水体总细菌计数
细菌总数的测定
细菌总数的测定
水与人类的生产活动和日常生活息息相关。经济建设的高速发展，往往会使生活用水的水源水受到水中有害有毒物质的污染；而生活污水、人、畜粪便会使甚或用水的水源水受到腐生性微生物的污染。被污染的水都不宜饮用。当水体中含大量的病原问生物是往往会引起传染病的发生，人体和动物体的肠道中大约有400多种细菌，虽然，其中的腐生菌进入水体不会引发人类的疾病，但随着粪便一起排除的致病菌，如霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、阿米巴虫、脊髓灰质炎病毒和传染性感染病毒等致病性微生物，则会引发人体的肠道传染病。为保护人体健康，防止因水源水污染而造成的疾病发生和流行，必须对生活用水及其水源水进行严格的水中细菌学检查。
测定水样是否合乎引用标准，一般包括：水中细菌总数测定和大肠菌群测定。本实验以自来水和天然水为水样进行细菌总数的测定
一、实验目的
（1）学习水样的采取和水样中细菌总数测定的方法
（2）了解和掌握平板菌落计数的原则
二、试验原理
水中的细菌数可反映出水体被有机物污染的程度。细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，本试验应用平板菌落计数来测定水样中的细菌总数。由于水中细菌的种属不一，它们对营养成分和生长条件的要求差别很大，不可能设计出一种培养基在同一固定的条件下，能满足水中所有细菌的营养要求使其都能生长繁殖，形成菌落。然而，肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长，出现肉眼可见的菌落，虽然这样设计出来的水中细菌的总数实际上是一种近似值，但它基本上能代表水样中细菌的数量。故而水中的细菌总数的测定和计算是指：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，1ml水样，经37℃，24h培养后所生出来的总菌数（包括腐生和致病细菌），我国饮用水的
平板菌落计数法水中微生物的检测
4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30， 则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之
5）若所有稀释度的平均菌落数均不在 30~300之间，则应以最接近30或300的平 均菌落数乘以稀释倍数报告之
6）平板出现大片菌苔不采用，菌苔小于平 板的一半，若另一半菌落分布均匀，则菌落 数× 2.
注意事项:
注意:作空白及取平行样(2-3组)
通常细菌、放线菌选择平均菌落数在30~300之 间者进行计算 ，霉菌选平均菌落数在10~100之 间。
3 菌落计数及报告方法 (实例)
不同稀释度的平均菌落数
10-1
10-2 10-3
两稀释度菌 菌落总数 报告方式 落数 之比
1 1365
164
20
---
2 2760
含细菌100-1000个/ml的水体为清洁 含细菌1000-10000个/ml的水体为不太清洁 含细菌多于10万个/ml的水体为极不清洁
含细菌1万-10万个/ml的水体为不清洁
二、基本原理
1、本试验采用平板菌落计数法对水样中的细菌计数， 这是一种测定水中好氧和兼性厌氧细菌密度的方法， 由于细菌在水体中，能以单个、成对、链状、成簇 或成团的方式存在，另外，没有单独的一种培养基 或某一环境条件能满足一个水样中所有细菌的生理 要求，所以由此法得到的菌落数，实际上要低于被 测水样中真正存在的活菌数。
细菌总数名词解释
细菌总数名词解释
细菌总数是指在特定环境下，全部细菌的数量总和。细菌是一类微生物，其大小较小，通常只有几微米到几十微米，有些甚至更小。它们存在于自然界的各个角落，包括土壤、水体、空气、植物、动物以及人体内等。
细菌总数的测量通常通过两种方法来进行，一种是直接计数法，另一种是间接计数法。
直接计数法是指将样品中的细菌使用显微镜进行观察和计数。这种方法能够提供准确的细菌总数，但需要消耗大量的时间和劳动力，因此一般用于研究实验室中的小样本。
间接计数法则是通过测量细菌在培养基上形成的可见生长区域或者培养液中的细菌生长所产生的代表性产物来估算细菌总数。常用的方法有营养琼脂培养法、白卡氏计数法等。这种方法的优点是快速、便捷，但精度相对较低。
细菌总数是影响生物环境和人类健康的一个重要指标。在生物环境中，细菌对循环物质、生态平衡等都起着重要作用，因此了解细菌总数对于环境保护和生态恢复具有重要意义。在水体和土壤中，过高的细菌总数可能表明水质或土壤质量的恶化，例如可能存在污染物或者有害物质。因此，细菌总数的监测可以帮助评估环境的卫生状况，并及时采取相应的措施进行处理和治理。
在医学领域，细菌总数可以用于诊断和监测感染。不同的细菌
会引起不同的感染性疾病，因此对细菌总数的测定有助于确定感染的类型和程度，并指导治疗和预防措施的制定。细菌总数的监测也对于评估感染控制措施的效果以及防控策略的制定具有重要意义。
细菌总数的变化受到多种因素的影响，包括温度、湿度、氧气含量、营养物质等。不同的细菌对于生长条件有着不同的适应性，因此在不同的环境中，细菌总数可能会有很大的差异。
循环水菌落总数指标
循环水菌落总数指标
1. 概述
循环水菌落总数指标是衡量水质卫生状况的重要指标之一。它反映了水体中细菌的数量，可以用来评估水的卫生安全性。循环水是指在工业生产中用于循环利用的水，例如冷却循环水、锅炉循环水等。循环水菌落总数指标的测定方法是通过培养细菌并计算菌落数量来确定。
2. 测定方法
循环水菌落总数的测定方法主要有两种：膜滤法和涂布法。
2.1 膜滤法
膜滤法是通过将水样通过膜滤器来捕捉细菌，并将膜滤器放置在富含营养物质的培养基上进行培养。培养一定时间后，统计培养基上的菌落数量，即可得到循环水中的菌落总数。
膜滤法的优点是操作简单、结果可靠，并且可以同时测定不同菌群的数量。然而，该方法需要较长的培养时间，通常需要24-48小时才能得到结果。
2.2 涂布法
涂布法是将一定量的水样涂布在固体培养基上，通过细菌在培养基上生长形成的菌落来计数。
涂布法的优点是操作简单、结果快速，通常只需要24小时就可以得到结果。然而，该方法只能测定总菌落数，不能区分不同菌群的数量。
3. 影响因素
循环水菌落总数受到多种因素的影响，包括水源质量、水处理过程、水质管道、环境条件等。
3.1 水源质量
水源质量是影响循环水菌落总数的重要因素之一。如果水源受到污染，例如含有大量细菌的废水，那么循环水中的菌落总数就会较高。
3.2 水处理过程
水处理过程对循环水菌落总数也有一定的影响。如果水处理过程不完善，不能有效去除水中的细菌，那么循环水中的菌落总数就会较高。
3.3 水质管道
水质管道的卫生状况也会对循环水菌落总数产生影响。如果水质管道内存在细菌滋生的条件，例如管道内壁积存有有机物，那么循环水中的菌落总数就会较高。
饮用水中几种细菌计数方法的比较
ႂႨඣᇏࠫᇕ༥ऩ࠹ඔٚم֥бࢠ
鲁巍,王云,张晓健
(清华大学环境科学与工程系,北京 100084)
ᅋေ:比较采用不同培养基的平板计数(Plate Counts ,PC )方法,以及不同荧光染色剂的显微镜直接计数方法与常规计数方法的差别.研究认为,常规平板计数方法并不能准确反映饮用水中实际存活的细菌数量;吖啶橙直接计数(Acridine Orange Direct
Counts ,AODC )的结果最高,较常规平板计数方法高出3～4个量级;活细菌直接计数(Direct Viable Counts ,DVC )中,DVC 2N.A.、DVC 2CTC 和DVC 2BacLight 等计数方法的结果较常规平板计数结果高出2～3个量级.以地表水为水源的水厂出水中活
细菌数占总细菌数的比例在10%左右.
ܱՍ:饮用水;直接计数;平板计数;活细菌直接计数;细菌
ᇏٳোݼ:X832;TU991125 ໓ངѓ്:A ໓ᅣщݼ:025023301(2004)0420167203
൬۠ರ௹:2003208207;ྩרರ௹:2003209225
ࠎࣁཛଢ:国家自然科学基金资助项目(50238020);国家高技术研究
发展计划(863计划)资助项目(2002AA601140)
ቔᆀࡥࢺ:鲁巍(1978～),男,博士研究生,主要从事水污染防治技术
研究.
Methods of Enumeration of B acteria in Drinking W ater
L U Wei ,WAN G Yun ,ZHAN G Xiao 2jian
水中细菌总数的测定
一、目的要求 1．学习水样的采取方法和水样细菌总数测
定的方法。 2．了解水的平板菌落计数的原则。
第二页，共13页。
二、基本原理 生活用水的水源常被生活污水、工业废水以及
人畜粪便所污染。 腐生性微生物对人无害，而病源性微生物则能
引起传染病甚至流行病，如霍乱、伤寒、细菌 性痢疾和阿米巴性痢疾以及脊髓灰质炎和传染 性肝炎等病毒性疾病。
两个平板的平均菌落数即为1ml水样的细菌 总数。
第八页，共13页。
（2）池水、河水或湖水等 （a）取加入9ml水的灭菌试管。取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内，
摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀 释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数以培养后平板的菌落数在30—300个
第十页，共13页。
（2）首先选择平均菌落数在30—300之间的， 当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时， 则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的 细菌总数（见表ⅪⅤ-1，例1）。
第十一页，共13页。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平 均菌落数乘以稀释倍数（见表ⅪⅤ-1，例4）。
第七页，共13页。
2．细菌总数测定 （1）自来水（每个小组做两个平板） （a）用灭菌吸管吸取1ml水样，注入灭菌培养皿
中。共做两个平皿。 （b）分别倾注约15ml已溶化并冷却到45℃左右
平板菌落计数法水中微生物的检测
295
46
1.6
3 2890
271
60
2.2
4 无法计数 4650 513
___
5 27
11
5
___
6 无法计数 305
12
___
7 无法计数 无法计数 无法计数 ___
16400 37750 27100
1.6×104 3.8×104 2.7×104
513000 270 30500
5.1×105 2.7×102 3.1×104 10-3 无法计数
水中细菌总数的测定
——平板菌落计数法
一、细菌总数测定的意义
水中细菌总数往往同水中有机物污染的程度呈 正相关，它是评价水质污染程度重要指标之一
细菌总数：指水样在一定条件下培养后，1mL水样 所含菌落的总数。
我国生活饮用水标准（GB5749-85）规定，细 菌总数不得超过100个/ml
含细菌10-100个/ml的水体为极清洁
1、样品充分混匀，稀释时一个稀释度要换一支无 菌移液管（放菌液时 吸管尖不要碰到液面
2、由于细菌易吸附玻璃器皿表面，菌液加入后应 尽快倒培养基，立即摇匀；
3、倾注平板时的培养基温度冷却至45℃左右。 4、计数时，30―300个菌落的稀释度计算每毫升
的菌数最为合适 5、同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊
菌落计数方法及原则：
水中细菌总数的测定实验过程
• 3.水中检出的菌落总数是否代表该水中的所 有细菌数？为什么？ 人类至今没有办法培养出自然样品中的所 有微生物。非培养检测方法也没有达到 100%的效率。由于水中细菌种类繁多，他 们对营养和其他生长条件的要求差别很大， 不可能找到一种培养基在一种条件下，是 水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以 某种培养基平板上生长出来的菌落，计算 出来的细菌总数仅是近似值。
• 4.接种水样的培养皿，倒置于37℃培养箱中 培养48 h。 • 5．同时做一组空白实验，方法步骤同前5 步。
五、菌落记数
• （1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若 其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，Байду номын сангаас则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培 养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状 菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的 一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半 的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然 后再计算该稀释度的平均菌落数。
四、操作步骤
• 1．水样的采取 • （1）自来水先将自来水龙头用消毒处理，再开放 水龙头使水流一定量后，以灭菌三角烧瓶接取水 样，以待分析。 • （2）池水、河水或湖水应取距水面10-15cm的深 层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入 水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶 中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好 立即检查，否则需放入冰箱中保存。
• 在牛肉膏蛋白胨培养基上，1ml水样，经 37℃，48h 培养后所生长出来的总菌数。
水中细菌总数测定
灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物 体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢 子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照 射和化学药品法等。 常用加热灭菌法： 1、干热灭菌： 用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌 2、湿热灭菌 ⑴高压蒸汽灭菌法 ⑵间歇灭菌法 ⑶煮沸消毒法
（三）实验器材
1.药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10％ NaOH溶液、10％盐酸溶液。 2.器材：天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、 PH试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、 棉花、线绳、干燥箱、高压锅。
水中的细菌总数测定
1. 2. 3. 4.
培养基的配制 消毒与灭菌 水中细菌总数的测定 菌落计数法
培养基的制备与灭菌
（一）实验目的 （二）实验原理 （三）实验器材 （四）实验方法 （五）实验作业
（一）实验目的
1、明确培养基的配制原则；
2、掌握配制培养基的一般方法和步骤；
3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围； 4、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌 方法。
37℃
24h
ck 10-1 10-2 10-3
三、菌落计数
Ⅰ 细菌总数的测定
四、计算和报告计数结果
例 次 不同稀释度的平均菌落数
10-1 10-2 10-3
两个稀释 度 菌落数之 比
－
菌落总数 /CFU· -1 mL
自来水菌落总数操作方法
自来水菌落总数操作方法
自来水菌落总数是一种用来测量水质卫生的重要指标，其测试方法一般包括以下步骤：
1. 准备培养基：选择适合自来水中菌落总数测试的培养基，如营养琼脂（Nutrient Agar）或大肠杆菌培养基（Coliform Agar）等。
2. 取样：从自来水管道或水源中取样，确保取样容器和工具的清洁和消毒，以避免外部细菌的污染。
3. 酝酿：将取样置于培养基上，进行适当的酝酿和孵育，一般情况下为37孵育24小时。
4. 计数：观察培养基上的菌落形成情况，使用显微镜或计数器进行菌落数量的统计。
5. 计算：根据菌落数量计算出自来水样品的菌落总数，并与相关标准进行对比，从而评估水质卫生情况。
需要注意的是，在进行自来水菌落总数测试时，应严格按照实验方法操作，并保持实验环境的清洁和卫生，以确保测试结果的准确性和可靠性。
〖医学〗水的细菌学检查---细菌总数的测定
检查大肠菌群的方法: 多管发酵法、滤膜法。
我国规定每升自来水中大肠菌群 不超过3个。
• 独立设计试验放案
• 1 实验材料与用具－根据实验室现有条件选择 • 2 实验方法与步骤－自行拟定
弄不明白，治疗受到制约，在小小SARS、 禽流感 面前竟 束手无 策，在 糖尿病 、癌症 、心脑 血管疾 病、尿 毒症等 相当多 疾病面 前更是 不得不 求助或 借助中 医治疗 。一个 是疗效 不确实 ，一个 是有些 甚至相 当多疾 病无法 治疗， 这就是 中西医 学结合 的缘由 。然而 ，由于 二者是 两套理 论、两 股道上 跑的车 （肺血 液血小 板红血 球白血 球）， 风马牛 不相及 ，从理 论上讲 就没有 结合的 可能， 只是形 式上的 融合罢 了。（ 肺炎青 霉素肝 炎）
实验报告及思考题
• 一 . 实验报告以论文形式提交 • 二. 思考题
• 1、从自来水水样细菌总数检测的结果判断是否符合饮用 水的卫生标准?
• 2、你所测的池塘水、河水、湖水的污秽度如何?通过实 验你对保护水资源有何认识?
• 3、试与其他同学的实验结果进行比较,从中判断你的实验 结果误差如何?原因是什么?
如何测定水样是否合乎饮用标准?
〖医学〗细菌菌落总数(CFU)的测定
2）选取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度。稀释度 的选择是本试验精确度的关键，选择适宜者，平 皿上菌落总数介于30和300之间。
3）吸取由高倍至低倍的稀释液，每个稀释液分别 注入两个培养皿，每皿1mL。
4）注入彻底融化，然后冷却到45℃的营养琼脂培 养基（用于河水样）立即旋摇培养皿，充分混匀。 方法是握住平皿，先往一个方向画圆，再朝相反 方向回转；或一面画圆，一面适当倾斜。小心勿 使这个混合液体溅到培养皿的边缘。让平皿基于 水平位置放置至固化。
编辑本段现代中医史
上个世纪末,本世纪初，1996年,清华学界 对中医 气本质 ，经络 实质， 阴阳， 五行， 藏象， 中医哲 学观等 都有了 新的全 面整体 创造性 的认识 和解说 。如， 邓宇等 发现的 :气是 流动着 的‘信 息－能 量－物 质’的 混合统 一体； 分形分 维的经 络解剖 结构； 数理阴 阳；中 医分形 集：分 形阴阳 集－阴 阳集的 分形分 维数， 五行分 形集－ 五行集 的分维 数；分 形藏象 五系统 －暨心 系统、 肝系统 、脾系 统、肺 系统、 肾系统 ；中医 三个哲 学观－ 新提出 的第三 哲学观 ：相似 观－分 形论等 。
三、仪器和材料
无菌培养皿、无菌试管、无菌水，无菌吸管、 接种环、酒精灯、牛肉膏蛋白胨固体培养基、 水样、培养箱、微波炉。
水质检测常规六项
一、余氯
根据生活饮用水卫生标准限值要求，饮用水PH应该不小于6.5且不大于8.5，余氯指水经加氯消毒，接触一定时间后，余留在水中的氯量。余氯在水中具有持续的杀菌能力，可防止供水管道的自身污染，保证供水水质。标准检测方法为DPD广度法。
二、色度
饮用水的色度如大于15度时可被大多数人肉眼察觉，大于30度时能引起人生理不适，按规定饮用水色度不得大于15，标准检测方式为铂钴比色法。
三、浑浊度
浑浊度为水样光学性质的一种表达语，用以表示水的清澈和浑浊的程度，是衡量水质良好程度的重要指标之一，也是考核水外理设备净化效率和评价水外理技术状态的重要依据。浑浊度的降低就意味着水体中的有机物、细菌、病毒等微生物含量减少，这不仅可提高消毒杀菌效果，又利干隆低卤化有机物的生成量。按规定水质浑浊度最好为1NTU（水源与净水技术条件受限时为3NTU），标准检测方式为散射法。
四、耗氧量
耗氧量：是指化学氧化剂氧化水中有机污染物时所需氧量。化学耗氧量越高，表示水中有机污染物越多。水中有机污染物主要来源于生活污水或工业废水的排放、动植物腐烂分解后流入水体产生的。标准检测方式为酸性高锰酸钾滴定法或比色法。
五、嗅和味
水体有臭味主要是因为有机物的存在，也可能是生物活性增加的表现或工业污染所致。公共供水有臭味可能是原水水质改变或水处理不充分。正常水质要求无异嗅，异味，标准检测方式为嗅气和尝味法。
六、肉眼可见物
取透明玻璃杯加入待检水样，在强光下观察，如肉眼看不见即不属于此类。常见的肉眼可见物有：悬浮固体，水面漂浮物，沉积物，微生物和未成熟的幼体等。检测完毕记录时需说清楚数量、形态；例如：少量白色絮状沉淀；少量绿色细小悬浮物；大量白色漂浮物等。标准检测方法为肉眼观察法。
细菌计数最终版
细菌计数法及其运用
汪巍矿物加工01 0901030121
摘要
细菌总数是指1ml水（或1g样品），有氧条件下在普通琼脂培养基中经37℃、24h培养后所生长的细菌菌群总数，是评定水体或食品等被细菌污染程度指标之一，间接反映水体或食品的卫生质量。因此对细菌总数的计算是十分必要的。
关键字：细菌总数细菌计数法
正文
细菌对人类活动有很大的影响。一方面，细菌是许多疾病的病原体，包括肺结核、淋病、炭疽病、梅毒、鼠疫、砂眼等疾病都是由细菌所引发。然而，人类也时常利用细菌，例如奶酪及优格的制作、部分抗生素的制造、废水的处理等，都与细菌有关;因此对细菌总数的研究以及细菌计数法的运用
很有必要。目前，对于细菌总数计数的研究已有很多，主要分直接计数法和间接计数法。
1.细菌总数直接计数法及其运用；
直接计数法是指将菌液样品置于血球计数器内，在显微镜下直接观察计数，也可将待测样品与已知浓度的菌液或红细胞等量混合后，固定并染色，然后参照已知浓度的样品中的菌数，按比例计数出未知样品的菌数。目前这类方法主要有：
（1）血球计数板计数法：
即用血细胞计数板在显微镜下直接计数，是一种常规、直观而快速的细菌计数方法。主要是将经过一定比例稀释后的菌悬液（或孢子悬液）放在血细胞计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下即可进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1㎜3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。但此方法计算的总数是活菌体和死菌体的总和，与实际结果往往偏高。
此方法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。一般酵母菌用于发酵，了解生产过程样品中酵母菌的总数对于发酵质量的控制是十分有利的。
水质总大肠菌群检测标准
水质总大肠菌群检测标准：
1、细菌总数1ml水中不超过100个。
2、大肠杆菌数1L水中不超过3个。
3、若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水,大肠菌群数平均每升不得超过1000个;经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水,大肠菌群数平均每升不得超过10000个。
实验十一水中细菌总数的测定
采样量
根据实验需求确定采样量，一 般不少于1L。
保存与运输
将采集的水样低温保存，并尽 快送至实验室进行分析。
培养基选择与制备
培养基类型
选择适合水中细菌生长的培养基 ，如营养琼脂、胰蛋白胨大豆琼Hale Waihona Puke Baidu脂等。
培养基制备
按照培养基说明书的要求，准确 称量各成分，加入蒸馏水并加热 溶解，调整pH值后分装至培养皿 中，凝固后备用。
时一般采用平板计数法，选择菌落数在30-300之间的平板进行计数，
以确保结果的准确性。
03 实验步骤与操作
样品稀释与接种
样品稀释
取1mL水样，加入9mL无菌水中，充分混匀，得到10^-1稀释液。以此类推， 制备10^-2、10^-3等稀释液。
接种
分别取不同稀释度的水样1mL，倾注于无菌平皿中，每个稀释度做两个平行样。 同时，以无菌水作空白对照。
增加平行实验次数
通过增加平行实验次数，可以降低偶 然误差对实验结果的影响，提高实验 的准确性和可靠性。
定期校准仪器设备
定期对实验中使用的仪器设备进行校 准和维护，确保仪器设备的准确性和 稳定性。
06 实验结论与展望
实验结论总结
水中细菌总数的测定方法
通过本实验，我们成功验证了使用标准平板计数法来测定水中细菌总数的可行性和准确性。该方法包括水样采集、稀 释、涂布平板、培养、计数等步骤，能够较为准确地反映水样中的细菌数量。
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在 30-80 的Biblioteka Baidu释度计数，在该稀释度中选取 10 个视野，记录荧光点数，一个点 代表一个菌。 （ 8 ）原菌体浓度 E 计算： E X
S1 v1 V N ，其中 X 表示平均视 S2 v 2
野菌数，是 10 个视野中荧光点数的平均值，S1 表示磨面积，等于 D2π/4,其中 D 表示膜直径，为 25mm，S2 表示视野面积,等于 d2π/4,其中 d 为显微镜视野直径， 为 0.22mm ； v1 、 v2 分 别 表 示 原 菌 液 （ 4mL ） 和 固 定 后 菌 液 体 积 （4mL+0.160mL）,v1/v2 表示过滤的稀释液中原菌液比例；V 表示过滤的稀释菌 液的体积，为 9mL；N 表示稀释倍数。 实验中所有试剂，蒸馏水均经过 0.22μm 的微孔过滤，实验所用的过滤器， 无菌水，注射器，7mL 离心管，枪头等均灭菌后使用。
水体总细菌计数方法：AODC 计数
最早由 Francisco 等采用该方法计数自然水体中的细菌总数，从而确定了该 方法的基本程序 （Francisco et al., 1973） ， 后经由 Hobbie 等人 （Hobbie et al., 1977 ） 改进形成经典的计数方式而推广。国内目前主要用于水生环境中细菌的计数，有 外文文献报道用该法富集硝化细菌的富集（Ågot Aakrået al., 1999），尚未发现 将该法用于硝化细菌分离的实验。郑忠辉 1992 年在 《亚硝酸氧化细菌分离方法 的比较》 一文中提到稀释法成功分离到硝化细菌， 参照该实验方法， 利用 AODC 技术方法取代传统的细菌计数进行硝化细菌的分离。本实验主要依据 chwinghamer 的操作,采用 0.22µm 的纤维素微孔滤膜拦截细菌，截留率可以达到 90%以上 （chwinghamer, 1988 ） 。 实验中将低压真空泵更换成手动的玻璃过滤器， 操作更方便。具体实验参数由预实验操作确定，最终确定的操作步骤如下： （1）取样：无菌操作条件下，准确吸取 4mL 的富集培养液于灭菌烘干的 7mL 离心管内，盖紧盖子。 （2）振荡：将离心管固定在振荡器上，振荡 10min,使菌体充分打散。 （3）固定：加入 40%甲醛 0.160mL，混合均匀，固定 1-2min。 （4）梯度稀释：9mL 无菌水进行 10 倍数梯度稀释，确定稀释后液体量为 9mL。 （5）染色：加入 1g/L 的吖啶橙 0.9mL，控制吖啶橙的终浓度约 0.01%，染 色时间 7min。 （6）过滤：旋开无菌的一次性过滤器（直径 25mm） ，在过滤器滤层上加盖 一片直径 25mm，孔径 0.45μm 的微孔滤膜（保证 0.22μm 膜的平整性） ，再在膜 上放置一片直径 25mm， 孔径 0.22μm 经 2g/L 苏丹黑 4℃浸泡 16-24h 的微孔滤膜 （苏丹黑浸泡以去除微孔滤膜本身的自发荧光） ，旋紧后，标记，用过滤器吸取 染色后液体，微孔过滤，使菌体截留在 0.22μm 的苏丹黑溶液处理的膜上，蒸馏 水 3mL 洗涤染色液 PA 瓶，洗涤液依然微孔过滤。 （7）镜检观察： 干净的载玻片上滴加一滴松柏油， 将 0.22μm 的微孔滤膜转 移到玻片上， 加盖松柏油， 再加盖干净的盖玻片， 保证膜与盖玻片间无气泡， 100x 油镜下找到界面， 转换荧光显微镜微调至细菌荧光清晰界面观察，选取荧光点数