第三章：酶的分离纯化(20200722094641)
第三章酶的分离纯化
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
大
膜孔径
小
灰尘
灰尘 灰尘 细菌 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
细菌
灰尘 病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
病毒
生物大分子 生物小分子 盐类
细菌
膜
病毒
生物大分子
生物小分子 盐类 水
水
微滤（MF）
4、加保护剂：提高酶的稳定性。
第二节 酶的沉淀分离、离心和膜过滤技术
一、沉淀分离法
盐析沉淀法√
有机溶剂沉淀法
等电点沉淀法 聚乙二醇沉淀法 复合物沉淀法
（一）盐析沉淀法
常用中性盐：（NH4）2SO4
优点：①溶解度大，温度系数小； ②价廉易得； ③可保护酶。
在盐浓度达到某一界 限后，酶的溶解度随 盐浓度升高而降低， 这称为盐析现象。
纳滤 （NF） 反渗透 （RO）
10nm~200nm 2nm~10nm <2nm
生物大分子 及以上
生物小分子 及以上
超滤膜 纳滤膜
脱盐、浓缩
盐类及以上
盐、氨基酸、 反渗透膜 糖的浓缩、 淡水制造
三、离心技术在酶分离纯化中的应用
离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不 同大小和不同密度的物质分开的技术。 （一）基本原理 离心力：Fc = mac =mω 2r
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
纳滤（NF） 反渗透滤（RO）
（2-10nm） （＜2nm）
各种膜分离法的原理和应用范围
膜分离法 截留的颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 应用举例 除菌，回收 菌 蛋白质、多 肽和多糖的 回收和浓缩
酶的分离 纯化
（2-4）
若酶的总浓度用[E]t表示，那么 [E]= [E]t－[ES]，代入式（2-4）并整理得
（2-5）
由于酶的反应速度与[ES]成正比，所以
V = k3 [ES] 将（2-5）代入（2-6），得
（2-6）
（2-7）
第一节 酶促反应动力学
当底物浓度很高时，所有酶都与底物结合生成中间产物ES，则[E]t=[ES]。此时 反应速度达到最大Vmax，即
整理上式可得 Km= [S] 由此可以看出，Km的物理意义就是当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的 底物浓度，其单位与物质摩尔浓度单位相同，用mol/L表示。Km数值大小与酶的浓 度无关，是酶反应的特性常数。不同酶的Km值不同，且同一酶在不同的底物下，其 Km值也不同。米氏常数可由实验测得，也可用下面的公式求得：
Vmax= k3 [ES]= k3[E]t
（2-8）
（2-7）除以（2-8），并整理得
（2-9）
这就是米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation），又称为米氏方程，式中的 Km是一常数值，称为米氏常数。在特殊情况下，当v = Vmax时，米氏方程可转化为下 式：
第一节 酶促反应动力学
第三章 酶的分离纯化
酶分离纯化的目的
酶分离纯化的目的是使酶制剂 产品达到应用所需的纯度。
分离纯化过程包括3个基本步骤：
1 抽提 2 纯化 3 制剂
Crude product concentration versus selling price (Dwyer, 1984)
第一节 酶促反应动力学
对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下，反应速度（v）直接 与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下，速度趋向于最大值（Vmax），此时反应速 度与底物浓度[S]无关（如图2-1）。
第三章 酶的分离纯化
• 更多的用于其他沉淀方法的一个
组合条件。如用于除去杂蛋白。
• 如：纯化血清胆碱酯酶时，调pH 到2.8-3.0以除去酸性杂蛋白。
2、蛋白质的盐溶和盐析
采用加入中性盐的方法使蛋白质沉淀的方 法称为盐析法。 实际常用的盐溶液是硫酸铵，硫酸钠，磷酸 钾，硫酸镁，氯化钠，磷酸钠等。 稀盐溶液浓度为0.02－0.5mol/L
3、化学破碎法 4、酶学破碎法
高 压 细 胞 破 碎 机
JY92-II D超声波细胞粉碎机
细 胞 破 碎 珠
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
细胞破碎方法及其原理
机械破碎 通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。 捣碎法 研磨法 匀浆法
物理破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 自溶法 外加酶制剂法
本章 目录
化学破碎
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
1、机械破碎法
（1）有机溶剂处理：常用的有机溶剂有： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等等。有机 溶剂可破坏细胞膜的磷脂结构，从而 改变细胞膜的通透性，再经提取可使 膜结合酶或胞内酶等释和细胞膜中的磷脂及脂蛋
白相互作用，使细胞膜结构破坏， 增加膜的通透性。尤其对膜蛋白 酶的提取特别有效在实验室及生 产中均已应用。
（3）匀浆法：利用匀浆器所产生的剪切 力将组织细胞破碎。匀浆器一般有硬质 磨砂玻璃或硬质塑料或不锈钢等制成， 通常用来破碎那些易于分散、柔软细小
工学酶工程兰州大学酶工程酶分离纯化
（2）溶菌酶和EDTA提取
溶菌酶是用鸡蛋清作原料生产的商品酶，它 专一水解细菌细胞壁粘肽（也叫肽多糖）部分的 β-1,4-糖苷键，细胞壁刚性强的革兰氏阳性细菌 对这种酶的敏感性要比革兰氏阴性细菌高，因为 细胞壁的刚性在很大程度上是来自细胞壁的粘肽。 当细胞壁崩解后，最终使细胞外膜破裂的是提取 液的渗透压。
超声波破碎只适用于小量细胞的破碎。
超声波破碎细胞的原理
超声波作用于液体会产生一种称为空穴作 用的现象，在液体中出现压缩区和稀疏区，稀 疏区中形成的空穴在稀疏区转变成压缩区时， 空穴中产生的气泡被压缩到几千个大气压，紧 接着气泡崩解形成冲击波。通常认为此冲击波 是产生破坏力的主要因素。
超声波细胞破碎仪可调节作用功率和作用 时间。
（2）酸溶液
有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定 性较好，这时可用酸溶液提取。酸浓度也不能 太高，常选用pH3～6的范围。如胰蛋白酶可 以用0.12mol/L的硫酸溶液提取。
（3）碱溶液
有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定 性好，这时可用碱溶液提取。如细菌天冬酰胺 酶可用pH11～12.5的碱溶液提取。
（5）材料的破碎程度
含酶原料破碎后的颗粒越小，扩散面积越大， 有利于酶的提取。
（6）搅拌
适当搅拌可以使提取液中的酶分子迅速离开 原料颗粒的表面，从而增大两相界面的浓度差， 提高提取的效率。
二、分离纯化
1．沉淀法 2．透析与超滤 3．冰冻干燥 4．液—液双水相抽提 5．凝胶层析
6．离子交换层析
7．疏水层析 8．羟基磷灰石层析 9．亲和层析 10．染料配基层析 11．几种新型层析方法 12. 电泳 13．结晶法
（3）液体剪切
液体剪切与固体剪切原理相似。只是菌 体是以悬浮液的形式压过小孔，小孔的孔径 更小，压力为55 MPa、137 MPa、275 MPa等 几种。
第三章 3酶的分离纯化
层析柱
（a）自制简易层祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龙网） （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3．柱床； 4．恒温水进口；5．恒温水出口；6．可调节的塞子）
装 柱/预装柱
离子交换剂预处理及调糊
交换剂：上清（体积比）= 1:1 - 3:1 柱底部死空间空气排除 装柱器或玻棒引流，一次连续加入悬胶液 打开出口阀：层析剂沉降 排除空气 检查均匀度，慎用染料检查离子柱！ 柱平衡（可先高浓度后低浓度）
6、双水相法 四、酶样品透析
不同温度，不同pH
第三节 离子交换色谱（IEC）
一、离子交换剂类型 功能基团：强阳 强阴 弱阳 弱阴 1、离子交换树脂 孔径过小而交换容量小 电荷密度过高，蛋白结合牢固不易洗脱 常用于脱盐，小分子氨基酸和短肽分离 例外：聚丙烯酸树脂适合小分子碱性蛋白
一、离子交换剂类型
C: A流出体积V时盐浓度；c1：起始；c2极限； V0：A和B总体积；B,A：横截面积
B/ A
梯度选择
（1）梯度形状
离子交换，线性梯度，再进一步优化 凸型梯度
利于改善梯度末尾部分分辨率
凹形梯度
利于改善梯度起始阶段分辨率
混合型梯度（计算机） 组分吸附能力相近需要改善分辨率的位点提供足够
分辨率
三、实验方案设计
（一）离子交换剂选择 1、基于基质的选择（3个考虑） 分离的规模和选用的模式 分析性和实验室小规模：常规柱色谱
大规模工业化分离：柱色谱，膨胀床吸附，分批分离
离子交换在整个纯化过程所处的次序及要求的分辨率
预处理和初分级阶段：提取和浓缩
颗粒尺寸大、流速好、成本低介质 细分级和最后精制阶段：除杂 颗粒小、高分辨率介质
酶的分离纯化
酶的分离纯化摘要：本文概述了在实验中由于酶浓度、饱和度等不同条件下对酶进行分离纯化的适用方法。
酶的分离纯化有很多种方法，在纯化的工艺上有很大的不同，不同来源的酶在分离纯化中表现出不同的洗脱特性。
现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。
关键词：酶；分离；纯化；方法前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
酶的纯化过程在目前来说仍是一门实验科学。
一个特定酶的提纯往往需要经过多个实验的探索才能总结出一般经验规律。
酶的分离纯化又与其他蛋白质的纯化过程存在很大的差异，酶的分离纯化有其自己独有的特点：一是特定酶在细胞中的含量少，二是酶通过测定活力的方法可以加以跟踪，前者给实验带来困难，后者为实验提供了捷径。
正文：1. 酶的分离与纯化的概念[1]酶的分离与纯化是指将酶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从而获得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程。
酶分离纯化的一般原则：①防止酶变性失活1．）酶纯化一般在低温条件下进行（0~4℃）2.）各种溶液应该用缓冲液，PH应调到使酶最稳定的PH3.）各种溶液中还可以加入酶保护剂②建立一个可靠和快速的测活方法方法专一、灵敏、精确、简便、经济③酶原料的选取选择目的酶含量丰富的原料，且要考虑取材方便、经济节约等因素2. 酶的分离纯化 2.1 细胞破碎[2]各种生物组织的细胞具有不同的特点，在采用破碎方法时，要根据细胞的性质，酶的性质来选取合适的破碎方法。
1.）机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
研磨法：用研钵直接研磨。
常用于微生物的微生物材料的破碎。
匀浆法：利用高压匀浆泵、玻璃或Teflon加研棒匀浆器高速球磨机将细胞破碎。
第三章酶的分离纯化演示教学
离子交换纤维素: 是纤维素作为母体，引入相应的交换 基团，蛋白质不容易变性，交换容量大 （0.2-1.0mg/克干胶）
离子交换树脂:
聚苯乙烯Байду номын сангаас脂引入相应的解离基团， 分阴，阳离子交换树脂。 有强酸， 强碱，弱酸，弱碱。
离子交换凝胶: 葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶为母体，导入 相应的交换基团，交换容量更大2.54.5mg/克干胶）
化学稳定性和机械强度更好，应用更大
2020/7/3
作用：浓缩，脱盐等，分级分离
1.3 透析和超过滤
• 透析膜：带有微孔的筛子 • 小于等于20000的大分子通过，更大的分子不
通过。 • 除去酶液的盐、有机溶剂或低分子量的抑制剂 • 超过滤：在0.29 MPa氮气压力下使酶液透过
透析膜。 • 浓缩酶液
• 其他名称：分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻 层析
2020/7/3
• Sephadex(交联葡聚糖）、Bio-Gel(交联聚 丙烯酰胺）
• 酶后期处理（小量试样）
2020/7/3
葡聚糖凝胶操作流程： 1）选择 根据分子量大小范围选择凝胶。
凝胶 如:G50排阻1,500-30,000 （Sephadex） 还有粗，中，细分，细的分辩率高,流速慢；粗的
2020/7/3
聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺聚合而成。
Bio-Gel P-2 数字后面乘1000表示最高排阻分子量 分离生物大分子的范围与葡聚糖凝胶
基本相同
琼脂糖凝胶 水
Sepharose
。
是琼脂去除琼脂胶后得到 D-半乳糖和6-脱
半乳糖相间排列而成。 如：4B即琼脂糖含量占4% 。
另外的商品Bio-Gel A是琼脂糖与丙烯酰 胺交联而成。Bio-Gel CL，比上述二种
第三章 酶工程-酶的分离纯化
March 21, 1903, Meeting of the
Warsaw Society of Natural Scientists, Mikhail Semenovich Tswett presented a lecture entitled "On a New Category of Adsorption Phenomena and its Application in Biochemical Analysis".
一、离心分离
离心是指借助离心机旋转所产生的离心力， 使不同大小和不同密度的物质分离的技术
（一）离心机的种类及用途
1.常速离心机：<8000r/min,<1x104g 2.高速离心机：1x104~2.5x104r/min, 1x104~1x105g 3.超速离心机：2.5x104~8x104r/min, 5x105g
二、酶的提取 在一定的条件下，用适当的溶 剂处理含酶原料，使酶充分溶解到 溶剂中的过程，也称作酶的抽提。 1.盐溶液提取 （一）主要方法 2.酸溶液提取 3.碱溶液提取 4.有机溶剂提取
（二）酶提取过程中的注意事项 1.温度 2.pH 3.提取液的体积 4.添加保护剂
第二节 酶的提取过程中常用的技术
六、酶的结晶
酶以晶体的形式从溶液中析出。 条件： 1.一定的纯度 方法：
2.一定的浓度 3.温度 4.pH 5.离子强度 1.盐析结晶法 2.有机溶剂结晶法 3.渗透平衡结晶法 4.等电点结晶法
六、酶的浓缩与干燥
酶的浓缩：从 低浓度酶液中 除去部分的水 或其他溶剂而 成为高浓度溶 液的过程。
1.离心 2.过滤 3.膜分离 4.沉淀 5.层析 6.蒸发 7.吸水剂及干燥剂的应用
第三章 酶的提取与分离纯化
第三章酶的提取与分离纯化第三章酶的提取与分离纯化第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。
◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。
1.细胞破碎细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。
表1细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。
机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。
1.2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。
(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。
常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。
(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（ cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。
1.3化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。
常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。
1.4酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。
酶工程3酶的分离纯化
医学ppt31来自（III）酶处理用溶菌酶专一性地分解原核微生 物细胞壁，使胞内酶释放
医学ppt
32
（IV）表面活性剂
膜结合的晶酶在细胞破碎后 很难溶解，常借助于表面活性剂 与脂蛋白形成微泡，使之溶解。
医学ppt
33
二、抽 提
—大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此， 可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行 抽提；
mol催化活性是指单位时间内，每个酶
分子所转换的底物分子数目；转换数（Kcat) 是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分
子数目。如果酶分子中只有一个活性中心， 那么mol催化活性与转换数相等，如果酶分 子中含有n个活性中心，那么转换数则为mol 催化活性除以n 。
医学ppt
10
酶的比活力 （specific activity)
20
酶分离的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎片分离
路线一A
溶解(加盐酸胍、脲) 复性
粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 纯化(层析、电泳)
脱盐(凝胶过滤、超过滤)
浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
医学ppt
21
第二节 酶溶液的制备
医学ppt
8
酶活力单位(enzyme activity unit)
表示酶活力大小的尺度；
一个国际单位（IU）是指在特定条件 下（25 0C），每分钟内转化1mol底物或 催化形成1mol产物所需的酶量
一个Kat是指每秒钟内转化1mol底物 所需的酶量，1 Kat = 6107 IU。
医学ppt
9
mol催化活性（分子活性）和 转换数（催化中心活力）
第三章 酶的分离纯化
Partially Purified (50~90% pure)
Crude Protein (1% pure)
A 纯化阶段 B 分析方法
Material Background knowledge about Material
Protein / Activity assay
Extraction
(1) 粗蛋白
球 (glass bead)， 超声波振荡,
目标蛋白质是否确实抽取出來？
Juang RH (2004) ECX
■ 细胞打破之后：
(1) 降低温度 (2) 快速纯化 (3) 避免氧化 (4) 避免吸著 (5) 避免污染
Juang RH (2004) ECX
■
酶 纯 化 阶 段 及 分 析 方 法
Homogeneous (>99%)
● 抽取膜蛋白时須添加 Triton X 等表面活性劑
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.8
极性 非极性
■ 植物材料之特殊问题：
● 细胞壁： 较难打破 ● 叶绿体： 特有的酶 ● 液 泡： 有许多干扰物质
■ 植物的细胞壁问题：
较老组织的細胞壁很难打破
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.54
■ 植物色素在纯化上的问题：
● 色素经常吸附在胶体上难以去除
Scientific American
三章酶的分离纯化
2020/12/23
流程:1）选好多缓冲液和多缓冲交换剂
2）调整起始缓冲液pH上限,用平衡的多缓冲交换剂装柱， 3）调整起始缓冲液pH梯度下限,用下限缓冲液5~10毫升过柱 4）上样品，用这个下限缓冲液洗脱，并分部收集。 5）多缓冲交换剂再生和平衡。 操作
2020/12/23
某种酶的纯化程度根据研究目的而定。
3.2 起始材料的选择
• 不顾及酶的来源时，可选择酶含量高的材料。 • 微生物培养物 • 注意材料的年龄 • 注意在生物体内的富集区域
2020/12/23
3.3 酶的萃取
（处理液应及时处理，否则在均浆上加一薄层甲苯可以防止微生物感染。 ）
（1）膜和细胞壁的破碎：研磨、超声波、高压（注意胞外酶的测定） （2）酶的萃取：萃取液3倍于起始材料
6.再生和储藏 用1mmol/L NaCl洗涤，0.1NHCl洗，用高pH缓
冲
液平衡，放适宜pH的起始缓冲液保存。可以加
2020/12/23
24%乙醇，4℃保存。
快速液相层析（离子交换层析, mono Q ;monoS）： 用于聚焦层析（mono P)
2020/12/23
（3）以溶解度变化为依据
第三章 酶的分离纯化
2020/12/23
3.1 酶纯化的必要性 3.2 起始材料的选择 3.3 酶的萃取 3.4 分离方法 3.5 酶纯化步骤的设计 3.6 纯化步骤的定量评价 3.7 在纯化过程中酶活力的损失
2020/12/23
3.1 酶纯化的必要性
• 生物细胞中同时存在多种多样的酶。 • 酶在生物细胞中的分布并不是均一的。 • 许多酶可能作用于同一个底物。
03酶的分离纯化(酶学)
第二节 酶溶液的制备
把酶从生物原料中抽屉出来，作成酶溶液。酶溶液的 制备包括：材料预处理及细胞破碎、抽提、净化脱 色、抽体液的浓缩等几个步骤。
一、材料预处理及细胞破碎
材料预处理：酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况： 胞外酶，胞内酶（溶酶和晶酶）。微生物胞外酶可 以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥； 胞内酶要先收集菌体，经细胞破碎后提取；动物材 料应先剔除结缔组织和脂肪组织等；植物材料应刻 皮等以免单宁等物质着色污染。
四、酶溶液的浓缩：
冷冻干燥法：先将酶溶液冻成固体，然后在真空状态下使水 分子从固体表面直接升华。 蒸发法：目前工业上采用较多的是薄膜蒸发法，在高度真空 状态下使酶溶液转变为极薄的液膜，通过加热而迅速汽化， 经旋风式汽液分离器达到浓缩的目的。 超过滤法：将酶溶液通过只允许小分子物质通过的微孔滤膜， 大分子的酶蛋白被截留而达到浓缩的目的。 胶过滤法：利用Sephadex G-250或G-50吸水膨胀，而酶蛋白 被排阻在胶的外面。 其它方法：吸水剂如用聚乙二醇(PEG)处理小量样品。
第三章 酶的分离纯化ห้องสมุดไป่ตู้
酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需 的纯度。包括3个基本步骤：抽提，纯化，制剂。在 分离纯化中必须注意：防止酶的变性失活；在分离 纯化过程中的每一步都应检测酶的活性，以确定酶 的纯化程度和回收率。
主要研究内容
第一节 酶活力的测定 第二节 酶溶液的制备 第三节 酶分离纯化的基本过程 第四节 酶分离纯化的方法 一、根据分子大小建立的分离纯化方法 二、根据溶解度建立的分离纯化方法 三、根据电荷性质建立的分离纯化方法 四、根据亲和作用建立的分离纯化方法 五、根据稳定性差异建立的分离纯化方法 第五节 酶的纯度和回收率
酶的分离纯化方法
酶的分离纯化方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1酶的分离纯化方法摘要酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
本文从酶原料选择、酶的分离与纯化、酶纯度的评价三个方面进行总结，列举了一些常用的分离纯化方法。
关键词酶、分离纯化、方法、纯度中图分类号O6酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：一是酶一般取自生物细胞，而特定的一种酶在细胞中的含量很少；二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪，前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。
1 酶原料选择提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
但是由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
2 酶的分离纯化由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。
酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。