Amicon Ultra-0.5超滤管

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超滤管使用方法

首页>>> 技术资料超滤管使用方法和注意事项蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。

也有其它型号的、不同体积大小和MWCO超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。

可重复使用，使用一次就扔掉太浪费。

以下是个人总结的使用方法和注意事项。

1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，最常见的是Ultra-15（10kD）。

到底选择多大截留分子量比较合适呢？10kDa、 5kDa、还是30kDa？通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。

若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。

认真阅读使用说明书，注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同，表格中有。

2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。

然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。

操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。

3、平衡。

质量和重心二者都要达到平衡。

注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。

开始离心超滤（离心机预冷至4度）。

不同离心机的转速 rpm换算成g之后，有所不同。

具体可参阅附件里的说明书。

离心机的加速度调至最低档，减小对膜的压力。

注意，一定要等离心机达到目的转速之后，方可离开离心机，否则离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可预测！膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。

在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。

4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。

如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。

光甘草定-烟酰胺纳米乳的制备与抗氧化效果

第 42 卷第 5 期2023年 9 月Vol.42 No.5Sept. 2023中南民族大学学报（自然科学版）Journal of South-Central Minzu University（Natural Science Edition）光甘草定-烟酰胺纳米乳的制备与抗氧化效果鲁妍，聂琴，赵海燕，黄婷婷，王少兵*（中南民族大学药学院，武汉430074）摘要制备光甘草定-烟酰胺纳米乳（G-N-NE）并初步评价其抗氧化效果. 采用相转变乳化高压均质法制备G-N-NE，借助伪三元相图法联合Box-Behnken响应面设计法（BBD-RSM）筛选获得G-N-NE最佳处方并进行验证，通过DPPH·自由基清除率初步评价了G-N-NE的抗氧化效果. 结果表明：G-N-NE最佳处方为辛酸癸酸三酰甘油/肉豆蔻异丙酯/吐温80/无水乙醇/光甘草定/0.10%烟酰胺水溶液（3.97∶1.99∶18.54∶4.64∶0.10∶70.76），粒径为（88.41 ± 0.19）nm，多分散指数PDI为（0.253 ± 0.01），Zeta电位为（-7.79 ± 0.12）mV，烟酰胺载药量与包封率分别为（5.42 ± 0.04）%与（93.01 ± 0.23）%，光甘草定的载药量与包封率分别为（6.82 ± 0.06）%与（97.01 ± 0.06）%，相比光甘草定-烟酰胺溶液和光甘草定纳米乳，G-N-NE对DPPH·自由基有更好的清除效果，说明G-N-NE性质稳定、包封率高，具有良好的抗氧化效果.关键词纳米乳；伪三元相图；Box-Behnken响应面设计法；光甘草定；烟酰胺中图分类号R943 文献标志码 A 文章编号1672-4321（2023）05-0620-07doi：10.20056/ki.ZNMDZK.20230506Preparation and antioxidant efficacy of glabridin-nicotinamideloaded nanoemulsionLU Yan,NIE Qin，ZHAO Haiyan，HUANG Tingting，WANG Shaobing*（School of Pharmaceutical Sciences， South-Central Minzu University， Wuhan 430074， China）Abstract Glabridin-nicotinamide loaded nanoemulsion （G-N-NE） was prepared and its antioxidant effect was evaluated preliminarily. G-N-NE was prepared by phase transition emulsification high-pressure homogenization method，and its optimized prescription was obtained and verified by the pseudo-ternary phase diagram method combined with Box-Behnken response surface design method （BBD-RSM）. The DPPH scavenging rate was used to preliminarily evaluate the antioxidant efficacy of G-N-NE. The results indicated that the optimized prescription of G-N-NE was caprylic acid capric acid triacylglycerol/myristyl isopropyl ester/Tween 80/absolute ethanol/glycyrrhizin/0.10% nicotinamide aqueous solution （3.97∶1.99∶18.54∶4.64∶0.10∶28.24）， the particle size was （88.41 ± 0.19）nm， the polydispersity index （PDI） was 0.253 ± 0.01，the zeta potential was （-7.79 ± 0.12）mV，the drug loading and encapsulation efficiency of nicotinamide were （5.42 ± 0.04）% and （93.01 ± 0.23）%，and the drug loading and encapsulation efficiency of glabridin were （6.82 ± 0.06） % and （97.01 ± 0.06） %， respectively. Compared with glabridin-nicotinamide solution and glabridin nanoemulsion，G-N-NE had a better scavenging effect on DPPH·free radicals， which indicated that G-N-NE has stable properties， high encapsulation efficiency and satisfying antioxidant efficacy.Keywords nanoemulsion；pseudo-ternary phase diagram；Box-Behnken response surface design method；glabridin；nicotinamide光甘草定具有较强的抗自由基氧化活性，能有效抑制黑色素生成，从而具有美白抗氧化作用［1-2］. 然而，光甘草定存在溶解性差、生物利用度低的问题［3］，限制了其在美白化妆品中的应用. 因此，提高收稿日期2022-01-10* 通信作者王少兵（1977-），男，副教授，博士，研究方向：药物制剂，E-mail：********************.cn 基金项目中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（CZD20005）第 5 期鲁妍，等：光甘草定-烟酰胺纳米乳的制备与抗氧化效果光甘草定的生物利用度与美白功效成为了化妆品研究需要解决的问题.近年来，许多新剂型或制剂技术（如乳液、脂质体、环糊精、微粒等）用于装载光甘草定以提高其生物利用度. 阳天舒等［4］选用乙醇-丙二醇混合溶剂作为柔软剂制备光甘草定醇质体，其抑制黑色素生成及抗氧化作用均得到提高增强. 魏永晴等［5］制备的光甘草定/羟丙基-β-环糊精提高了光甘草定的溶解度和生物利用度，与相同浓度的自由光甘草定相比，包合物的形成使其清除DPPH自由基能力提高了9倍，抑制酪氨酸酶活性提高了20倍.纳米乳（nanoemulsion，NE）是一种由水、油与乳化剂自发形成的粒径为1~100 nm的均相分散体系［6］，其用作难溶性药物的输送系统，能够改善药物的溶解度与稳定性，提高药物的生物利用率. 响应面设计法（RSM）是利用合理的试验设计方法并通过实验得到相关数据，拟合及分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法. 具有试验次数少、精密度高、模型预测性能好、可用于研究几种因素间交互作用等优点，常常用于制剂处方筛选与工艺参数优化［7-8］.据文献报道，光甘草定与烟酰胺合用能增强美白功效［9］，结合光甘草定溶解性差与生物利用度低的问题，本研究设计了光甘草定-烟酰胺纳米乳（G-N-NE）处方，围绕油相、乳化剂、助乳化剂和投药量等因素对纳米乳的影响，利用伪三元相图联合Box-Behnken响应面设计法（Box-Behnken response surface design method，BBD-RSM）对纳米乳处方进行了筛选，对纳米乳的载药量、包封率、粒径等性质进行了考察，并探讨了G-N-NE对DPPH·自由基清除作用.1　实验部分1.1　样品、试剂和仪器光甘草定（西安天广源）；左旋多巴、多酚氧化酶（菌菇）（上海源叶）；烟酰胺、吐温80、司盘80、PEG-40氢化蓖麻油、蓖麻油氢氧乙烯醚、月桂醇聚醚-9、棕榈油、肉豆蔻酸异丙酯、辛基十二醇、辛酸/癸酸三酰甘油、7号白油与PEG-400（山东优索化工）；甘油、1，2-丙二醇、无水乙醇（国药集团）；甲醇、乙腈（美国赛默飞），甲醇和乙腈为色谱纯，甘油、1，2-丙二醇和无水乙醇为分析纯，其余试剂均为日化级. Amicon®Ultra-0.5超滤离心管（美国Millipore）；Zetasizer micro ZSE型纳米粒度电位仪（英国Malvern Panalytical）；高效液相色谱仪（Agilent 1100，美国安捷伦）；全波长酶标仪（瑞士TECAN）.1.2　纳米乳的制备采用相转变乳化高压均质法［10］，将处方量的光甘草定、乳化剂、助乳化剂加入油相中，搅拌均匀，将处方量的烟酰胺溶解于超纯水中作为水相，然后缓慢将水相滴加到油相体系中，边加边磁力搅拌制得粗乳，于室温均质循环20次，均质压力为600 Pa，得O/W型G-N-NE.1.3　色谱条件采用HPLC法测定烟酰胺和光甘草定含量［11-12］，色谱条件如下：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱程序为0~3 min，6% B；3~8 min，60% B；8~15 min，60% B，检测波长为220 nm，柱温30 ℃，流速为1.0 mL·min-1，进样体积为10 μL. 1.4　粒径、PDI和Zeta电位的测定取适量G-N-NE溶液，采用Zetasizer micro ZSE 纳米粒度电位仪在室温下测量纳米乳液的平均粒径、PDI和Zeta电位，平衡时间设为60 s，扫描间隔为10 s，温度设为25 ℃，每个样品平行分析3次. 1.5　包封率（EE）和载药量（DL）测定精密移取G-N-NE溶液0.5 mL置于10 mL容量瓶，加甲醇超声破乳20 min，使用甲醇定容后摇匀，取2 mL溶液于4000 r·min-1下离心10 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液在“1.3”条件下测定总药物量W Total.移取G-N-NE溶液0.5 mL于超滤管（MW：100 kD）中，在10000 r·min-1下离心10 min，精密移取1.0 mL超滤液至10 mL容量瓶，甲醇稀释定容，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液在“1.3”条件下测定游离药物量W Free.按照以下公式计算包封率与载药量：EE=W Total-W FreeW Total×100%，（1）DL=W Total-W FreeW NE×100%，（2）式中：W NE为纳米乳体系质量.1.6　光甘草定溶解度测定过饱和法［11］测定光甘草定在各种辅料中的溶解度. 分别取辛酸/癸酸三酰甘油（GTCC）、肉豆蔻酸异丙脂（IPM）、辛基十二醇、棕榈醇、7号白油、聚乙621第 42 卷中南民族大学学报（自然科学版）二醇400、丙二醇（PG）、甘油、乙醇、司盘 80（Span 80）、聚乙二醇-40氢化蓖麻油（CO 40）、蓖麻油氢氧乙烯醚（EL 40）、月桂醇聚醚9（AEO 9）、吐温80（Tween 80）适量置于具塞试管中（平行3份），加入过量光甘草定原料药，置于37 ℃恒温振荡器中，振摇48 h，离心，取上清液用甲醇稀释，1.3项下方法测定光甘草定在各辅料中的溶解度.1.7　纳米乳处方筛选将乳化剂与助乳化剂按一定质量比（K m）混匀形成混合乳化剂，再将油相与水相按体积比分别为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混匀，在磁力搅拌情况下逐滴加入混合乳化剂，记录体系由浑浊变为澄清时的临界混合乳化剂添加量. Origin软件，以水相、油相及混合乳化剂体积为3个顶点，绘制伪三元相图，以伪三元相图中纳米乳区域面积的大小作为筛选油相、乳化剂、助乳化剂和K m值的依据.1.8　纳米乳配方优化以混合乳化剂浓度（X1/%），烟酰胺水溶液浓度（X2/%）和药物质量分数（X3/%）为考察因素（表1），以粒径（Y1/nm）、PDI（Y2）为评价指标，以纳米乳的粒径小于100 nm，PDI小于0.3优化处方参数. 确定出最佳配方，并进行验证性实验.1.9　初步评价纳米乳抗氧化效果以85%乙醇为溶剂，分别配制受试浓度0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的待测样，取0.1 mL待测样加到96孔板后，加入0.1 mL 2.0×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液，25 ℃孵育20 min，于波长517 nm 处测定吸光度A1；取0.1 mL待测样和0.1 mL 85%乙醇混匀加到96孔板，于波长517 nm处测定吸光度A2；取2.0×10-4mol·L-1的DPPH·乙醇溶液与0.1 mL 85%乙醇混匀加到96孔板，25℃孵育20 min，于波长517 nm处测定吸光度A3，按式（3）计算DPPH清除率［13］：DPPH清除率=(1-A1-A2A3)×100%.（3）2　结果与讨论2.1　光甘草定在不同辅料中的溶解度由表2可见，相比水相辅料可显著增加光甘草定的溶解度，光甘草定在油脂辛基十二醇、GTCC和IPM中溶解度较大，在表面活性剂吐温80中溶解度较大，在助乳化剂丙二醇和无水乙醇中溶解度也较大.2.2　纳米乳配方筛选2.2.1　油相的确定以Tween80为乳化剂，PG为助乳化剂，浓度1%的烟酰胺水溶液为水相，K m = 1∶1，以不同油脂作为油相绘制的伪三元相图见图1.由图1可见，IPM、GTCC∶IPM（V/V） = 1∶1以及GTCC∶IPM（V/V） = 2∶1作为油相时形成的纳米乳区较大，结合光甘草定在GTCC中溶解度最大，确定以GTCC ∶ IPM = 2∶1作为油相.2.2.2　乳化剂的确定以GTCC∶IPM = 2∶1（V/V）为油相，PG为助乳化剂，质量浓度1%的烟酰胺水溶液为水相，K m = 1∶1，以不同表面活性剂作为乳化剂绘制的伪三元相图见图2.由图2可见，Tween 80为乳化剂时形成的纳米乳区最大，此外，纳米乳液体系的最重要标准是所有赋形剂都要属于“一般认为安全”的类别［14］，考虑Tween 80对难溶性药物不仅有很好的增溶效果［15］，还具有较宽的安全窗，因此选择Tween 80为制备G-N-NE的乳化剂.表1　自变量各水平的编码值及实际值Tab.1　The coded value and actual value of each level of theindependent variable自变量X1：混合乳化剂浓度/% X2：烟酰胺水溶液浓度/% X3：药物质量分数/%水平-170500.0580700.10190900.15表2　光甘草定在不同辅料中的溶解度（n=3）Tab.2　Solubility of licorice in different excipients （n=3）种类油脂表面活性剂助乳化剂介质辛基十二醇辛酸/癸酸三酰甘油七号白油棕榈醇肉豆蔻酸异丙脂吐温80蓖麻油氢氧乙烯醚聚乙二醇-40氢化蓖麻油司盘80月桂醇聚醚9无水乙醇甘油丙二醇聚乙二醇400溶解度/（mg·L-1）700.17 ± 5.122109.59 ± 21.8817.56 ± 0.635.34 ± 0.27339.81 ± 3.56731.45 ± 11.4120.74 ± 0.0320.88 ± 0.135.49 ± 0.05472.58 ± 2.79427.48 ± 3.964.67 ± 0.12205.33 ± 1.2739.83 ± 0.08622第 5 期鲁妍，等：光甘草定-烟酰胺纳米乳的制备与抗氧化效果2.2.3　助乳化剂的确定以GTCC ∶IPM = 2∶1（V /V ）为油相，Tween 80为乳化剂，质量浓度1%的烟酰胺水溶液为水相，K m = 1∶1，以不同比例乙醇和丙二醇作为助乳化剂绘制的伪三元相图（图3）.由图3可见，以乙醇、乙醇/丙二醇混合溶剂（7∶3）和丙二醇为助乳化剂时，形成的纳米乳区较大. 结合光甘草定在不同的助乳化剂中的溶解度，其在无水乙醇中的溶解度最大，因此确定以无水乙醇作为助乳化剂.2.2.4　K m 的确定以GTCC ∶IPM = 2∶1（V /V ）为油相，Tween 80为乳化剂，以乙醇作为助乳化剂，质量浓度1%的烟酰胺水溶液为水相，以不同K m 值绘制的伪三元相图（图4）.由图4可见，K m =1∶1和K m =4∶1时形成的纳米乳区较大，此外，乙醇具有刺激性气味，在化妆品中应尽量减少其添加量. 综合考虑，确定K m = 4∶1.2.3　纳米乳配方优化2.3.1　BBD -RSM 试验根据BBD -RSM 对G -N -NE 处方进行优化试验设计结果见表3. 以Design -expert 软件对各因素进行多元线性回归和二项式方程拟合. 通过比较三组数学模型的相关系数和P 值，粒径（Y 1）和PDI （Y 2）的二次多项式模型拟合效果较好，且3个因素对粒径均有显著影响（P < 0.5），混合乳化剂浓度和烟酰胺水图3 不同助乳化剂对伪三元相图的影响Fig.3　Effects of different co -emulsifier on pseudo -ternary phase diagrams图1 不同油相对伪三元相图的影响Fig.1　Effects of different oils on pseudo -ternary phase diagrams图2 不同表面活性剂对伪三元相图的影响Fig.2　Effects of different surfactant on pseudo -ternary phase diagrams623第 42 卷中南民族大学学报（自然科学版）溶液浓度对PDI 有显著影响（P < 0.005）（表4）.最终拟合方程为：Y 1=80295.65-1134.19X 1-1031.89X 2+1.22×105-6.16X 1X 2+7.87X 1X 3-598.85X 2X 3+10.13X 12+9.84X 22+3.71×105X 32；Y 2=10.93-0.20X 1-0.11X 2+7.76X 3+1.18×10-3X 1X 2-0.02X 1X 3-0.07X 2X 3+7.99×10-4X 12+2.28×10-4X 22-6.85X 32.根据二次多项回归方程，绘制处方三维曲面图（图5）.由图5可知，混合乳化剂浓度增加，粒径先减小后增大，而PDI 不断增大；烟酰胺水溶液浓度增加，粒径先减小后缓慢增大，而PDI 不断增大；药物质量分数增加，粒径先增大后减小，而PDI 逐渐减小.最终，软件的处方优化的结果为：油相为GTCC3.97%和IPM 1.99%、乳化剂（Tween 80）18.54%、助乳化剂（无水乙醇）4.64%、烟酰胺0.10%、光甘草定0.10%和水.2.3.2　模型验证按最优处方制备三批G -N -NE ，测定其粒径大小及PDI ，并进行模型验证. 得X 1=79.55%，X 2=70.86%，X 3=0.10%，Y 1预测值为89.75 nm ，Y 2预测值为0.259，经验证，Y 1实测值为88.41 nm ，Y 2实测值为0.253，响应变量的预测值与实测值相对误差<5%，说明选择的拟合模型预测性良好.2.4　纳米乳性质检测按最优处方制备三批G -N -NE ，分别编号为1、2、3. 测定其粒径、PDI 、Zeta 电位、包封率和载药量，测定结果见表5. 《中国药典》（2020年版）四部通则9014微粒制剂指导原则中指出，纳米乳的粒径应在50～100 nm 范围内，包封率一般不得低于80%. 由表5可知，实验所得的三批G -N -NE 均符合要求.2.5　初步评价纳米乳抗氧化效果G -N -NE 在不同质量浓度下清除DPPH ·自由基的结果见图6. 在一定的浓度范围内，烟酰胺-光甘草定水溶液（N -G -aq ）以及光甘草定纳米乳液（G -NE ）在同一浓度条件下对DPPH ·自由基的清除率明显低于G -N -NE ，随着G -N -NE 质量浓度的提高，DPPH ·自由基清除率逐渐提高，当G -N -NE 达到0.6 mg ·mL -1，清除能力趋于饱和，对DPPH ·自由基的清除能力达到92.48%. 因此可知纳米乳制剂能有效提高药物的抗氧化自由基效果，这与贾越光等［16］的研究结果一致，可能是由于纳米乳粒径小，能够更加高效地和自由基发生反应从而达到更高的消除效果.3　结语采用伪三元相图法联合Box -Behnken 响应面设计法筛选的最佳配方所制备的G -N -NE 粒径小、包封率高，具有良好的稳定性. DPPH 自由基清除结果表4　响应模型汇总统计分析Tab.4　Summary and statistical analysis of response models Model Linear 2FQuadratic Y 1（粒径）r 20.60350.63580.9506Adjusted r 20.51200.41720.8872P0.00600.06570.0009Y 2（PDI ）r 20.49600.86470.9651Adjusted r 20.37970.78350.9203P 0.02650.00070.0003图4 不同K m 对伪三元相图的影响Fig.4　Effects of different K m on pseudo -ternary phase diagrams表3　Box -behnken 设计安排和结果（n =3）Tab.3　Box -behnken design arrangements and results （n =3）序号1234567891011121314151617X 100010111-1000-10-10-1X 21-100-10-11-110000100X 3-1-10-1110001001000-1Y 1/nm 63.755215.00261.40244.577677.67302.1312760.0081.417877.00131.03265.20260.53444.63262.22129.77259.40402.80Y 20.5660.1840.2630.4300.2390.4050.0941.0000.3310.3440.2550.2600.2380.2590.2960.2580.214624第 5 期鲁妍，等：光甘草定-烟酰胺纳米乳的制备与抗氧化效果表明，G -N -NE 相较于水溶液和G -NE ，能显著提高自由基清除率，因而G -N -NE 能达到更好的抗氧化效果，该结果为光甘草定和烟酰胺在美白抗氧化化妆品的开发利用上提供了参考价值.参考文献［1］木合布力·阿布力孜，热娜·卡斯木，马淑燕，等. 甘草中光甘草定的提取和抗氧化活性研究［J ］. 天然产物研究与开发， 2007， 19（4）： 675-677.［2］ EPHREM E ， ELAISSARI H ， GREIGE -GERGES H ， et al.Improvement of skin whitening agents efficiency through encapsulation ： Current state of knowledge ［J ］. Int J Pharm ， 2017， 526（1/2）： 50-68.［3］冯倩茹，叶柳青，刘园园，等. 光甘草定平衡溶解度和油水分配系数的测定［J ］. 天津中医药大学学报， 2017， 36（1）： 54-56.［4］阳天舒，韩晓乐，孙嘉彬，等.光甘草定醇质体制备及其生物活性评价［J ］. 中草药， 2020， 51（18）： 4646-4653.［5］ WANG Y ， JIN Z ， YAN Z ， et al. Characterization ofglabridin/hydroxypropyl -β-cyclodextrin inclusion complex with robust solubility and enhanced bioactivity ［J ］. Carbohydr Polym ， 2017， 159（1）： 152-160.［6］姚云霞，李云，李媛，等. 纳米乳在药剂学中的研究及表5　纳米乳性质Tab.5　Nanoemulsion properties编号粒径PDIZeta 电位EE/%DL/%烟酰胺光甘草定烟酰胺光甘草定188.190.255-7.7693.0597.005.436.82288.560.245-7.6992.7796.965.386.76388.470.258-7.9393.2297.085.456.88Mean 88.410.253-7.7993.0197.015.426.82SD0.190.010.120.230.060.040.06图5 各响应变量对自变量的三维效应面图Fig.5　Three -dimensional effect surface diagram of each response variable to independent variable 图6 G -N -NE 对DPPH ·自由基清除率曲线Fig.6　Scavenging curve of G -N -NE on DPPH · radical625第 42 卷中南民族大学学报（自然科学版）应用进展［J］. 军事医学， 2021， 45（6）： 473-478.［7］周莉，赵乃玉，何元鹏，等. 响应曲面优化昆仑雪菊多酚提取工艺研究［J］.中南民族大学学报（自然科学版）， 2021， 40（2）： 165-170.［8］刘欣，周宋汇，孙科. 达托霉素发酵工艺条件响应面优化研究［J］.中南民族大学学报（自然科学版）， 2019，38（1）： 76-80.［9］王瑞雪，赵珍，钟雁，等. 几种常用美白剂协同作用研究［J］. 日用化学工业， 2014， 44（10）： 572-576.［10］周佳，孙燕燕，温美强，等. 布洛芬口服纳米乳的制备及处方优化研究［J］. 沈阳药科大学学报， 2020， 37（10）： 865-871.［11］苏润萍. 光甘草定带正电荷纳米乳的研制［D］. 长春：吉林大学， 2018.［12］GB/T 29664-2013，化妆品中维生素B3（烟酸，烟酰胺）的测定高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法［S］.2013.［13］黄荣，伍晴，傅小红. 红酒多酚稳定性研究及美白功效评价［J］. 化学研究与应用， 2018， 30（11）： 1786-1791.［14］KLANG V，MATSKO N，ZIMMEMANN A，et al.Enhancement of stability and skin permeation by sucrosestearate and cyclodextrins in progesterone nanoemulsions［J］. Int J Pharm， 2010， 393（1/2）： 153-161.［15］李月，张路梅，段金连，等. 注射用聚山梨酯80的杂质、安全性问题与可能的出路［J］. 云南中医学院学报， 2018， 41（4）： 93-97.［16］贾越光，丁志英，肖嘉婧，等. 人参皂苷纳米乳的美白抗衰作用及其安全性评价［J］. 中国生化药物杂志，2015， 35（9）： 19-22.（责编&校对　姚春娜）626。

棉签二次转移法有效提取现场手套印脱落细胞DNA

棉签二次转移法有效提取现场手套印脱落细胞DNA
袁则平
【期刊名称】《刑事技术》
【年(卷),期】2013(000)005
【摘要】1案例资料案例1 某年1月，某市连续发生夜盗农宅案件10余起，价值5万余元。

犯罪嫌疑人通过撬扳窗栅爬窗的手段进人室内盗窃，经对现场提取鞋印分析和串并，为两人所为。

犯罪嫌疑人在现场接触部位均发现明显的手套印。

对其中一起案件进出口一楼窗户窗框上和进入口一楼厨房灶台上的手套印分别进行了棉签转移提取，送DNA室检验，成功检出两个不同高纯度的DNA分型，经数据库比对比中两名贵州籍有盗窃前科的犯罪嫌疑人迟某和周某，成功破获了该串系列案件。

【总页数】2页(P50-51)
【作者】袁则平
【作者单位】浙江省杭州市公安局西湖区分局刑事科学技术室,310023
【正文语种】中文
【中图分类】DF795.2
【相关文献】
1.Amicon® Ultra-0.5超滤离心管在脱落细胞DNA提取中的应用
2.接触性检材502胶熏显后手印脱落细胞的DNA提取
3.手套印痕成功提取DNA破案1例
4.脱
落细胞粘取器在现场勘查中提取接触类DNA的应用5.茚二酮显现汗潜指纹后对脱落细胞DNA提取的影响
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超滤管使用指南

中文引言Amicon® Ultra-15离心过滤器具有快速超过滤功能，能够达到较高的浓缩系数，易于从稀释液和复杂的样本组合进行浓缩液回收。

其竖式设计以及可用的滤膜表面积能提供快速的样本处理和较高的样本回收率（通常大于90%稀薄的初始溶液），并能进行80倍浓缩。

典型的处理时间为15至60分钟，这取决于标称分子量限值（NMWL ）。

竖式设计将溶质极化和之后造成的滤膜结垢降至最低，过滤装置中的物理止滤点防止过滤器旋转过度使样本干燥和造成样本损失。

浓缩液用移液管从过滤器的样本槽中收集，而超过滤滤出液则收集到所提供的离心管中。

该装置可在摆桶或定角转子中旋转。

Amicon® Ultra-15装置未经消毒，只供一次使用。

Amicon® Ultra-15产品系列有5种不同的截留分子量（标称分子量限值，NMWL ，或截留分子量，MWCO ）：●Amicon® Ultra 3K 装置 — 3,000 NMWL ●Amicon® Ultra 10K 装置 — 10,000 NMWL ●Amicon® Ultra 30K 装置 — 30,000 NMWL ●Amicon® Ultra 50K 装置 — 50,000 NMWL ●Amicon® Ultra 100K 装置 — 100,000 NMWLAmicon® Ultra-15 10K 过滤器用于体外诊断，可用来在分析之前浓缩血清、尿液、脑脊髓液和其他体液。

Amicon® Ultra-15 3K, 30K, 50K 和100K 过滤器仅用于研究，不用于诊断程序。

用户指南Amicon ® Ultra-15离心过滤器用于体积不超过15 mL 的样本Amicon® Ultra-15 10K 装置，供体外诊断用Amicon® Ultra-15 3K, 30K, 50K 和100K 装置仅用于研究，不用于诊断程序。

UHPLC法结合超滤法测定连钱草中3种成分的血浆蛋白结合率

UHPLC法结合超滤法测定连钱草中3种成分的血浆蛋白结合率作者：陈伟康刘德鸿熊明朋袁惠周国平来源：《中国药房》2021年第22期中图分类号 R969.1;R927.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）22-2720-04DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.06摘要目的：建立测定连钱草中迷迭香酸、咖啡酸、绿原酸血浆蛋白结合率的方法。

方法：采用超高效液相色谱法结合超滤法测定连钱草中迷迭香酸、咖啡酸、绿原酸在新西兰兔体内的血浆蛋白结合率。

以Phenomenex Luna® C18为色谱柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱，流速为0.5 mL/min，柱温为45 ℃，检测波长为327 nm，进样量为3 μL。

结果：在低、中、高质量浓度下，迷迭香酸的血浆蛋白结合率分别为（97.78±1.67）%、（94.32±1.42）%、（95.12±1.51）%（n=3），咖啡酸的血浆蛋白结合率分别为（90.12±2.33）%、（89.53±1.98）%、（90.23±1.56）%（n=3），绿原酸的血浆蛋白结合率分别为（63.23±2.12）%、（67.87±1.06）%、（62.34±1.34）%（n=3）。

结论：所建方法操作简单、分析时间较短，可用于测定连钱草中迷迭香酸、咖啡酸、绿原酸的血浆蛋白结合率。

关键词连钱草;迷迭香酸;咖啡酸;绿原酸;血浆蛋白结合率;超高效液相色谱;超滤法;兔Determination of Plasma Protein Binding Rate of 3 Components from Glechoma longituba by UHPLC Combined with UltrafiltrationCHEN Weikang，LIU Dehong，XIONG Mingpeng，YUAN Hui，ZHOU Guoping（Jiangxi Institute for Drug Control/NMPA Key Laboratory of Quality Evaluation of Chinese Patent Medicine/Jiangxi Province Engineering Research Center of Drug and Medical Device Quality，Nanchang 330029， China）ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of plasma protein binding rate of rosmarinic acid， caffeic acid and chlorogenic acid from Glechoma longituba. METHODS： UHPLC method combined with ultrafiltration method was adopted to determine the plasma protein binding rate of rosmarinic acid， caffeic acid and chlorogenic acid from G. longituba in the plasma of New Zealand rabbits. The determination was performed on a Phenomenex Luna®C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile （A）-0.1% formic acid solution （B）（gradient elution） at the flow rate of 0.5 mL/min. The column temperature was set at 45 ℃， and the detection wavelength was 327 nm. The sample size was 3 μL. RESULTS： At low， medium and high concentrations， the plasma binding rates of rosmarinic acid were （97.78±1.67）%，（94.32±1.42）%，（95.12±1.51）%， respectively （n=3）; those of caffeic acid were（90.12±2.33） %，（89.53±1.98）%，（90.23±1.56）%， respectively （n=3）; those of chlorogenic acid were （63.23±2.12）%，（67.87±1.06）%，（62.34±1.34）%， respectively （n=3）. CONCLUSIONS： Established method is easy to operate and shorter time for analysis. It can be used to determine the plasma protein binding rate of rosmarinic acid， caffeic acid and chlorogenic acid in G. longituba.KEYWORDS Glechoma longituba; Chlorogenic acid; Caffeic acid; Rosmarinic acid; Plasma protein binding rate; UHPLC; Ultrafitration; Rabbit連钱草又名活血丹、钹儿草、佛耳草，为唇形科植物活血丹Glechoma longituba（Nakai）Kupr.的干燥地上部分[1]。

Amicon Ultra 超滤离心管说明书

本说明仅供参考超滤离心管蛋白浓缩和换Buffer 通常会使用到超滤管，有多种不同MWCO 和处理量的型号可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。

超滤离心管具有快速超滤功能，能够达到较高的浓缩系数，易于从稀释液和复杂的样本组合中进行浓缩回收。

其竖式设计以及可用的滤膜表面积能提供快速的样本处理和较高的样本回收率（通常大于90%的初始溶液），并能进行多倍浓缩。

竖式设计将溶质极化之后造成的滤膜结垢降至最低，过滤装置中的物理止滤点防止过滤器旋转过度使样本干燥和造成样本的损失。

浓缩液用移液管从过滤器的样本槽中收集，而超滤出液则收集到所提供的离心管中。

该装置可在离心机中进行。

装置未经消毒，只供一次使用（但是国内众多科研院所及科研单位的老师，都在重复使用，毕竟使用一次就扔掉太浪费。

）超滤离心管储存在15-30°C 下，保质期自生产之日起3年。

整套装置包括一个盖子、一个过滤器和一个离心管，如右图所示：一、使用方法：1预清洗：超滤离心管的过滤薄膜含有微量甘油。

如果此材料干扰分析，可用缓冲液或超纯水预清洗。

如果干扰仍然存在，用0.1M NaOH 清洗，然后用缓冲液或超纯水再次清洗后甩干。

注意：Amicon®Ultra 超滤离心管中的滤膜一旦润湿后应避免重新干燥。

若在预清洗后没有立即使用该装置，则应保持滤膜湿润，直到使用该装置为止。

瑞达恒辉恒辉恒辉瑞达恒辉瑞达瑞达恒辉2.向超滤离心管加入不超过处理量的样品。

3.将盖好盖子的超滤离心管放入离心转子中。

4.适当转速离心。

（关于旋转时间，请参见图1和图2以及表1和表2）5.如要回收浓缩后的样品，在超滤离心管底部插入一个移液管，然后左右摇摆着吸取样本，以确保完全回收。

超滤液可以保存在离心管中。

二、除盐或渗滤举例：除盐、更换缓冲液或渗滤是去除含有生物分子的溶液中的盐分或溶剂的重要方法。

可以在超滤离心管中，通过浓缩样本、然后向浓缩液加入任何所需溶剂复原至样本原始体积的方式，去除盐分或更换缓冲液。

默克密理博Microcon横膜超滤管

经典回归
Microcon® 超滤管
值得信赖的ＤＮＡ／蛋白样品制备的经典工具
Microcon® 为横膜式超滤管，没有死体积，用于大分子样品的浓缩、除盐、换液都非常高效方便；实际应用中还常用于大分子与其它分子的分离，比如蛋白酶切后的处理及药物结合率分析等等。这种小管可在几乎所有1.5mL离心机中使用。 Ultracel® 超低结合膜对于蛋白及其它成分都表现出极低的非特异性结合，连同医药级O型圈封闭设计，确保更少的样品丢失，更稳定的数据结果，使 Microcon® 成为最好的样品制备工具。
更小截留分子量产品请垂询
包装 100 100 100
目录号 MRCPRT010 MRCF0R030 MRCF0R100
最便捷的蛋白制备工具：
• 行业金标：Amicon® Ultra超滤管 • 一体化纯化超滤新工具：Amicon® Pro • 温和透析、复性：D-tubeTM 透析管 • 不同操作通量、体积样品处理的灵活选择
• 即使是稀释溶液，样品回收率也大于95% • 反转离心设计，方便在浓缩产物体积极小时提高回收率 • 便于在标准的微管中存放浓缩样品和滤过样品 • 浓缩倍数达到100X
Microcon® DNA Fast Flow 超滤管专门设计用于从含有SDS的溶液中浓缩和回收基因组DNA。反转回收使样品量极小时可保证DNA理想的得率，浓缩倍数可以达到20X。
广州
广州市黄埔大道西638号富力科讯大厦803A室邮编：510627 电话：020-37883048 传真：020-37883072
资料编号：BI2013002 PSP/V01 亚太区技术服务中心：asiatechserv@
成都
成都市芷泉街229号东方广场C座11楼7号邮编：610060 电话：028-85288550 传真：028-85288553

蛋白质浓缩问题——超滤浓缩管的使用及保存

二、离心超滤管浓缩样品2.1 浓缩样品1、要浓缩的样品含盐量必须0.3M以上，含盐量低的样品须补加到0.3MNaCl。

2、在内管（附有3KD膜）中加入500µl样品，将内管套入外管。

3、对称放置离心管，14520rpm(即14000g)离心。

（离心5min约浓缩2倍，10min约4倍，15min约6倍，20min约8倍，30min约10倍）。

4、离心结束后，将内管倒置套在另一个干净的离心管呢，3880rpm离心min收集浓缩后的样品。

或者用移液器直接吸出内管中的样品。

2.2 浓缩管使用后的处理和保存1、使用完的浓缩管，立即加入500µl含1MNaCl的缓冲液（此缓冲液与浓缩样品的缓冲液一致），8000rpm离心20min。

2、甩净内管中的盐溶液，将内管放入超纯水中浸泡1h。

3、内管加入超纯水500µl，8000rpm离心5min。

4、甩净内管中的水，加入500µl0.2MNaOH，8000rpm离心20min。

5、甩净内管中的NaOH溶液，用超纯水再8000rpm离心5min。

6、甩净内管中的水，放入含0.2-0.5‰NaN3的生理盐水中。

7、外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

超滤管使用注意事项2012-06-06 18:12:28| 分类：默认分类| 标签：|字号大中小订阅蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。

也有其它型号的、不同体积大小和MWCO超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。

可重复使用，使用一次就扔掉太浪费。

以下是个人总结的使用方法和注意事项。

1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，最常见的是Ultra-15（10kD）。

到底选择多大截留分子量比较合适呢？10kDa、5kDa、还是30kDa？通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。

Millipore 超滤管 0.5ml 中文说明书

Amicon® Ultra-0.5产品系列包括5种不同的截留分子量（即标称分子量限值，NMWL）。这些超滤管仅供研究使用，不适用于诊断程序。
• Amicon® Ultra 3K 超滤管 — 3,000 NMWL • Amicon® Ultra 10K 超滤管 — 10,000 NMWL • Amicon® Ultra 30K 超滤管 — 30,000 NMWL • Amicon® Ultra 50K 超滤管 — 50,000 NMWL • Amicon® Ultra 100K 超滤管 — 100,000 NMWL
用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
如何使用Amicon® Ultra-0.5超滤离心管
1. 将Amicon® Ultra-0.5超滤内管插入所提供的一个微量离心管中。 2. 向Amicon® Ultra内管中加入不超过500 μL的样本，并盖上盖子。 3. 将盖好盖子的超滤管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的超滤管平衡。 4. 以14,000 x g离心约10-30分钟，具体时间取决于所使用超滤管的NMWL。为了确定合适的离心时
≥ 90 ≥ 90 ≥ 95
PCR引物去除率（%）
≥ 90 ≥ 85 ≥ 75
≥ 90 ≥ 90 ≥ 80
≥ 90 ≥ 90 ≥ 90
≥ 90 ≥ 95 ≥ 95
TE洗涤（次数）
0 1 2
0 1 2
0 1 2
0 1 2
离心条件：40º固定角度转子，14,000 x g，室温，100 μL PCR样品和400μL TE缓冲液合计起始体积500 μL，20-30 μL终体积，10分钟离心，n = 12。
2
74
7
42
12

15ml超滤离心管使用说明书

Millipore, Amicon, Centricon, Milli-Q, MultiScreen, and Ultracel are registered trademarks of Millipore Corporation. The M mark is a trademark of Millipore Corporation. Alconox and Terg-A-Zyme are registered trademarks of Alconox, Inc. Lubrol is a registered trademark of Imperial Chemical Industries PLC. Nonidet is a trademark of Royal Dutch/Shell Group. Triton is a registered trademark of Union Carbide Corporation. Tween is a registered trademark of ICI Americas, Inc.
Notice
The information in this document is subject to change without notice and should not be construed as a commitment by Millipore Corporation or an affiliated corporation. Neither Millipore Corporation nor any of its affiliated corporations assumes responsibility for any errors that may appear in this document. This manual is believed to be complete and accurate at the time of publication. In no event shall Millipore Corporation be liable for incidental or consequential damages in connection with or arising from the use of this manual. © 2009 MILLIPORE CORPORATION. ALL RIGHTS RESERVED. PR02842 Rev. B, 10/09

超滤离心管的使用

•Used for Protein Purification and Concentration•Pack of 96 filter units and corresponding 2 mL centrifuge tubes•Filter holds 0.5 mL volume (we work with such small volumes the 2, 4, and 15 mL versions are excessive, thought could be used to wash faster/ more thoroughly if you so choose) •Filter has a 100 kDa NMWL membrane (MW cut-off of 100 kDa)Rough Protocol for Buffer Exchange:1.Assemble filter column as shown in the manufacturer's manual/protocol (see User Guide).装配离心管（两个管套在一起，外管是普通离心管，内管为过滤管）2.Add volume (~5-20 uL depending on number of samples being prepared for TEM) ofconcentrated ferritin in TBS to filter unit.取5-20 μL（根据TEM样品量选择具体的量）分散铁蛋白的TBS溶液，加入内管（过滤管）3.Fill remaining filter volume (to 500 uL) with DI/ultra-purified water.加入500 μL超纯水。

4.Spin at 14,000 x g for 10-15 minutes. 内管（过滤管）套在外管内，装入离心机，14000 x g离心力下离心10-15分钟。

Exosomes分离方法

人们往往以为，血液、尿液、乳汁和脑脊液这些体液系统是均匀的，不过事情并非这么简单。

蛋白和核酸的确能够在这些体液系统中自由流动。

但也有一些生物分子被包裹在脂质囊泡中，这些囊泡被称为胞外体（Exosome）。

近年来研究者们渐渐发现，这些胞外体中含有大量可以成为生物学指标的分子。

研究者们已经在相应数据库中录入了胞外体的许多分子成分，包括脂质、蛋白和核酸。

比较常用的两个网站是Vesiclepedia和ExoCarta，这两个网站都是澳大利亚La Trobe大学的Suresh Mathivanan开发的。

外泌小体（Exosome）是一种囊泡结构，直径通常在30-150nm，常见于正常体液和病理样本，培养细胞也可分泌。

研究人员已经在血液、唾液、尿液、母乳等中发现外泌小体，其运载的蛋白和核酸涉及其细胞间物资、信息交流，影响和调控着多方面的生理功能，包括肿瘤发生、免疫促进、凋亡调控、血管生成、炎症反应及发育和分化等。

由于在体液中出现，外泌小体对于临床生物标志物检测特别有利。

近年来随着分离纯化技术的提高，关于外泌小体的研究成果颇丰，主要集中于其在细胞间物资交流、通讯方面作用，远期则预计有临床应用的潜力。

因此这一领域已渐成热点。

研究的前提是方便、高效、标准化地分离纯化外泌小体。

这一点上默克密理博已经建立了操作标准（研究通讯备索），相较于需要昂贵的设备及繁琐操作的超速密度梯度离心，用这样的简单流程操作，研究人员对外泌小体的探讨变得简便多了。

超滤方法纯化：简单6步，exosome制备不再成为你的拦路虎∙用Sterifip®真空抽滤对样品进行澄清[目录号SCGP00525; 0.22µm MilliporeExpress PLUS (PES)膜]∙用PBS平衡Amicon® Ultra-15超滤管(目录号UFC901024，10 kDaMWCO)，离心4000g X 10 min。

∙从超滤管内管及收集管吸走PBS。

默克密理博的Amicon离心超滤

默克密理博的Amicon离心超滤装置是一种理想的工具，可以用来对盐分、糖类、核酸、非水溶剂及其他一些低分子量物质进行去除和更换。

他们还可以用来分离未结合上的游离标记物。

密理博离心超滤装置具有快速、方便、回收率高的特点，可替代并优于透析及乙醇沉淀。

Amicon Ultra-4和Amicon Ultra-15具有高速度高回收的特点。

他们使用低吸附性的Ultracel再生纤维素超滤膜，可用于蛋白质、抗原、抗体、酶和微生物的浓缩纯化。

其快速和高回收的特点非常适合于脱盐和缓冲液置换。

Amicon Ultra离心超滤装置经常用于对蛋白质色谱纯化过程产生的色谱柱组分进行浓缩和脱盐。

以下两个例子展示了Amicon Ultra离心超滤装置对于蛋白质和活性酶回收的应用。

方法1.选择具有合适NMWL和体积的离心超滤装置；2.把样品置于过滤装置的储液管中；3.如果样品体积小于过滤装置的最大体积，则可以把它稀释到最大体积后再离心，这有助于更有效地除去盐分；4.在特定的离心力下和推荐的时间进行离心；5.将滤过液从滤管中取出，放置一旁；6.加入水或缓冲液使样品体积达到4ml(Amicon Ultra-4)或15ml(Amicon Ultra-15);7.再次离心；8.取出滤过液，放置一旁；9.回收浓缩的已脱盐样品。

注意：请将两次的滤过液一直保留到浓缩的样品分析测试完成。

结果：盐分通过滤膜的过程不依赖样品的浓度和体积，用超滤的方法来脱盐并不改变缓冲液的组成，比如说，含有500mM盐分的溶液在初次离心后它的盐浓度并不发生改变。

再往超滤管中剩余溶液中加入水或无盐缓冲液，再次离心，则会降低溶液中的盐浓度。

这个过程我们将它称为等体积超滤，反复多次地操作，可以使溶液盐分降到最低。

如果我们想将样品用不同打分缓冲液溶解，则我们可以使用等体积超滤达到目的。

样品浓缩后，然后加入目的缓冲液，再进行反复得稀释和浓缩。

如表3.1-3.4中所示，使用默克密理博的离心超滤装置，只需一次过滤，样品中90%以上的盐分都被去除。

细菌纤维素产生菌双向凝胶电泳分析技术

细菌纤维素产生菌双向凝胶电泳分析技术杨暄;李俊;李从发;郝俊冉;许文涛;刘四新【摘要】对细菌纤维素产生菌株——葡糖酸醋杆菌菌体蛋白的提取过程、等电点的分布及纯化方法等方面进行了探索和优化.结果表明:葡糖酸醋杆菌蛋白主要分布在pI 4 ～7的范围内；采用超滤浓缩后进行2DClean-up试剂盒纯化,可以获得更优的蛋白分离效果；在考马斯亮蓝G250染色条件下,有效分离出(1037±65)个蛋白点；建立了高质量葡糖酸醋杆菌蛋白的双向凝胶电泳分析技术.【期刊名称】《热带生物学报》【年(卷),期】2014(005)001【总页数】6页(P73-77,91)【关键词】细菌纤维素;欧罗巴葡糖酸醋杆菌;双向电泳;蛋白质组学【作者】杨暄;李俊;李从发;郝俊冉;许文涛;刘四新【作者单位】海南大学食品学院,海南海口570228;海南大学食品学院,海南海口570228;海南大学食品学院,海南海口570228;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083;海南大学食品学院,海南海口570228【正文语种】中文【中图分类】Q815葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)是一类可以在细胞外合成高纯度细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)的微生物，其中较常见的菌种包括G.xylinus，G.europaeus，G.intermedius，G.oboediens及G.entanii［1－4］等。

菌体在液体培养时，体内合成纤维素后，纤维素就从细胞壁的微孔道中分泌出来，在菌体外相互缠绕结成一层致密的网状纤维素薄膜［5］，此时，菌体被包裹于该纤维素膜中。

静态培养条件下产生的细菌纤维素具有许多优良特性，被认为是世界上性能最好的纤维素［6－7］，自1976年被工业化应用至今，细菌纤维素在组织工程学、纳米生物材料、食品工业等领域均取得了长足发展并收获了良好的效益［8－11］。

Amicon

Amicon® Ultra-0.5超滤离心管在脱落细胞DNA提取中的应用马庆;童梦洁;夏冬景【期刊名称】《法医学杂志》【年(卷),期】2018(034)002【总页数】2页(P189-190)【关键词】法医遗传学;提取法;脱落细胞;Amicon®Ultra-0.5超滤离心管【作者】马庆;童梦洁;夏冬景【作者单位】合肥市公安局刑事科学技术研究所,安徽合肥 230001;合肥市公安局刑事科学技术研究所,安徽合肥 230001;合肥市公安局刑事科学技术研究所,安徽合肥 230001【正文语种】中文【中图分类】DF795.2在法医物证检验中，提取产物的DNA浓度是决定该检材能否被检出和发挥作用的关键因素。

当浓度较低达不到检测阈值时，常需要对提取产物进行浓缩，常用的浓缩设备为Microcon-100超滤管，但该设备仅被用于联合有机法[1-2]及Chelex法[3]来浓缩提取产物。

目前，微量DNA的检验经常采用纯化试剂盒在自动化提取设备上进行提取，其高纯度的提取产物和极小的终体积（20～50μL）使后续的浓缩步骤失去意义。

在此情况下，为提高检出率，检验人员通常会增加检材使用量，但由于消化体系也随之增大，其终浓度提高效果有限，同时受体积限制，难以自动化，通常需要用硅珠或磁珠反复收集，操作过程繁琐。

有研究[4]表明，用目前较常见的DNA IQ磁珠（美国Promega公司）对目标样本进行吸附和洗脱时，会产生20%左右的损失，而反复收集会明显加大这一损失。

本研究拟运用Amicon®Ultra-0.5超滤离心管，以纤维类检材为对象，通过比较常规直接消化提取（以下简称“常规法”）和加大检材量消化后浓缩提取（以下简称“浓缩法”）两种方法，验证该设备用于脱落细胞等微量检材DNA提取的可行性。

1 材料与方法1.1 样本收集10名志愿者使用过的纱线手套，平均佩戴时间为 5h，共 20只，编号为 1～20。

密理博超滤管

用户指南
Amicon® Ultra-4 10K 离心过滤器
用于体积不超过4 mL的样本 UFC801008 UFC801024 UFC801096
C 用于体外诊断
中文
引言
Amicon® Ultra-4 10K离心过滤器具有快速超过滤功能，能够达到较高的浓缩系数，易于从稀释液和复杂的样本组合进行浓缩液回收。其竖式设计以及可用的滤膜表面积能提供快速的样本处理和较高的样本回收率（通常大于90%稀薄的初始溶液），并能进行80倍浓缩。典型的处理时间为10至20分钟。竖式设计将溶质极化和之后造成的滤膜结垢降至最低，过滤装置中的物理止滤点防止过滤器旋转过度使样本干燥和造成样本损失。浓缩液用移液管从过滤器的样本槽中收集，而超过滤滤出液则收集到所提供的离心管中。该装置可在摆桶（可提供最佳性能）或定角转子中旋转。 Amicon® Ultra-4 10K装置未经消毒，只供一次使用。
长度： 124 mm
直径： 17.3 mm
过滤器
长度： 73.4 mm
直径： 17.2 mm
装置材料
过滤器
苯乙烯共聚物/丁二烯
滤膜
Ultracel®低粘合性再生纤维素膜
滤出液管
聚丙烯
滤出液盖子和衬里
聚乙烯
ห้องสมุดไป่ตู้
Amicon® Ultra-4 10K离心过滤器
7
化学相容性
Amicon® Ultra超离心装置适用于生物液体及水溶液。使用前，请检查样本与装置的化学相容性。
表3. 典型的浓缩液回收率
分子量标准/ 浓度
细胞色素 c (0.25 mg/mL)
装置 MWCO
10K
旋转时间（分钟）
15

amicon分子量

amicon分子量
Amicon超滤管是一种用于分离不同分子量的物质的设备。

它由一个中空纤维膜组成，膜的孔径决定了可以通过膜的物质的分子量。

Amicon超滤管的截留分子量（MWCO）是指可以通过膜的90%的物质的分子量。

Amicon 超滤管的截留分子量范围从1000道尔顿到1000万道尔顿。

以下是Amicon超滤管的一些常见截留分子量：
1.1000道尔顿：可通过膜的物质包括小分子、肽、寡糖等。

2.3000道尔顿：可通过膜的物质包括蛋白质、多糖等。

3.10000道尔顿：可通过膜的物质包括核酸、脂类等。

4.100000道尔顿：可通过膜的物质包括细胞、细胞器等。

在选择Amicon超滤管时，需要根据样品的具体情况来选择合适的截留分子量。

如果样品中含有多个分子量不同的物质，可以使用多种截留分子量的Amicon超滤管进行分离。

生物素标记蛋白操作方法

抗体生物素标记操作方法一般每个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。

一、试剂和器材：1、标记反应溶液：0.1M pH 7.2 PBS（0.15M sodium chloride）NaCl 8.77 g ；Na2HPO4·12H2O 32.3g ；NaH2PO4·2H2O 4.5g；加双蒸水 900mL左右，用HCl/NaOH 调pH至 7.2，最后定容为 1000mL2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin配方：称取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量为587），溶解于95 µl 超纯水中，临用前配置，不可储存，立刻使用。

NHS-PEG4-Biotin容易潮解，开瓶前平衡至室温。

也可以配置200 nmol/L 储备液：20mg NHS-dPEG4-Biotin溶解于170µl DMSO中，-20℃稳定几个月。

由于NHS-PEG4-Biotin昂贵，而且使用量少，不能保存，配制时，直接将NHS-PEG4-Biotin放入1.5ml EP管中，以实际称量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入超纯水。

3、超滤管⑴、Millipore超滤管[0.5ml 10KD]:截留分子量10KD，残留体积200µl，蛋白回收率95%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心10min。

⑵、Millipore超滤管[0.5ml 50KD]:截留分子量50KD，残留体积80µl，蛋白回收率94%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心5 min。

超滤-HPLC法测定奥沙利铂脂质体的包封率

超滤-HPLC法测定奥沙利铂脂质体的包封率【摘要】目的:测定奥沙利铂脂质体的包封率。

方法:采用超滤法分离脂质体中游离药物；用hplc测定脂质体的包封率。

结果:超滤能较好地把脂质体和游离药物分离，高、中、低浓度平均回收率符合测定要求；在所选色谱条件下，辅料不干扰奥沙利铂的定量测定；本法测定本奥沙利铂脂质体的包封率为92.10%。

结论:该方法方便、快捷，可以用于奥沙利铂脂质体包封率的测定。

奥沙利铂是继顺铂和卡铂后的第三代铂类抗癌药[1]，对结肠癌有明显的作用[2]。

但在抗癌的同时，也会产生不同程度的毒副作用。

把奥沙利铂做成脂质体制剂可以减少其毒副作用。

而包封率是脂质体制剂的一个重要指标，本实验旨在对奥沙利铂脂质体包封率的测定方法进行研究，建立了用超滤-hplc法测定奥沙利铂脂质体包封率的方法，为奥沙利铂脂质体质量评价提供依据。

1仪器与试剂1.1仪器高效液相色谱仪（日本岛津公司lc-10at泵，spd-10a紫外检测器，浙大智达n2000工作站）；765mc紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；re-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ah100d均质机（ats engineering inc）；sartorius bp211d 电子天平（德国赛多利斯公司）；millipore amicon ultra-0.5ml 10k 超滤离心管（millipore，carrigtwohill，co，cork，ireland）；tdl-40b离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2试药奥沙利铂脂质体（自制）；奥沙利铂（珠海远程医药化工有限公司，批号20110501）；triton-x100（amresco，批号20110411）；色谱纯甲醇；其他试剂为分析纯。

2方法与结果2.1包封率测定方法的选择包封率是脂质体处方工艺筛选和质量标准的重要指标。

根据《中国药典》（2010版，附录xixe微囊、微球与脂质体制剂指导原则），包封率计算公式如下：包封率＝■×100％要测定包封率就要把游离药物分离出来，常用的分离游离药物的方法有：凝胶过滤法、透析法、鱼精蛋白沉淀法、超滤法等[3]。