则是直接研究基因的构成
02
03
比生化标记更丰富,区分能力更强。
其标记为共显性 , 能区分纯合显性和杂合显性,而且非等位基因间无互作。
04
2 基本实验程序和主要影响因素
01
DNA的提取
14cm左右停止。
基本实验程序
04
转移
DNA支持膜现在均采用带正电荷的尼龙膜。将经酸碱
处理的琼脂糖凝胶放在玻璃板上 , 上面铺上尼龙膜,
其上压约10cm 的吸水纸,用磷酸转移液, 转移24h后, 取出尼龙膜,在94℃烘烤2h以固定DNA。
放射自显影标记探针,每泳道探针DNA用量为5ng。分子杂交,探针与尼龙膜保温在65℃ ,缓慢转动16～18h。洗膜压片,取出杂交膜,用SSC、SDS洗去末杂交上的探针, 直到杂交膜上的放射性到100～200counts /min为止。用保鲜膜将尼龙膜包好, 压上X光片, 在- 70℃下放射自显影5～ 15d 。洗片、显影结束后取出,定影、凉干保存。
2 RFLP用于作物育种研究

一副高度饱和的 RFLP 连锁图 , 为基因选择、回交育种、预测杂种优势以及基因克隆等方面提供了诸多方便。利用与目标基因连锁的 RFLP 标记进行间接选择 , 就能克服传统育种方法进行基因选择和回交育种中所遇到的种种困难和麻烦。因为知道目的基因与 RFLP 标记连锁 , 这使我们相信在选择 RFLP 的同时 , 也选择了目的基因 , 因为使二者分开的重组机率太小。另一方面 , 连锁的 RFLP 标记能在植株苗期进行测定记录 , 因为只需提取少量 DNA, 故不必毁坏整个植株。不带目的基因的植株能在早期被剔除 , 节省了空间和费用。

RFLP,SNP标记

SNP的应用
1、人类基因单体型图的绘制 2、SNP与疾病易感基因的相关性分析 3、指导与药物设计通过研究SNP与个体对药物敏感或耐受的相关性研究，可能阐明遗传因素对药效的影响，另外，随着SNP的研究与药物基因组学的结合，根据特定的基因型来设计药物将成为可能。

SNP优缺点：
RFLP， SNP标标记原理及应用
——分子标记法主讲人：石波
四、 RFLP标记
定义：RFLP即DNA限制性片段长度多态性，它是指应用特定的核酸限制内切酶切割有关的 DNA分子所产生出来的DNA片段在长度上的变化。对于每一个DNA/限制性内切酶组合来说，所产生的片段是特异性的，它能作为某一DNA （或含这种DNA的产物）所特有的“指纹” （即片段差异的多态性）。基本原理：RFLP标记是由于不同基因型之中内切酶位点的碱基插入、缺失、重组或突变 ,利用限制内切酶消化基因组DNA 时 , 会产生大小
1.遗传学图的构建结合RFLP连锁图，任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地进行转移。 2.基因定位利用RFLP技术能够准确地标记定位种质中的目标基因，结合杂交，回交及组织培养等技术就可以快速有效的将所需目标基因的DNA片段引入栽培品种中，实现品种改良。

Байду номын сангаас
RFLP的应用
3.遗传多态性分析运用RFLP技术可以尽可能多地保存那些在已知位点上有异态的品系，以求最大程度地保持品种的多样性。 4.细胞质遗传研究 RFLP技术是对DNA 序列自然变异的直接检测，只需选择适当的限制性内切酶或DNA探针作分子标记，因而对植物不同种属或杂种后的的细胞质遗传变异及基因型的鉴定具有较高的灵活性和灵敏性。因而能较好地应用于细胞质遗传的研究。 ←

几种分子遗传标记技术详解演示文稿

第二十四页，共25页。
动物遗传标记课程作业
微卫星DNA的应用
➢个体及亲缘关系鉴定
➢种群(品种、品系)内遗传纯度和彼此之间遗传距离
➢构建遗传连锁图谱
➢定位功能基因及QTL ➢杂交优势预测 ➢群体遗传结构分析及遗传关系的分析
➢在标记辅助选择和标记辅助导入等方面的研究 ➢监测育种和遗传操作效应 ➢亲子鉴定、胚胎移植、混合受精、亲缘关系分析
映。
第三页，共25页。
动物遗传标记课程作业
分子遗传标记的优越性
➢ 多为共显性
➢ 在生物发育的不同阶段，不同组织的 DNA 都可用
于标记分析
➢ 表现为中性，不影响目标性状的表达 ➢ 基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限
的
➢ 检测手段简单快捷，易于实现自动化
第四页，共25页。
动物遗传标记课程作业
第二十一页，共25页。
动物遗传标记课程作业
原理：每个微卫星两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计专一引物，通过PCR技术扩增微卫星片段，扩增产物经凝胶电泳分离后，不同个体间因核心序列的重复次数不同而产生DNA多态性。单拷贝序列在单倍体基因组中只出现一次，但储存了巨大的遗传信息，可以编码各种不同功能的蛋白质，因此对这些序列的研究有特别重要的意义。
原理：以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列（通常为10 个碱基对）为引物，在 Taq 酶作用下，进行PCR 扩增。扩增产物经凝胶电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。
第十八页，共25页。
动物遗传标记课程作业
第十九页，共25页。
态性。
第十页，共25页。
动物遗传标记课程作业

T-RFLP技术在土壤微生物群落结构研究中的应用

T-RFLP技术在土壤微生物群落结构研究中的应用
目
1
录
RFLP简介
2
RFLP研究的发展
3
T-RFLP技术在土壤微生物群落结构中的应用
RFLP（限制性片段长度多态性标记）
• Restriction Fragment Length Polymorphism
• 原理：
RFLP是由于染色体上单核苷酸突变或插入及缺失突变导致限制性酶切位点的增加或减少，从而导致 DNA酶切片段长度的变化，这种变化的检测通常是应用同位素或酶联免疫标记探针进行检测。
T-RFLP在土壤微生物群落结构研究中的重要性
传统调查一直是建立在分离和培养的基础上。这种方法不但
费时费力，而且不够准确。这反映在如下几个方而:
1) 微生物群落组成极度复杂，采用传统方法工作量巨大。 2) 反应结果的阳性阴性有时不好判断，容易产生偏差，导致鉴定错误。 3) 培养的方法对菌有选择性。 4) 环境中的绝大多数微生物是不可培养的。
标记没有发育阶段或器官的特异性，不受环境条件及基因互作的影响。
RFLP研究的发展
基因组DNA 酶切对象 RFLP
PCR产物
PCR-RFLP
末端荧光标记的PCR产物
T-RFLP
PCR-RFLP
聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析
• 是在 PCR 和 DNA 序列分析基础上产生的 RFLP 技术。当的限制性内切酶，消化 PCR 产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。
这在实际工作中，单一酶切产生的多态性极其有限，主要ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ决
于亲本材料的来源。正常情况下用6到8种酶来筛选多态性。不同的酶产生的多态性大不相同。

seqRFLP 使用说明

100 bp
图 2 用“EcoRI”, “Acc65I”, “HinfI”进行模拟酶切的结果
4.主要函数及用法
SeqRFLP 使用指南
当前版本(1.0.0)的 seqRFLP 共有 22 个函数，用户可以通过查询其 R 帮助文档，这里介绍的是数据导入导出与分析的主要函数。
file.cat()
描述: 将一个目录下任何纯文本格式的文件拷贝到新生成的目标文件中。
3 如有问题，请发邮件至 dingqiong1@ 或 jinlongzhang01@ 我们将尽量解答遇到的各种问题，但并不保证每封邮件都能及时回复。
4 由于使用本软件造成的法律问题，软件作者不承担任何责任。丁琼张金龙
2010 年 7 月 3 日于北京香山
seqRFLP 是用来对 DNA 序列进行模拟酶切、模拟 PCR 引物筛选的软件包，目前版本是 1.0.0。用开源的 R 语言 (/ )写成，可以在 Linux, Windows， MacOS 等多种计算机平台上运行。seqRFLP 已经被 RCRAN 接收，用户可以在 R 的任何一个镜像下载。本说明假设用户使用 Windows，其他平台用户的使用方法与之类似，均需先安装 R 软件。
-3-
SeqRFLP 使用指南
从 DNA 序列预测 RFLP 和 TRFLP
seqRFLP 使用说明
Version 1.0.0
版权所有© 丁琼张金龙 2010
丁琼张金龙
中国科学院植物研究所生态中心生物多样性与生物安全研究组 /
声明
在使用本软件前，请认真阅读以下协议。 1 使用 seqRFLP 软件意味着用户认同该协议。 2 本软件符合 GPL-2 协议，用户可以免费下载和使用该软件，可以对源代码进行修改。

TRFLPPPT学习教案

第8页/共17页
下面是一张酶切不完全的电泳图
第9页/共17页
四、送去做T-RFLP的测序
这个实验测序是送去生工做的测序，用的是DNA测序仪ABI3730，大约3~4天能拿到，因此我的实验部分大约两周能做一次。
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五、图谱分析和数据分析
这是两个同组样本的图谱，波峰大致上是相同的，这样表明这两个样本数据是比较可靠的。
第4页/共17页
具体的实验步骤
一、提取样本的基因组我提取的是小鼠粪便的基因组，用自己实验室配制
的粪便基因组提取试剂盒来抽提，基因组提取的结果良好。
第5页/共17页
二、PCR
PCR条件： 95℃，5 min 变性95℃，30 S 退火55℃，30 S 37个循环延伸72℃，2min 72℃，10 min，4℃保存。然后用DNA凝胶回收试剂盒（上海中亚）对PCR 产物做一个回收，以去掉PCR反应中的杂带，保证只有800bp大小的DNA片段，去掉杂带。
TRFLPPPT课件
会计学
1
T-RFLP简介
T-RFLP中文全称是末端限制性片段长度多态性
（Terminal restriction fragment length polymorphism ）,又可以称为16sRNA基因的末端限制
性片段分析技术。它是将目标DNA片段的一个末端(通常是5′端)用荧光标记，这样在酶切后，分析的目标只限于有荧光标记的末端限制性片段上。酶切后产生长度不等的末端限制性长度片段经过毛细管电泳分离，并经ABI 自动测序仪上检测和计算后，输出末端限制性片段长度的大小和荧光强度图。测序仪上输出的图谱含有的不同波峰越多，则表明微生物种类越丰富。通过比较不同样品图谱间波峰的异同，就可以得到不同样品中菌群的差异。

肠道微生物研究中T-RFLP分析技术的运用论文

肠道微生物研究中T-RFLP分析技术的运用论文肠道微生物研究中T-RFLP分析技术的运用论文摘要：限制性末端片段长度多态性分析技术（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP）具有高通量，低成本，低劳动力等特点，是微生物生态学家在探索群落结构，功能及其动态变化中的一项实用方便的工具。

自2012年至今，T-RFLP在肠道微生物领域研究方向不断拓宽，随后T-RFLP技术被更多的应用于人体相关疾病与肠道微生物关系的研究中。

尽管T-RFLP技术仍存在不足，但随着16Sr RNA基因序列数据库和引物的改进，数据生成和分析统计工具的运用，T-RFLP最终将能在各个领域体现其价值，为人类疾病研究事业带来贡献。

关键词：限制性末端片段长度多态性分析；肠道菌群；动态变化；多样性1 T-RFLP 技术简介1.1 T-RFLP 技术原理T-RFLP分析技术是一种利用对细菌基因组中的保守序列（如16Sr DNA）的T-RFs长度的多态性分析进而实现对细菌分型的群落研究技术。

该技术的基本原理是根据靶序列的保守区设计通用引物，以荧光标记引物的5‘末端，并用限制性内切酶对目标片段进行酶切，随后以待分析样的总DNA为模板进行PCR扩增，再选用合适的限制性内切酶消化扩增产物。

由于核苷酸序列在不同菌的扩增片段中存在差异，酶切位点也不尽相同，据此得到不同长度的限制性片段。

最后对消化后的产物进行自动测序仪测定，只有末端带有荧光性标记的片段能被检测并可用T-RFs反映了微生物群落的组成情况。

因此可用全部带有荧光的T-RFs的长度和丰度代表群落结构的多样性。

1.2 T-RFLP 分析肠道微生物的主要步骤T-RFLP分析肠道微生物的'主要步骤包括：（1）DNA的提取；（2）标记引物分子PCR扩增；（3）扩增产物的纯化、酶切；（4）结果测定及分析。

1.3 T-RFLP 技术评价随着T-RFLP的广泛运用，T-RFLP技术在关键环节上的不足也被暴露出来，本部分主要将T-RFLP技术与另一指纹图谱技术DGGE的优缺点进行比较（表1）。

T.P.S(一章)培训讲义1

自控化
JUST IN TIME
（无积压无库存）压缩生产周期时间 1.异常时停止 2.及时分析判断异常 3.人的工作与机器设备的工作完全分离生产中提高品质省人化
前提条件：均衡化前提条件：
降低成本
（二）奠定管理的基石（使浪费表面化）奠定管理的基石（使浪费表面化）
T.P.S要求推广「看得见的管理」 T.P.S要求推广「看得见的管理」要求推广
A
接受订单
生产陑
仓库 C
出货
B
基本原则1 基本原则1：工程流畅化
为达到【三个必要】的目的，其中的一个必要条件是需要实现流水性生产。为达到【三个必要】的目的，其中的一个必要条件是需要实现流水性生产。流水性生产就是指在生产线上，把产品一个一个地往下传进行作业组装，单个流动】流水性生产就是指在生产线上，把产品一个一个地往下传进行作业组装，即【单个流动】。或从设备配置上来说，可称为【生产线化】或从设备配置上来说，可称为【生产线化】。而从工场整体的物流考虑，又可称为【整流化】而从工场整体的物流考虑，又可称为【整流化】。 Ⅰ.物料方面 Ⅰ.物料方面（Ⅰ）（Ⅱ）（Ⅲ） Ⅱ.人员方面 Ⅱ.人员方面 Ⅲ.设备方面 Ⅲ.设备方面（Ⅰ）（Ⅱ）（Ⅰ）（Ⅱ）（Ⅰ）单个流动同期化消除停滞一人多工位多能工化按工程顺序配置设备可使物流整流的设备缩短安排准备时间
目的：目的：缩短生产周期
『生产周期』的概念生产周期』是指生产工场接受订单开始到该批量成品出货为止的整个时间。是指生产工场接受订单开始到该批量成品出货为止的整个时间。生产周期＝生产周期＝A+B+C A:该批量成品的生产情报指示所造成的停滞时间。 A:该批量成品的生产情报指示所造成的停滞时间。该批量成品的生产情报指示所造成的停滞时间 B:该批量材料投入到完成为止所用的时间 B:该批量材料投入到完成为止所用的时间 C:该批量最初的第一台完成品产生后，到批量入库为止的时间。 C:该批量最初的第一台完成品产生后，到批量入库为止的时间。该批量最初的第一台完成品产生后

RFLP和RAPD技术

RFLP和RAPD技術一、RFLP技術DNA的多態性檢測技術是進行基因組研究的基礎。

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態性)已被廣泛用於基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。

RFLP是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位元點堿基發生突變，或酶切位元點之間發生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關係。

所用的探針爲來源於同種或不同種基因組DNA的選殖，位於染色體的不同位點，從而可以作爲一種分子標記(Mark)，構建分子圖譜。

當某個性狀（基因）與某個（些）分子標記協同分離時，表明這個性狀（基因）與分子標記連鎖。

分子標記與性狀之間交換值的大小，即表示目標基因與分子標記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。

分子標記選殖在質粒上，可以繁殖及保存。

不同限制性內切酶切割基因組DNA後，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內切酶與分子標記組成不同組合進行研究。

常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標記則有幾個甚至上千個。

分子標記越多，則所構建的圖譜就越飽和。

構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。

運用隨機引子對擴增尋找多態性DNA片段可作爲分子標記。

這種方法即爲RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，隨機擴增的多態性DNA)。

儘管RAPD技術誕生的時間很短, 但由於其獨特的檢測DNA多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透于基因組研究的各個方面。

該RAPD技術建立於PCR技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常爲10聚體)爲引子,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增産物DNA片段的多態性,這些擴增産物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。