人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析完整版
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析
外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析一、实验目的（1）、熟悉淋巴细胞体外培养原理。
（2）、掌握人体微量血液体外培养技术。
（3）、通过本次实验掌握制备染色体标本的方法。
（4）、观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。
（5）、培养学生的自主能力，锻炼学生的动手操作能力。
二、实验原理外周血液中的小淋巴细胞几乎都处在G1期（或Go期）一般情况下是不再分裂的在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞随后进入有丝分裂。
这样经过短期培养秋水仙素的处理低渗和固定就可获得大量的有丝分裂细胞。
本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
染色体是组成细胞核的基本物质, 是基因的载体。
人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。
本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。
在正常情况下, 人外周血中是没有分裂相的, 只有在异常情况下才能发现。
植物血细胞凝集素(PHA) 是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在 PHA 作用下, 原处于 G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 进而进行有丝分裂。
利用 PHA 这一特性, 淋巴细胞经过含有 PHA 培养液培养, 在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体, 终止分裂中期的淋巴细胞, 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。
最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。
即可得到所需的人体染色体图形。
染色体组型，又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。
人外周血淋巴细胞培养及染色体观察
37 ℃低渗处理20min后，发到同学手中
低速离心机使用图解
离心机顶盖
转速旋钮 电源指示灯 电源开关
转速显示
时间旋钮
对称放置离心管后方可启动离心机！！！
离心后倒去上清
7、固定：固定液成分为甲醇:冰醋酸=3:1 。每只离心管中，加入固定液2ml（2只 离心管共需4ml），立即用滴管轻轻冲打 成细胞悬液，在室温中固定15min后，准备：在接种罩内，用移液器将培养液分装入 10ml培养瓶中，每瓶量为： – 1640培养液4ml – 小牛血清1ml – PHA 0.2ml – 肝素 0.05ml – 双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为100U/ml – pH：7.2‾7.4用3.5%碳酸氢钠调节
实验用药品
细菌过滤器
光源亮度调节手轮
实验全程录像
染色体G带核型图
染色体核型图
优秀实验报告展示一
优秀实验报告展示二
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 焦距粗\微调螺旋 集光镜 视度调节圈
Motic B1 目镜 瞳距调节拉板 物镜转换器 物镜 载物台 聚光镜 载物台左右推进螺旋 集光镜 焦距粗\微调螺旋 视度调节圈
10倍镜下镜检
玻片夹
使用油镜前，在玻片上滴加香柏油
油镜使用结束，用擦镜纸蘸洗镜液
擦洗油镜头
10倍镜下观察到的染色体分裂相
40倍镜下观察到的染色体分裂相
数码显微镜100X染色体观察一
数码显微镜100X染色体观察二
数码显微镜100X染色体观察三
五、实验结果
1．核型分析：绘制自己观察到的染色体 图谱，并注明分组编号（A,B和G组） 注明材料编号，并确定男女。 2，完成实验报告，当场打分。
人外周血培养实验报告
1. 掌握人外周血淋巴细胞体外培养技术。
2. 学习制备染色体标本并进行核型分析。
3. 了解淋巴细胞有丝分裂过程及其影响因素。
二、实验原理淋巴细胞是免疫系统中的重要细胞，在免疫应答和维持内环境稳定中起关键作用。
在体外培养条件下，淋巴细胞受到植物血球凝集素（PHA）的刺激，可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂周期。
通过秋水仙素处理，使细胞分裂停滞在中期，便于染色体标本的制备和核型分析。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：PHA、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、PRMI 1640或M199培养基、小牛血清、肝素、双抗等3. 仪器：显微镜、培养箱、吸管、培养瓶、载玻片、酒精灯、碘酒、无菌棉签等四、实验方法1. 采样：无菌条件下，取小鼠外周血0.5-1ml。
2. 培养液配制：无菌条件下，按照比例配制PRMI 1640或M199培养基、小牛血清、PHA、肝素、双抗等。
3. 细胞培养：将外周血加入培养瓶中，每瓶加20滴左右，轻摇均匀。
将培养瓶置于36℃培养箱中培养72小时，每隔12小时轻摇1次。
4. 秋水仙素处理：在培养72小时后，加入适量秋水仙素，使细胞分裂停滞在中期。
5. 细胞收获：收获细胞，进行低渗处理，使细胞膜破裂，染色体释放。
6. 固定：将低渗处理后的细胞加入甲醇和冰醋酸的混合液中固定。
7. 染色：将固定后的细胞涂片，进行染色。
8. 显微镜观察：在显微镜下观察染色体形态，进行核型分析。
1. 细胞培养：在培养过程中，细胞逐渐增多，形成细胞群体。
2. 秋水仙素处理：细胞分裂停滞在中期，染色体形态清晰。
3. 显微镜观察：观察到人类染色体，男性为46，XY；女性为46，XX。
六、实验讨论1. 外周血淋巴细胞培养的成功与否，取决于培养液的成分和培养条件。
本实验采用PRMI 1640或M199培养基，并加入适量小牛血清、PHA、肝素、双抗等，保证了细胞的正常生长。
2. 秋水仙素处理是本实验的关键步骤。
适量的秋水仙素可以使细胞分裂停滞在中期，便于染色体标本的制备和核型分析。
人类外周血淋巴细胞的分离培养与核型分析小论文
综合性（设计性）实验实验报告实验名称：人类外周血淋巴细胞的分离培养与核型分析姓名：指导教师：专业：生物科学实验班级：实验地点：遗传实验室成绩：人类外周血淋巴细胞的分离培养与核型分析一．实验目的1.掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。
2.掌握离心机使用、低渗处理、染色、采血技术。
3.学习对人的外周血淋巴细胞进行核型分析。
二．实验原理人体外周血液中小淋巴细胞，通常都在G1期或G0期，一般情况下是不分裂的。
当在离体培养条件下，加入植物凝血素（PHA），小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养，白细胞中含有小淋巴细胞。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G1期或G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新有丝分裂的能力，经一段时间的培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。
秋水仙素可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。
此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。
体外培养的原理是将离体的细胞放入培养基中进行生长繁殖，保持细胞的生命活力，便以对细胞进行各方面的研究。
体外培养技术已经广泛应用在杂交瘤技术制备单克隆抗体，动物细胞的大规模培养，微生物制药技术，基因转染与细胞融合以及细胞转化工程技术等方面。
低渗处理的目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。
同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。
外周血淋巴细胞培养与染色体制备
01
提交方式
根据实验室或研究机构的要求， 选择合适的提交方式，如纸质版 或电子版。
提交时间
02
03
交流与讨论
按照规定的时间节点提交实验报 告，确保数据的及时性和有效性。
与其他研究者或导师进行交流与 讨论，对实验结果进行深入探讨 和改进。
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04 外周血淋巴细胞培养注意 事项
细胞培养环境控制
温度
CO2浓度
维持恒定的温度是细胞生长的必要条 件，通常在37°C左右。
维持5%的CO2浓度，以维持培养基的 酸碱平衡。
湿度
保持培养箱内湿度在95%左右，以防 止细胞干燥。
细胞培养基质选择
01
选择适合淋巴细胞生长的培养基 ，如RPMI-1640或DMEM培养基 。
收获细胞
当细胞达到一定数量或生长状 态良好时，可以收获用于后续 实验或应用。
02 染色体制备
染色体分散
染色体分散是染色体制备的重要步骤，通过使用低渗溶液或机械力等方法使细胞膜 通透性增加，染色体从细胞中释放出来。
染色体分散的关键在于保持细胞的完整性和染色体的天然状态，以避免染色体畸变 或丢失。
常用的染色体分散方法包括低渗法、酶解法、机械法等，选择合适的方法取决于实 验目的和细胞类型。
02
根据需要添加适量的生长因子、 抗生素等添加剂，以促进细胞生 长和防止污染。
细胞培养过程监控
定期观察细胞生长情 况，记录细胞密度、 形态等指标。
定期进行微生物检测， 确保无污染发生。
定期检测培养基的 pH值和渗透压，确 保培养基的适宜条件。
05 染色体制备注意事项
染色体制备试剂选择
核型分析
人外周血淋巴细胞的分离培养及核型分析一、实验目的1．学习人体微量外周血分离培养的方法2．学习应用培养淋巴细胞进行染色体制片的方法3．了解人类染色体核型的基本特征4．通过对人类染色体组型进行分析，初步学会对染色体进行分析的方法。
二、实验原理人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养，白细胞中含有小淋巴细胞。
外周血是制备动物染色体标本的重要材料之一。
通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现，其他动物如两栖类外周血中也只是偶尔能见到分裂相。
外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。
在人工离体培养时，在培养基中加入一定剂量的植物血凝素（PHA）后，小淋巴细胞受刺激可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。
外周血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。
用秋水仙素（细胞分裂阻断剂）处理，积累分裂相，可使处在分裂期的淋巴细胞停留在分裂中期或早中期，从而获得足够的可供分析的中期分裂相。
此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。
核型分析是指在有丝分裂中期，对染色体大小形态、数目测量，进行排队分组分析。
不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。
在显微镜下观察染色体的结构和数量。
正常男性的染色体核型为44条常染色体加2条性染色体X和Y。
正常女性的常染色体与男性相同，性染色体为2条XX。
三、实验仪器与试剂1. 实验材料：人外周血淋巴细胞2.实验试剂RPMI“1640”培养基、小牛血清（冰冻保存，用时在56℃水浴条件灭活）、、秋水仙素、植物血球凝集素（PHA）、肝素、生理盐水溶液（500U/ml）、5%NaHCO3双抗（青霉素：50000U/ml，链霉素：50000ug/ml）、2%碘酒、pH6.8的磷酸缓冲液、75%酒精、0.075mol/L KCl、固定液（甲醇：冰醋=3：1）、Giemsa原液。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
核型分析【范本模板】
人外周血淋巴细胞的分离培养及核型分析一、实验目的1．学习人体微量外周血分离培养的方法2．学习应用培养淋巴细胞进行染色体制片的方法3．了解人类染色体核型的基本特征4．通过对人类染色体组型进行分析，初步学会对染色体进行分析的方法. 二、实验原理人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养,白细胞中含有小淋巴细胞.外周血是制备动物染色体标本的重要材料之一。
通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂相的,只有在异常情况下才能发现,其他动物如两栖类外周血中也只是偶尔能见到分裂相。
外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态.在人工离体培养时,在培养基中加入一定剂量的植物血凝素（PHA）后,小淋巴细胞受刺激可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂.外周血中的淋巴细胞经过68—72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。
用秋水仙素(细胞分裂阻断剂）处理，积累分裂相，可使处在分裂期的淋巴细胞停留在分裂中期或早中期，从而获得足够的可供分析的中期分裂相。
此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。
核型分析是指在有丝分裂中期，对染色体大小形态、数目测量，进行排队分组分析。
不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。
在显微镜下观察染色体的结构和数量。
正常男性的染色体核型为44条常染色体加2条性染色体X和Y.正常女性的常染色体与男性相同，性染色体为2条XX。
三、实验仪器与试剂1. 实验材料：人外周血淋巴细胞2.实验试剂RPMI“1640”培养基、小牛血清（冰冻保存,用时在56℃水浴条件灭活）、、秋水仙素、植物血球凝集素（PHA）、肝素、生理盐水溶液（500U/ml）、5%NaHCO3双抗（青霉素：50000U/ml，链霉素：50000ug/ml）、2％碘酒、pH6。
外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备
乙液：一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L 甲液：二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含 11.864g/L 根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液, 混合均匀即得.
实验步骤
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1培养液的分装:在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各 试剂剂分装入玻瓶,每瓶量为 :
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完全培养基3ml
PHA 20ul
外周血淋巴细胞培养和染色体 标本制备,染色体组型分析
实验目的
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1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与 染色体标本制备。 2、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
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实验原理
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人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞 和血小板不能离体培养。每1ml 外周血中一般含有约1～3×106 个小淋巴细胞， 几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态 ，一般情 况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后， 淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行 有丝分裂。经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的 处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行 染色体标本制备和核型分析。
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9制片:留固定液 0.5毫升, 用滴管小心冲打成悬液。 从冰箱的冰格中或冰水 中取 出载玻片,每片滴加悬液 1~3滴,吹散,在酒精灯火焰上过火。室温过夜。
11染色:用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释后的姬姆萨染色液染色 20分钟,然后倒 去染液,用蒸馏水轻 轻冲洗 . 12镜检:待稍干后,在显微镜下观察,先用低倍镜寻找良好的分裂相,然后再用高 倍油 镜观察。
人染色体组型及其特征
实验材料
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1.1试验材料:人外周血淋巴细胞 1.2试验用具:离心管、吸管，量筒、 载玻片，常规清洗烘干，培 养瓶、、1ml/5ml移液枪,灭菌处理， 天平、离心机、恒温培养 箱、显微镜、普通冰箱，酒精灯。 1.3试剂药品 完全培养基 凝血素(PHA ) 5mg/ml
5blood实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析
实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析5.1 相关基础知识人外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期（G0期），一般情况下是不再分裂的。
在培养液中加入植物凝血素（PAH）时，小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
这样经过短期培养、秋水仙素的处理、低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。
目前本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等领域广泛采用。
人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。
根据各组染色体的特征予以分组：A组：（N01～03）是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在中部；B组（N04～05）为两对大的亚中着丝粒染色体，它们有显的长臂和短臂；C组（N06～12+X）为中等大小的亚中着丝粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介于期间，一般难以区分；D组（N013～15）为中等大小的端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；E组（N016～18）包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对近端着丝粒染色体；F组（N019～20）为两对小的中着丝粒；G组（N021～22+Y）为最小的一组端着丝粒染色体，在N021～22的短臂上可见随体，Y常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。
5.2 实验目的和要求(1)掌握人体微量血液体外培养技术和制备染色体标本的方法；(2)观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。
5.3 实验材料和仪器5.3.1 实验材料和试剂(1)人的外周血淋巴细胞；(2)Giemsa母液：量取33ml甘油，先在研钵内加入少量甘油与0.5g Giemsa粉混合，研磨至无颗粒为止，再将剩余甘油倒入，搅拌后于56o C水浴保温2小时，再加入33ml甲醇，搅拌均匀后储存于棕色瓶中；(3)Giemsa染色液：将Giemsa母液用0.1M pH7.4磷酸缓冲液稀释至10倍。
人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养摘要淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞，在免疫中起关键作用，维持内环境的稳定。
对人的外周血淋巴细胞进行染色体核型分析对人类遗传研究及临床应用有重大意义。
每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体，可在显微镜下观察到。
本次实验的目的就是掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人的外周血淋巴细胞进行核型分析。
每1ml 外周血中一般含有约1～3×106个小淋巴细胞，几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态，一般情况下是不再分裂的。
但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。
经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标本制备和核型分析。
这种微量全血培养技术已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面得到了广泛应用。
本实验采取了人类的外周血进行实验，经各种技术处理后最后得到较为清晰的人体染色体照片。
通过实验发现：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男性是46，XY；女性是46，XX。
根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G7组共23种类型。
关键词人的外周血淋巴细胞染色体低渗溶液核型分析秋水仙素动物细胞体外培养Human Peripheral Blood Lymphocyte CultureAbstract: Lymphocytes are among the most important immune system cells in the immune plays a key role in together, in order to maintain a stable environment. To analyze chromosome of lymphocytes is very important. Various biological chromosome number and shape are constant,can be seen under a microscope. The purpose of this experiment is human body trace blood samples were cultured in vitro chromosome preparation methods and studying on the peripheral blood lymphocyte karyotype analysis on.In human body's 1ml circumference blood includes approximately 1~3×106 the small lymphocyte generally, usually they are between time G0 and the G1 time, generally is not divided. But when adding plant in medium coagulopathy (PHA), lymphocyte transformation and stimulated for lymphatic mother cell proliferation capacity, make its recovery, then entering mitosis. After 66~72 hours(three cycles) short-term training, autumn grain processing, daffodil, low permeability and fixed can be gained lots of mitotic cells, for makes the chromosome specimen preparation and analysis. This kind of micro wholeblood culture technique in aspects and so on clinical medicine, virology, Pharmacology, heredity toxicology obtained widespread application.The experimental taken to conduct experiments on human peripheral blood, the various technical ultimately be treated more clear picture of human chromosomes. Through the experiments have found that each human somatic chromosome, 22 to 46 euchromosome sex chromosomes, and a pair of 46 XY; male is, Women are 46, XX. This method has been clinical medicine and virology, pharmacology, genetic toxicology etc widely. According to the chromosomes of the shape, size, and the centromere position, the peripheral lymphocytes 46 chromosomes into A, B, C, D, E, F, the G7 group of 23 types.Key words: Human blood lymphocytes Chromosome Low permeability solutionKaryotype analysis Autumn daffodils element zooblast in vitro raise offcenter前言细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。
细胞学自主实验 染色体核型分析
人体外周血淋巴细胞培养、染色体制备及染色体核型分析09级一班 3组摘要：细胞培养是指在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。
体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。
处于增殖期的培养淋巴细胞经过秋水仙素处理，可停留在分裂中期或早中期，这一时期的染色体形态为棒状结构，是观察分析染色体的最佳时期一、实验目的1．学习人体细胞离体培养的方法；2．掌握制作人染色体标本的方法；3．观察人类染色体的形态和染色体数目；4．熟悉染色体核型分析。
二、实验原理细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。
如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。
所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。
外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G。
期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新获得有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。
秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。
此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认与观察。
染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞染色体进一步分散而利于分析。
同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。
细胞自主实验 人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析
人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析一、实验背景：人类染色体组型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
通过对人类染色体组型进行分析，可以初步学会对染色体进行分析的方法。
二、实验原理1，细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
2，染色体是组成细胞核的基本物质, 是基因的载体。
人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。
本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。
在正常情况下, 人外周血中是没有分裂相的, 只有在异常情况下才能发现。
植物血细胞凝集素(PHA) 是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在 PHA 作用下, 原处于 G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 进而进行有丝分裂。
利用 PHA 这一特性, 淋巴细胞经过含有 PHA 培养液培养, 在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体, 终止分裂中期的淋巴细胞, 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。
最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。
即可得到所需的人体染色体图形。
染色体组型，又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。
核型模式图，是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。
染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列，对各染色体的形态进行分析。
人类外周血培养及染色体核型分析
人类外周血培养及染色体核型分析一、实验目的：1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法；2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本；3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。
二、实验原理：1、植物血凝素的作用外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或G1期，一般情况下是不分裂的。
当在培养基中加入植物血凝素(PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。
2、秋水仙素的作用：秋水仙素(colchicines)可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。
因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。
使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。
3、低渗的原理：徐道觉(T.C.Hsu)等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提高。
这种技术被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。
4、核型和带型：核型(karyotype)：是指染色体组在有丝分裂中期的表型, 是染色体数目、大小、形态特征的总和。
在对染色体进行测量计算的基础上, 进行分组、排队、配对, 并进行形态分析的过程叫核型分析。
将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。
带型（banding pattern）即染色体带型。
借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。
染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。
常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带等。
就每一种分带技术而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。
三、实验用具及试剂：1.实验仪器及用具：恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪；培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析学院：生命科学学院专业：生物科学年级班级：2010级5班校区编码：北区姓名：陈建坤二零一二年十二月四日人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。
本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。
该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。
经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。
最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。
【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养一．引言:染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。
人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。
染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。
1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。
1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。
之后，有科学家建立了人体外周血培养法，使得染色体取材变得更加容易，大大推动了人类对染色体的研究。
二．人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析1.实验依据：.细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
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人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析学院：生命科学学院专业：生物科学年级班级：2010级5班校区编码：北区姓名：陈建坤二零一二年十二月四日人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。
本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。
该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。
经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。
最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。
【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养一．引言:染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。
人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。
染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。
1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。
1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。
之后，有科学家建立了人体外周血培养法，使得染色体取材变得更加容易，大大推动了人类对染色体的研究。
二．人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析1.实验依据：.细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
.染色体是组成细胞核的基本物质, 是基因的载体。
人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。
本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。
在正常情况下, 人外周血中是没有分裂相的, 只有在异常情况下才能发现。
植物血细胞凝集素(PHA) 是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在 PHA 作用下, 原处于 G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 进而进行有丝分裂。
利用 PHA 这一特性, 淋巴细胞经过含有PHA 培养液培养, 在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体, 终止分裂中期的淋巴细胞, 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。
最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。
即可得到所需的人体染色体图形。
染色体组型，又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。
核型模式图，是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。
染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列，对各染色体的形态进行分析。
在细胞遗传学、现代分类学、生物进化和遗传育种学等研究中，是重要的研究手段。
.对于任何一个染色体的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
其中22对是男女共有的染色体，一对为男女所不同的性染色体，男XY,女XX。
3、实验仪器试剂及材料：.材料：人的静脉外周血. （组内选取男女各一名，取血样）.试剂：RPMI-l640培养粉 NaHCO3 NaCl PHA(植物血球凝集素) 肝素青链霉素小牛血清秋水仙素 95%酒精冰乙酸甲醇甘油 Giemsa粉末.器材：恒温培养箱,电冰箱,高压灭菌锅,离心机,真空泵,分析天平,显微镜,超净工作台,注射器,离心管,培养瓶,试管架及试管,量桶,烧杯,酒精灯,抽滤瓶,G6型号细菌过滤漏斗，染缸，滴管等。
4、实验方法：.各种试剂及培养基的配制(1)RPMI-1640基础培养基的配制：称取RPMI-l640培养粉溶于1,000mL蒸馏水中,经G6型号细菌过滤漏斗中微米的滤膜抽滤后备用。
使用前最好做热源培养以确保实验顺利进行。
(2)5%NaHCO3的配制：称取5gNaHCO3,溶于100mL蒸馏水中,高压灭菌备用.(3)生理盐水的配制：称取溶于l00mL蒸馏水中高压灭菌备用.(4)PHA(植物血球凝集素)的配制：称取PHA50mg配制成浓度为lmg/mL(生理盐水配制)的溶液.由于PHA使用量较少,配制时使用注射器式无菌过滤器,以减少药品损失.(5)肝素溶液的配制：40ml生理盐水溶解粉末160mg（每mg含126单位），配制成500单位/ml，8磅15min灭菌。
(6)双抗溶液的配制：将青链霉素用生理盐水按效价单位配成l0万单位/mL,配制过程要求使用注射器式无菌过滤器.(7)秋水仙素溶液的配制：用生理盐水配制成浓度为40（微克/mL）秋水仙素溶液,使用注射器式无菌过滤器进行除菌操作.(8)低渗液溶液的配制：称取溶于1000mL双蒸馏水中,配制成溶液浓度为L的低渗液溶液.(9)细胞培养基的配制：在每个培养瓶中加入RPMIl640基础培养基4mL,小牛血清lmL,肝素3滴（）,PHA4滴（ ml）, 加入双抗5滴（）,NaHCO3调pH至～.（10）固定液的配制：9ml纯酒精+3ml冰乙酸（11）Giemsa（吉姆斯）染液（不用配）Giemsa原液配制：称Giemsa粉末，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。
56℃中保温90～120min。
加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。
实验操作方法1、实验所用药品及器皿的无菌处理(1) 实验用的所有器皿,器具都必须按规定洗净,高压灭菌处理备用.(2) 实验用全部药品都要经高压灭菌或过滤除菌处理.具有生物活性的药品要经G6型号细菌过滤漏斗抽滤除菌,其它药品可经过高压灭菌。
2.采取血样：去校医院取本组男生和女生各2份血样。
在无菌条件下，向含有3mlRPMI-1640培养基的培养瓶中接种 ml全血，轻轻摇匀。
3.血细胞培养：将4瓶装有血细胞的培养瓶置于37℃培养箱中培养66～72h（在培养期间每天摇动两次），终止培养前3～4h加入秋水仙素15ml，使最终浓度为～ml。
4.收集细胞：将培养瓶从温箱取出，用吸管将贴壁细胞冲散均匀，按下表将液体5.6ml KCl溶液，37℃低渗20min。
（使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察）6.预固定：沿管壁慢慢加入1ml新配carnoy氏固定液，轻轻吹打混匀，1000rpm/min离心8min，去上清液。
7.固定：沿管壁慢慢加入6ml固定液，固定两分钟后再吹打，用吸管轻轻地吹打，使细胞分散，固定20min，离心去上清夜。
8.重复固定：取上清液，再重复进行7过程。
9.滴片：沉淀物中加入6滴固定液，用吸管吹打使其成为细胞悬液；用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2～3滴细胞悬液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥（或空气干燥）。
10.染色：滴有细胞悬液的载片反扣在染色板上，使片、板之间有一缝隙，将稀释后的Giemsa染液滴在片隙中，染色20min（或放于染缸中）；自来水冲洗，吹干。
11.镜检：在低倍镜找到处于中期分裂相的细胞，然后在转至高倍镜下观察.观察时要使用推进器座标尺记录分散良好的细胞位置，便于重新查找，选择染色体分散好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微观察。
人类每个体细胞有46条染色体，根据染色体的长度和着丝粒位置的不同，可以分成22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。
12.染色体组型分析：(1) 在显微镜下找出染色体分散良好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄。
(2) 将显微拍摄放大的照片上的一个细胞的全部染色体分别一条一条剪下。
(3) 根据染色体的长短和形态特征进行同源染色体的目测配对。
(4) 测量出每条染色体短壁和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数，记录原始数据。
(5) 根据测量数据校正目测配对排列结果，进行调整排列。
(6) 把染色体按一定顺序一对一对的排列，排列时注意短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列，最后把染色体贴成一完整的染色体核型图。
(7) 翻拍。
5．实验结果及分析.本实验采用国际标准，使用两种方法，依照上表各指标分析染色体组型，拟图，结果如下男性染色体核型（PS）女性染色体核型（PS）男性染色体核型（手工）女性染色体核型（手工）染色体长臂短臂臂指数着丝粒指数长度总长相对长度臂判断着丝粒判断1 中中2 中中3 中中4 中中5 中中6 中中7 亚中亚中8 亚中亚中9 亚中亚中10 亚中亚中11 亚中亚中12 亚中亚中13 亚中亚中14 亚中亚中15 亚中亚中16 亚中亚中17 亚中亚中18 亚中亚中19 亚中亚中20 亚中亚中21 亚中亚中22 亚中亚中工），均得到相同的人体染色体组型，人体正常细胞核型含46条染色体，相互配对成23对。
其中22对为男女共有的常染色体。
另一对男XY，女XX为男女所独有的，决定性别的性染色体。
.实验细胞培养过程中，每个培养瓶中均出现血细胞凝集现象，定期的摇动可以将其分散。
然而男1培养瓶由于摇动的时间以及次数比较少，出现了凝集成血块状的沉淀，但是并没有对实验结果产生严重影响。
在后期的试验中仍可拍到很好地图像,如上图男性染色体核型(ps）所示..根据实验所拍到的图像可得知，女2②号、男2②培养瓶所拍到的染色体的分散程度比其他培养瓶的较好。
表明低渗的处理时间会对染色体的分散程度产生影响，低渗25min的效果比低渗20min的效果好。
.相比其他组所拍到的染色体，我们组的染色体明显较短。