病毒灭活去除验证指南
广州病毒杀灭试验流程
广州病毒杀灭试验流程一、实验方法1、在实验室中处理对象样品。
根据对象样品分类，按照临床诊断需要，将相应样本放入实验室进行测试。
2、使用广州病毒杀灭法进行检测。
首先，将样品放入实验室，进行病毒检测，使用广州病毒杀死试剂，将检测出的病毒杀死。
然后，采用真菌杀灭法对样品进行处理，以寻找对象样品中存在的病原体，并根据DNA片段结果，进行具体分类。
3、实施为期两周的持续体外实验，研究病毒的感染性和储存性。
病毒样品在环境温度下存放，在细胞培养液中发酵，连续不断地培养，记录各个培养周期的滴度、颜色和沉淀物情况。
4、用标准病毒样品对试剂进行品质检查，确定试剂的效力和灭活率。
首先，使用标准病毒样品，取出所需的病毒样品，然后测定标准病毒样品中含有的病毒，把病毒放入广州病毒杀死试剂中，同时检查样品中携带的病毒情况，以确定杀灭试剂的杀伤力和灭活率。
5、病毒死亡率测试。
采用病毒杀伤试验计算病毒死亡率，先将试剂与样品接触，然后测定接触时间，同时根据细胞培养中活性病毒的分离数量来计算杀伤力。
二、实验结果1、检测结果显示，使用广州病毒杀灭试剂处理的样品，其病毒滴度及沉淀物较好，对对象样品的检测结果显示可靠，与临床诊断的结论一致。
2、根据实验结果，证实了使用广州病毒杀灭试剂可以有效地检测出病毒样品中存在的病原体，可靠地分类病毒样品，满足临床需求。
3、根据病毒杀伤试验计算，计算出病毒杀伤环境中的病毒死亡率在90%以上，为安全治疗病毒提供了坚实的理论基础。
以上为广州病毒杀灭试验的流程，为临床检测提供便利并提高检测效率，扩大病毒杀伤范围，为安全准确的治疗病毒提供可靠依据。
血液制品去除灭活病毒技术方法及验证指导原则
血液制品去除灭活病毒技术方法及验证指导原则LT血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则目前已知经血液制品传染的病毒主要有HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV和细小病毒B19。
尚未发现经血液制品传染CJD。
但有少数研究报告发现有实验性传染现象，因此要密切关注CJD，特殊是vCJD的发展动向。
为了提高血液制品安全性，生产工艺要具有一定的去除/灭活部份病毒能力，生产过程中应有特定的去除/灭活病毒方法。
本技术指导原则是对血液制品（指以人血浆为原料制备的制品）生产过程以及特定的去除/灭活病毒方法验证的指导原则，包括指示病毒和病毒去除/灭活方法的选择、验证方案的设计、结果判定以及附录所列技术验证申报的程序。
一、去除/灭活病毒方法的选择由于不同类血液制品潜在的污染病毒的可能性不同，为此选择病毒去除/灭活方法的侧重点也应有所不同：（一）凝血因子类制品生产过程中应有特定的能去除/灭活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一种或者多种方法联合去除/灭活病毒。
（二）免疫球蛋白类制品对于免疫球蛋白类制品（包括静脉注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特异性人免疫球蛋白）生产过程中应有特定的灭活脂包膜病毒方法。
但从进一步提高这种制品安全性考虑，提倡生产过程中加入特定的针对非脂包膜病毒的去除/灭活方法。
（三）白蛋白采用低温乙醇生产工艺和特定的去除/灭活病毒方法，如巴斯德消毒法等。
二、常用的去除/灭活病毒方法评价（一）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）1．人血白蛋白制品几十年临床应用结果表明，白蛋白的巴氏消毒法对HIV和肝炎病毒是安全的。
其病毒灭活条件已很完善，可不要求进行病毒灭活验证。
但是必须对巴氏消毒法所用设施进行验证，使巴氏消毒各参数符合要求（包括制品内温度分布的均一性和灭活时间）。
首先，应该选择经血液传播的相关病毒（如：HIV），不能用相关病毒的，要选择与其理化性质尽可能相似的指示病毒；第二，所选择的病毒理化性质应有代表性（病毒大小、核酸类型以及有无包膜），其中至少应包括一种对物理和/或者化学处理有明显抗性的病毒。
病毒灭活去除验证指南
HCV markers
HCV RNA
Anti-HCV
0 10
20 30 40
50 60 70 80 90 100
Days
HIV markers
HIV RNA (plasma) HIV antibody
11 16 22
HIV p24 antigen
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
S/D法(Solvent/Deterdent) IgG、凝血因子、血浆
低pH孵放法(pH4
IgG
incubation)
干热(Dry-heat treatment) 凝血因子
纳米膜过滤法 (Nanofiltration)
凝血因子、 IgG
制造过程 病原体（病毒）灭活和去除
• 血浆蛋白纯化 -去除不需要的蛋白质 -去除潜在的病毒污染 -纯化步骤 乙醇沉淀 乙醇/PEG沉淀 层析/免疫亲和层析 纳米膜过滤
1319无犬细小病毒canineparvovirus猪细小病毒porcineparvovirus病毒灭活与去除的方法1化学方法溶剂去污剂有机溶剂磷酸三丁酯tnbp去污剂tween80tritonx100对脂包膜病毒有效对非脂包膜病毒无效b丙内酯法2光化学方法甲基蓝加上甲基蓝然后进行光照导致灭活临床用血浆mb血浆3物理方法去除纳米膜过滤层析法免疫亲和层析沉淀法酒精硫酸鞍加热灭活干热法冻干终产品蒸汽处理热的水蒸汽巴氏消毒法60c10小时病毒灭活工艺灭活工艺产品类型巴氏消毒法60c10hrpasteurization
1%TNBP和1%TritonX-100， 30℃孵育4小时处理血浆灭活病毒情况
病毒种类
VSV
灭活病毒（log 10） 灭活病毒时间（小
广州病毒杀灭试验标准
广州病毒杀灭试验标准
(1)病毒样本的准备：病毒样本的室温准备方法：1.准备病毒样本，
将病毒样本放置在室温下，避免阳光直射；2.将病毒样本保存在4℃以上，但不超过8℃，可以持续保存2周；3.如果病毒样本长时间无法使用，应
该在−20℃以下制冷保存，最长可以持续保存6个月；4.样本宿主细胞一
般以干冰保存，可以在−80℃以下最长可以持续保存2年或者更长时间。
(2)杀灭试验：1.使用定期消毒剂进行消毒，包括各种消毒剂的池液或者
气体的应用；2.试验时，室温应该在20℃以上，对病毒杀灭效率有较好
的效果；3.试验期间，应控制消毒剂的浓度和接触时间，以及病毒样本的
水分含量；4.根据不同的病毒，应调整杀灭时间和消毒剂浓度，以及最终
消毒剂的残存量；5.杀菌效果最终需要进行荧光定量PCR分析，以确定最
终效果。
血液制品去除灭活病毒技术方法及验证指导原则
血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则目前已知经血液制品传染的病毒主要有HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV和细小病毒B19。
尚未发现经血液制品传染CJD。
但有少数研究报告发现有实验性传染现象，因此要密切关注CJD，特别是vCJD的发展动向。
为了提高血液制品安全性，生产工艺要具有一定的去除/灭活部分病毒能力，生产过程中应有特定的去除/灭活病毒方法。
本技术指导原则是对血液制品（指以人血浆为原料制备的制品）生产过程以及特定的去除/灭活病毒方法验证的指导原则，包括指示病毒和病毒去除/灭活方法的选择、验证方案的设计、结果判定以及附录所列技术验证申报的程序。
一、去除/灭活病毒方法的选择由于不同类血液制品潜在的污染病毒的可能性不同，为此选择病毒去除/灭活方法的侧重点也应有所不同：（一）凝血因子类制品生产过程中应有特定的能去除/灭活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一种或多种方法联合去除/灭活病毒。
（二）免疫球蛋白类制品对于免疫球蛋白类制品（包括静脉注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特异性人免疫球蛋白）生产过程中应有特定的灭活脂包膜病毒方法。
但从进一步提高这类制品安全性考虑，提倡生产过程中加入特定的针对非脂包膜病毒的去除/灭活方法。
（三）白蛋白采用低温乙醇生产工艺和特定的去除/灭活病毒方法，如巴斯德消毒法等。
二、常用的去除/灭活病毒方法评价（一）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）1．人血白蛋白制品几十年临床应用结果表明，白蛋白的巴氏消毒法对HIV和肝炎病毒是安全的。
其病毒灭活条件已很完善，可不要求进行病毒灭活验证。
但是必须对巴氏消毒法所用设施进行验证，使巴氏消毒各参数符合要求（包括制品内温度分布的均一性和灭活时间）。
2．其它血液制品（液体制剂）由于制品的组成、稳定剂（如：氨基酸、糖、枸橼酸盐等）及其浓度的不同，均会对灭活病毒效果有一定的影响。
因此在采用巴氏消毒灭活病毒方法时必须进行病毒灭活效果验证。
病毒灭活验证模版
***注射液病毒灭活工艺验证研究1 “***注射液”生物原材料-**（动物）的病毒污染验证文献综述2 用于生产“***注射液”的生物原材料-**（动物）的病毒感染的检测3 模拟生产工艺条件下对指示病毒的灭活实验1 “***注射液”生物原材料-**（动物）的病毒污染验证文献综述根据现有的研究结果，***（动物）的病毒包括***、***、***、……*种，其中***、***……病毒可感染人类。
以下按***（动物）源性病毒的来源、种类及分布；人体的危害（是否人畜共患）；理化特性；检测方法的次序对各病分述如下：1、***症……2、……附表1 ***（动物）源性病毒的特征病毒名称病毒的分类核酸类型囊膜病毒颗粒大小（nm）***病毒***科***属RNA or DNA 有or 无***~***……附表2 ***（动物）源性病毒的理化性质病毒名称温度耐受性pH耐受性化学物质敏感性***病毒可耐***℃可耐pH*** 能抵抗***，对***敏感……附表3 ***（动物）源性病毒的检测方法病毒名称血清抗体检测方法病毒抗原检测组织样品方法***病毒**** 皮肤、肝、口腔分泌物、粪便等*** ……参考文献1、*****2、2 用于生产“***注射液”的生物原材料-**（动物）的病毒感染的检测1、原理及目的所有用于制药生产的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，为验证“***注射液”的生物原材料-**（动物）种***、***病毒的感染情况，特进行下述实验。
验证以保证生物原材料的安全性。
2、检测方法的选择综前所述，目前已发现的**动物病毒性感染共有*种，其中***、***可感染人。
我们对其中较为重要***、***病毒作为评价***动物病毒感染的指标，进行现场的采样检测，涉及的项目主要是：***抗体检测和病毒抗原检测……3、生物样品的种类及采样方法3.1 血清抗体检测样品在动物饲养场随即抽取生长健康、无疾患，体重在***—***的动物**只，从***采血***ml（无菌操作，置于*ml试管封口4℃保存备用）。
灭活实验操作规程
灭活实验操作规程
《灭活实验操作规程》
一、实验室准备
1. 确保实验室处于干净整洁的状态，消毒工作台和实验用具。
2. 检查灭活试剂的储存情况，确保其有效期和储存条件符合要求。
二、实验操作步骤
1. 戴上实验手套和口罩，确保个人安全。
2. 将待处理的病毒培养物装入离心管中。
3. 在生物安全柜中，将灭活试剂缓慢滴加至病毒培养物中，按比例掺和均匀。
4. 确认灭活试剂与病毒培养物充分混合后，放置在规定的温度和时间条件下进行灭活，同时确保不会造成环境污染。
5. 灭活完成后，取样检测是否彻底灭活，确保病毒已经失去传染性。
三、清洁消毒
1. 将所有使用过的实验用具进行高温高压消毒处理。
2. 按照规定，对工作台和生物安全柜进行彻底清洁消毒。
四、实验记录和报告
1. 记录实验操作步骤和结果，包括灭活试剂的使用量和时间，灭活效果的检测结果等。
2. 完成实验后，及时向上级主管报告实验结果，确保实验过程的透明和规范。
五、安全注意事项
1. 在操作过程中，严格遵守实验室安全操作规程，确保自身和他人的安全。
2. 确保灭活试剂的有效性和正确使用，避免因操作失误导致病毒逸出造成安全事故。
六、环境保护
1. 实验结束后，对实验室进行彻底清洁并进行环境消毒，避免病毒传播造成环境污染。
2. 合理处理实验废弃物、废液和废弃的实验用具，做到妥善处理和分类处置。
以上即为《灭活实验操作规程》，希望实验人员在进行灭活实验时，能够严格遵守规程，确保实验安全和实验效果。
灭菌效果验证方案
灭菌效果验证方案1. 引言灭菌是在医疗领域和实验室中至关重要的过程。
确保灭菌的有效性对于保护患者免受感染以及维持实验的准确性至关重要。
本文档提供了一个灭菌效果验证方案，用于评估灭菌过程的有效性和一致性。
2. 目标本方案的目标是验证灭菌过程的有效性，确保有效灭除细菌、病毒和其他微生物，以保障患者安全和实验的准确性。
验证结果将用于确定灭菌过程是否需要调整或改进。
3. 实验步骤以下是验证灭菌效果的步骤：3.1 选择测试菌株在验证灭菌效果之前，需要选择一种具有代表性的菌株进行实验。
可以选择常见的致病菌，如大肠杆菌（Escherichia coli）或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
确保选择的菌株对灭菌过程具有挑战性。
3.2 准备灭菌设备和材料准备用于灭菌的设备和材料，包括灭菌器、培养基、试验样品（如医疗器械或实验室玻璃器皿）等。
3.3 设计实验组和对照组将实验组分为以下两个组：灭菌组和未灭菌组。
将实验组中的样品置于灭菌器中进行灭菌处理，而未灭菌组中的样品保持原样。
3.4 灭菌处理将实验组中的样品置于灭菌器中，设置适当的温度和时间来完成灭菌过程。
确保灭菌过程符合相关的灭菌标准和要求。
3.5 培养菌株并计数从实验组和未灭菌组中取样品，并在培养基上进行培养，以促进菌落的生长。
培养和计数菌落的方法应符合相关的实验室标准。
3.6 数据分析将实验数据进行统计分析，比较实验组和对照组的菌落计数。
根据结果评估灭菌过程的有效性。
4. 结果与讨论根据菌落计数的结果，可以评估灭菌过程的效果。
如果实验组中的菌落计数明显低于未灭菌组，则可以认为灭菌过程是有效的，并且可以继续使用。
如果实验组和未灭菌组的菌落计数相似，则应重新评估灭菌过程，并可能采取改进措施。
5. 结论本文档提供了一个用于验证灭菌效果的方案，通过实验和数据分析来评估灭菌过程的有效性。
这些验证结果对于保障患者安全和实验准确性至关重要。
在实践中，可以根据具体情况进行调整和改进，以确保灭菌过程的一致性和有效性。
同种异体植入性医疗器械病毒灭活工艺验证指导原则(2020年修订版)
附件4同种异体植入性医疗器械病毒灭活工艺验证技术审查指导原则（2020年修订版）同种异体植入性医疗器械是以同种来源组织为原料加工或组成的产品。
我国目前对同种异体植入性医疗器械产品组织供体的病毒筛选多采用检测血清中病毒特异性抗体或抗原的方法，其中对人免疫缺陷病毒（HIV）还要求检测血液中的病毒核酸。
但是，尽管对供体进行了严格的筛选，仍然存在漏检和未知病毒存在的风险，以及生产过程中带入外源病毒的风险。
因此，要求同种异体植入性医疗器械产品在生产过程中采用有效的病毒灭活工艺，并对病毒灭活工艺的有效性进行科学的验证。
本指导原则是对同种异体植入性医疗器械生产过程中特定病毒灭活工艺的效果进行验证的一般要求，注册申请人应依据具体产品的特性对注册申报资料的内容进行充实和细化，如采用的病毒灭活工艺及相关参数等，并依据具体产品的特性确定其中的具体内容是否适用。
本指导原则是对注册申请人和审评人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。
应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
—1 —本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。
本指导原则为2011年发布的《同种异体植入性医疗器械病毒灭活工艺验证技术审查指导原则》的修订版。
主要修订内容包括：修改指导原则中部分语言描述，如常用病毒灭活方法、染毒方法、病毒灭活效果判定、其他需考虑的问题、病毒灭活工艺的再验证等；完善指示病毒类型选择及举例的相关描述；增加病毒灭活/去除有效性验证的原则。
一、适用范围本指导原则适用于需要对生产过程中特定病毒灭活工艺的效果进行验证的同种异体植入性医疗器械。
二、基本要求（一）常用的病毒灭活方法同种异体植入性医疗器械的病毒灭活有多种方法，企业应根据产品的特性选择合适的病毒灭活工艺。
动物病毒灭活验证报告
-------病毒灭活验证报告文件编号：编制：审核：批准：日期：目录1、目的：确认病毒灭活参数的有效性。
2、范围：------原料。
3、验证依据：《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》4、验证项目：在工艺过程中病毒滴定验证结果：病毒检验5、验证结论：病毒灭活参数有效。
1.目的：所有用于医疗器械生产的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，为验证“-------”的生物原材料----种猪细小病毒、伪狂犬病毒病毒的感染情况，特进行下述实验。
验证确保生物原材料的安全性。
验证依据：《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》2、范围：适用于本公司------产品。
3.职责：3.1技术部负责对病毒灭活验证的组织与实施。
3.2检测中心负责产品的验收及计量、检验器具的检定。
3.3生产部负责协助验证工作的实施。
3.4质量部负责验证档案的存档。
3. 5验证小组成员：3.5.1人员3.5.2时间安排2014年9月10日开始4．程序：4.1“------”生物原材料-----的病毒污染验证文献综述根据现有的研究结果，猪的病毒包括猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪瘟、圆环病毒、口蹄疫、水泡、乙脑等病毒，其中猪细小病毒、伪狂犬病毒可感染人类。
以下按猪源性病毒的来源、种类及分布；理化特性；检测方法的次序对各病分述如下：附表1 猪源性病毒的特征病毒名称病毒的分类核酸类型囊膜病毒颗粒大小（nm）猪细小病毒B19 DNA 无20伪狂犬病毒HBV DNA 有45附表2 猪源性病毒的理化性质病毒名称温度耐受性化学物质敏感性猪细小病毒可耐70℃能抵抗脂溶剂、酸、甲醛蒸汽和紫外线，对漂白粉或氢氧化钠敏感，具有良好的血凝活性。
伪狂犬病毒在37℃下的半衰期为7h，8℃可存活46天，而在25℃干草、树枝、食物上可存活10～30天。
病毒在pH4～9之间保持稳定。
5％石炭酸经2min灭活，但0.5％石炭酸处理32天后仍具有感染性。
对乙醚、氯仿等脂溶剂以及福尔马林和紫外线照射敏感。
血液制品病毒去除灭活验证申报程序
附录血液制品病毒去除/灭活验证申报程序1．国家药品监督管理局授权中国药品生物制品检定所及其它认定的检测实验室进行病毒去除/灭活效果的验证工作。
2．血液制品生产企业应按本技术指导原则的要求对其生产工艺和特定的病毒去除/灭活方法进行验证。
如无条件，可委托其它单位进行去除/灭活病毒效果的验证。
3．血液制品生产企业在完成去除/灭活病毒效果验证后，向中国药品生物制品检定所提出验证申请，并附制品生产工艺、质量标准、病毒灭活方法及其标准操作细则（SOP）、至少中试规模连续生产的三批病毒灭活前中间品（去除/灭活病毒前的样品）及其制造记录等相关资料。
4．中国药品生物制品检定所对生产单位提交的验证申请及相关的技术资料进行审核；对其提供的三批病毒灭活前的中间品进行与病毒去除/灭活方法相关的参数（如：p、蛋白质浓度、水分及稳定剂含量、纯度等）的检测。
5．中国药品生物制品检定所及授权认定的检测实验室对生产单位提交的连续生产的三病毒灭活前的中间品进行病毒灭活方法效果验证。
授权认定的检测实验室在验证完成后将验证结果函告中国药品生物制品检定所。
6．在病毒去除/灭活验证的同时或验证后，中国药品生物制品检定所对申报单位提供的连续生产的三批制品（批号可与病毒验证时报送的制品的批号不同，但必须是采用相同的生产工艺和病毒去除/灭活方法生产的制品）进行全面质量复核（按《中国生物制品规程》及有关的法定标准进行全检，出具检验报告）。
7．采用新的病毒去除/灭活方法时，在资料审查及病毒灭活效果验证结束后，由中国药品生物制品检定所负责组织血液制品和病毒学等方面专家以及包括药品审评中心在内的相关部门的人员参加的技术论证会，对申报的病毒灭活方法进行论证。
8．验证结束后，中国药品生物制品检定所将去除/灭活病毒验证结果、综合评价意见及三批制品检定报告回复申报单位；9．申报单位将申报血液制品拟采用的病毒去除/灭活方法研究资料（包括相关文献）、企业自检报告和中国药品生物制品检定所及授权认定的检测实验室向生产单位提交的病毒去除/灭活方法验证结果、综合评价或论证意见、加入病毒去除/灭活工艺后的制品稳定性考核结果、中国药品生物制品检定所出具的三批制品检定报告等一并上报国家药品监督管理局予以审批。
制药过程中生物技术的病毒灭活与检测方法
制药过程中生物技术的病毒灭活与检测方法生物技术在制药过程中发挥着重要的作用，其中病毒灭活和检测方法是确保药物质量和安全性的重要环节。
本文将从病毒灭活和病毒检测两个方面分别介绍制药过程中生物技术的相关方法。
病毒灭活是指通过物理或化学处理，使病毒失去感染能力的过程。
在制药过程中，病毒灭活是确保生物制品和疫苗安全性的重要环节。
常用的病毒灭活方法主要包括热灭活、化学灭活和辐照灭活。
热灭活是利用高温将病毒颗粒或病毒感染的细胞完全破坏，使病毒失去活性。
常用的方法包括加热、蒸汽灭菌、干热灭菌等。
例如，制备疫苗时，通过将病毒分散液在适当温度条件下加热，以达到病毒灭活的目的。
化学灭活是通过添加化学物质来使病毒失去活性。
常用的灭活剂包括醛类、亚硝酸盐等化学物质。
例如，制作肝炎疫苗时，使用甲醛进行化学灭活，能有效地消除病毒感染性，同时保持免疫原性。
辐照灭活是通过电离辐射或紫外线辐射来杀灭病毒。
电离辐射包括γ射线和X 射线，可穿透性强，对较大浓度病毒具有杀灭作用。
紫外线辐射主要利用其短波长和高能量特点，对病毒DNA进行损伤，导致病毒失去复制和感染能力。
除了病毒灭活，病毒检测也是制药过程中生物技术重要的一环。
病毒检测方法主要包括生物学检测和分子生物学检测两类。
生物学检测主要依靠体外培养细胞或实验动物进行病毒的复制和增殖来证明病毒的存在。
常用的方法包括病毒复制试验、细胞培养和动物实验。
例如，通过接种试验、繁殖后代等方法，可以检测出潜伏在疫苗中的病毒。
分子生物学检测通过检测病毒的核酸或蛋白质来证明病毒的存在。
常用的方法包括聚合酶链反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光染色法等。
例如，使用PCR可以通过直接扩增病毒基因组的特定区域来检测病毒的存在。
总的来说，制药过程中生物技术的病毒灭活和检测方法是确保药物质量和安全性的重要环节。
病毒灭活通过物理或化学处理，使病毒失去感染能力，保证了制药产品的安全性。
而病毒检测则通过生物学和分子生物学的方法，确保制药过程中无病毒污染，提高了药品的质量。
血液制品去除灭活病毒技术方法及验证指导原则-推荐下载
血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则目前已知经血液制品传染的病毒主要有HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV和细小病毒B19。
尚未发现经血液制品传染CJD。
但有少数研究报告发现有实验性传染现象，因此要密切关注CJD，特别是vCJD的发展动向。
为了提高血液制品安全性，生产工艺要具有一定的去除/灭活部分病毒能力，生产过程中应有特定的去除/灭活病毒方法。
本技术指导原则是对血液制品（指以人血浆为原料制备的制品）生产过程以及特定的去除/灭活病毒方法验证的指导原则，包括指示病毒和病毒去除/灭活方法的选择、验证方案的设计、结果判定以及附录所列技术验证申报的程序。
一、去除/灭活病毒方法的选择由于不同类血液制品潜在的污染病毒的可能性不同，为此选择病毒去除/灭活方法的侧重点也应有所不同：（一）凝血因子类制品生产过程中应有特定的能去除/灭活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一种或多种方法联合去除/灭活病毒。
（二）免疫球蛋白类制品对于免疫球蛋白类制品（包括静脉注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特异性人免疫球蛋白）生产过程中应有特定的灭活脂包膜病毒方法。
但从进一步提高这类制品安全性考虑，提倡生产过程中加入特定的针对非脂包膜病毒的去除/灭活方法。
（三）白蛋白采用低温乙醇生产工艺和特定的去除/灭活病毒方法，如巴斯德消毒法等。
二、常用的去除/灭活病毒方法评价（一）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）1．人血白蛋白制品几十年临床应用结果表明，白蛋白的巴氏消毒法对HIV和肝炎病毒是安全的。
其病毒灭活条件已很完善，可不要求进行病毒灭活验证。
但是必须对巴氏消毒法所用设施进行验证，使巴氏消毒各参数符合要求（包括制品内温度分布的均一性和灭活时间）。
2．其它血液制品（液体制剂）由于制品的组成、稳定剂（如：氨基酸、糖、枸橼酸盐等）及其浓度的不同，均会对灭活病毒效果有一定的影响。
因此在采用巴氏消毒灭活病毒方法时必须进行病毒灭活效果验证。
病毒灭活试验
病毒灭活试验病毒灭活试验2.1.1.10.1 适用范围主要适用于消毒产品鉴定或日常监测。
用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技术，评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。
按此方法进行的试验，只是对消毒因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。
2.1.1.10.2 试验器材（1）试验用病毒株：脊髓灰质炎病毒1型（poliovirus-Ⅰ，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒 1 型（HIV-1）美国株。
（2）宿主细胞：可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL 细胞系，作为PV-1的测试细胞。
用含有人T 淋巴细胞白血病病毒 1 型（human T cell leukemiavirus 1，HTLV-1）基因的人淋巴细胞（MT4 株）作为HIV-1的测试细胞。
（3）细胞培养瓶与 96 孔培养板。
（4）恒温水浴箱。
（5）二氧化碳培养箱。
（6）层流超净工作台。
（7）低温冰箱（-20℃，-80℃）。
（8）液氮罐。
（9）倒置显微镜。
（10）离心机。
（11）可调移液器及配套一次性塑料吸头。
（12）细胞维持培养基：见附录A。
（13）细胞完全培养基：见附录A。
（14）去离子水。
2.1.1.10.3 病毒悬液的制备（1）从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心（3000r/min，3min），去上清液。
再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中。
逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。
（2）取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。
逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。
（3）将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或反复冻融）破碎宿主细胞，释放病毒。
病毒灭活验证模版
***注射液病毒灭活工艺验证研究1 “***注射液”生物原材料-**（动物）的病毒污染验证文献综述2 用于生产“***注射液”的生物原材料-**（动物）的病毒感染的检测3 模拟生产工艺条件下对指示病毒的灭活实验1 “***注射液”生物原材料-**（动物）的病毒污染验证文献综述根据现有的研究结果，***（动物）的病毒包括***、***、***、……*种，其中***、***……病毒可感染人类。
以下按***（动物）源性病毒的来源、种类及分布；人体的危害（是否人畜共患）；理化特性；检测方法的次序对各病分述如下：1、***症……2、……附表1 ***（动物）源性病毒的特征病毒名称病毒的分类核酸类型囊膜病毒颗粒大小（nm）***病毒***科***属RNA or DNA 有or 无***~***……附表2 ***（动物）源性病毒的理化性质病毒名称温度耐受性pH耐受性化学物质敏感性***病毒可耐***℃可耐pH*** 能抵抗***，对***敏感……附表3 ***（动物）源性病毒的检测方法病毒名称血清抗体检测方法病毒抗原检测组织样品方法***病毒**** 皮肤、肝、口腔分泌物、粪便等*** ……参考文献1、*****2、2 用于生产“***注射液”的生物原材料-**（动物）的病毒感染的检测1、原理及目的所有用于制药生产的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，为验证“***注射液”的生物原材料-**（动物）种***、***病毒的感染情况，特进行下述实验。
验证以保证生物原材料的安全性。
2、检测方法的选择综前所述，目前已发现的**动物病毒性感染共有*种，其中***、***可感染人。
我们对其中较为重要***、***病毒作为评价***动物病毒感染的指标，进行现场的采样检测，涉及的项目主要是：***抗体检测和病毒抗原检测……3、生物样品的种类及采样方法3.1 血清抗体检测样品在动物饲养场随即抽取生长健康、无疾患，体重在***—***的动物**只，从***采血***ml（无菌操作，置于*ml试管封口4℃保存备用）。
动物病毒灭活验证报告
5.2得出病毒灭活速率和灭活曲线。
5.3确定预定去除/灭活病毒效果的参数及允许变化的幅度。
5.4确定指示病毒滴度。
5.5加入的病毒与待验证样品体积比不高于1∶9。
5.6验证过程中每步取出的样品直接进行病毒滴定。
6.工艺参数的确定
6.1对确定的参数进行试模。
6.2确认的工艺参数及相关文件由技术部汇总存档。
4.3.1细胞毒性测定，用 2 m o l / L 氢氧化钠溶液把酸性液态胶原 p H 调至中性 , 将 p H 3 . 0 的酸性溶液和中性溶液进行倍比稀释后加 入到细胞中 , 用 M T T 染色法测定其对细胞的毒性作用 。 4.3.2酸性酶解溶液灭活病毒工艺 取定量的酸性液态胶原 , 按 9∶ 1 的比例分别加入 P R V 、 V S V 、P V 1和 P P V 指 示 病 毒 , 混 匀 后 立 即 取 部 分 样 品 用 2m o l / L 氢氧化钠溶液进行中 和 , 根据细胞毒性测定结果选择样品稀释度作为病毒灭活的起始病毒 滴度 。其余样品分别于 0 . 5、 2、 6、 24、 48、 7 2 h 取样测病 毒残留滴度 , 计算病毒灭活对数值 ( L g T C I D 50 / m l ) 。 4.3.3 60C o - γ 射线辐照灭活病毒工艺 取定量的液态胶原蛋白 , 按 9: 1 的比例分别加入 P R V 、 V S V 、P V 1 和 P P V 指示 病毒 , 混匀后先取出部分样品作为液体对照 , 并测定起始病毒滴度 。 剩余样品分装成5 m l / 瓶进行冷冻干燥 , 取出 2 瓶冻干品作为 对照 。将冷冻干燥的瓶装胶原蛋白经 10-15 k G y 剂量 的电子束射 线辐照灭活病毒处理 ( 绍兴华能电子加速器有限公司) 。 辐照后的样 品溶解后测病毒残留滴度 , 对照样品则根据细胞毒性测定结果选择样 品稀释度作为病毒灭活的起始病毒滴度 , 计算病毒灭活对数值 。 4.3.4 存活病毒滴度测定 采用微量细胞病变法 。试验样品经 1 0倍系列稀释后加入已接种细胞的 96孔培养板中 , 每个稀释度做 8 孔 重复 。将培养板置37℃ 二氧化碳孵箱内培养 72 h ( 接种 P P V 的 P K-15 培 养 1 20 h ) , 在 光 镜 下 观 察 细 胞 病 变 效 应( C P E ) , 根据 K a r b e r 氏法计算病毒滴度。 4.3.5 免疫荧光染色法检测 P P V 将 P P V 接种于P K- 15 细胞 中 , 培养 120 h 后 , 用抗 P P V 荧光抗体对细胞进行直接免疫荧光 抗体试验, 按照抗体说明书要求进行操作 。 4.3.6 细胞盲传 病毒灭活后的样品均以高浓度加入细胞中做细 胞盲传 3 代培养 , 观察是否出现细胞病变 。 在细胞盲传 3 代的全
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浓缩血小板处理
• 方法： 高浓度的需氧致病菌和革兰氏阳性菌 （10种）、革兰氏阴性菌（7种）、螺旋 菌（2种）加到浓缩血小板中（3.0×1011
- 6.0×1011 ），150umol/L补骨脂和 3J/cm2 UVA的照射
150umol/L补骨脂和 3J/cm2 UVA的照射 （血小板）
细菌 表皮葡萄球菌 金黄色葡萄球菌
最终选定条件
• 10%蛋白浓度 • 16mM辛酸盐 • pH4.5 • 30℃以上放孵10小时
验证结果
• HIV＞5.5 log • BVDV ＞4.7 log • Sindbis＞7.1 log • PRV ＞4.9 log
优点
• 稳定剂，安全可靠 • 与S/D 法比较，对某些病毒灭活速度快
NAT/PCR 缩短“窗口期”
病毒核酸
宿主对病毒的抗体
数量
感染的时间
血清学窗口期 NAT/PCR 窗口期
PCR 可检测 病毒
血清学试验可 检测抗体
PCR 检测可缩短窗口期
时间
HBV markers
HBV DNA (PCR)
Infection
anti-HBc HBsAg
ALT
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
HCV
RNA
有
人类免疫缺陷病毒
HIV 1
RNA
有
1 和2
HIV 2
甲型肝炎病毒
HAV
RNA
无
微小病毒 B19 新出现的病毒
B19
DNA
无
缩写
核酸类型
包膜
西尼罗河病毒
WNV
RNA
有
冠状病毒 (SARS)
SARS-CoV
RNA
有
猴痘病毒
MPXV
DNA
有
病毒的选择
病毒 HIV HBV HCV HAV
B19
沙雷氏菌 大肠埃希菌
密螺旋体 包柔氏螺旋体菌
灭活量（Log 10） ＞6.6 ＞6.6 ＞6.7 ＞6.4 ＞6.8 ＞6.9
150umol/L补骨脂和 3J/cm2 UVA的照射 （血浆）
病毒 DHBV HBV HCV BVDV HIV HIV（细胞内）
灭活量（Log 10） 5.4
≥4.5 ≥4.5 ≥6.7 ≥5.9
病毒灭活与去除的方法
1、化学方法 • 溶剂/去污剂
-有机溶剂磷酸三丁酯（TNBP） -去污剂Tween-80,Triton X-100 -对脂包膜病毒有效，对非脂包膜病毒无效 • β-丙内酯法 2、光化学方法 • 甲基蓝 -加上甲基蓝 -然后进行光照，导致灭活 -临床用血浆“MB-血浆”
病毒灭活与去除的方法
1.补骨脂处理新鲜冰冻血浆
• 补骨脂：豆科补骨脂属植物补骨脂的成 熟果实。2000版中国药典收载
• 化学成分：香豆精类补骨脂素，也叫补 骨脂内酯
• 光敏感剂 • 补骨脂S-59：补骨脂素盐酸衍生物
补骨脂S-59作用原理
• 补骨脂S-59在长波紫外线的光化学处理 下，在DNA嘧啶基中形成链中交联，从 而抑制DNA的合成
• 第二种机理 间接作用，生产自由基和其它活性物质， 作用蛋白质和核酸
2.3、2.8、3.0mRad分别处理冻干 产品
品种
保留活性%
人纤维蛋白原
93
FVIII
67
α1-API
80
4.碘
• 是强氧化剂 • 游离碘 • 结合到聚合物（聚乙烯咯烷酮、淀粉、
葡聚糖），结合碘逐渐释放，灭活需几 小时 • 碘/葡聚糖处理IVIG，灭活PPV＞4Log， • IVIG结构和功能未变，蛋白质未发生碘 化
5.巴氏消毒新鲜冰冻血浆
• 稳定剂：1300g/L山梨醇、514g/L蔗糖、 4mM葡萄糖酸钙、15mM枸橼酸钠、 5g/L精氨酸
• 60℃、10小时 • 保存80-90%凝血因子活性 • 透析去除稳定剂
病毒灭活剂-辛酸盐
• 原理：非离子化的辛酸分子能进入病毒 包膜，并破坏包膜脂质层或破坏嵌入在 包膜脂质层的蛋白质，从而影响病毒脂 包膜的完整性。在低pH条件下，辛酸盐 呈最大的非离子化形式，从而能达到最 佳的灭活病毒的效果。
≥ 14.1 ≥ 14.1
Source: Aventis Behring, Virology – Data on file
HAV CPV
4.1 3.5 ≥ 6.8 1.2 ≥ 10.9 4.7– 46 –
IVIG用巴氏消毒法灭活伪狂犬病毒 (PRV)
Virus Titre [CCID50 log10]
包膜 指示病毒
有 HIV
有 鸭乙肝病毒(Duck HBV)、伪狂犬病毒 (Pseudorabies virus)
有 BVDV、Sindbis病毒
无 HAV、脊髓灰质炎病毒(Polio virus)、 脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus)
无 犬细小病毒(Canine parvovirus)、猪细小 病毒(Porcine parvovirus)
1%TNBP和1%TritonX-100， 30℃孵育4小时处理血浆灭活病毒情况
病毒种类
VSV
灭活病毒（log 10） 灭活病毒时间（小
时）
≥7.5
0.25
Sindbis virus
≥6.9
0.25
Duck hepatitis B
≥7.3
2.5
virus
BVDV
≥6.1
0.25
HIV
≥7.2
0.25
免疫球蛋白
白蛋白:
20%人白蛋白
生产步骤
血浆
冷沉淀
1. 乙醇沉淀法 2. 乙醇沉淀法
(38% and 40% 乙醇) 透析 / 填充 巴氏消毒法 20%人白蛋白 总减少因数
病毒平均减少因数 (log10)
HIV 1 BVDV
PRV
≥ 5.1 ≥ 6.7 ≥ 11.8
≥ 5.3
≥ 6.6
≥ 8.8
≥ 7.5
S/D法(Solvent/Deterdent) IgG、凝血因子、血浆
低pH孵放法(pH4
IgG
incubation)
干热(Dry-heat treatment) 凝血因子
纳米膜过滤法 (Nanofiltration)
凝血因子、 IgG
制造过程 病原体（病毒）灭活和去除
• 血浆蛋白纯化 -去除不需要的蛋白质 -去除潜在的病毒污染 -纯化步骤 乙醇沉淀 乙醇/PEG沉淀 层析/免疫亲和层析 纳米膜过滤
关键
离心
EEE
吸附 沉淀 巴氏消毒法 层析法 过滤
制造过程
孔氏法
混合血浆
生产步骤
E EE
冷沉淀
E EE
E EE
8% 沉淀 组分 I)
25% 沉淀 组分 II + III)
40% 沉淀 组分 V)
最终蛋白质
VIII因子:
纤维蛋白原
IX因子: PCC: C1-抑制物:
XIII因子: 抗凝血酶 III:
20-60倍 • 不影响蛋白质的生物学活性 • 得率提高
二.我国对血液制品病毒去除/灭 活验证的管理
病毒灭活/去除(Viral inactivation
and removel)-1
• 为了做好血液制品病毒去除/灭活工作，卫生部 下发了〔卫药政发（1994）第264号〕文。此 文对去除/灭活病毒方法及检测效果作了相应规 定。
指导原则内容包括
• 去除/灭活病毒方法的选择 • 常用的去除/灭活病毒方法的评价 • 特定的去除/灭活病毒方法的选择 • 特定的去除/灭活病毒方法的验证 • 生产工艺去除/灭活病毒能力的验证 • 附录：技术验证申报程序
血浆制品相关病毒传播
名称
缩写核酸类型包膜源自乙型肝炎病毒HBV
DNA
有
丙型肝炎病毒
8
7
6
5
4 3
PRV
2
1
0
-1
检测极限
0
2
4
6
8
10
Treatment time [h]
FVIII用S/D法灭活伪狂犬病毒 (PRV)
Virus Titre [CCID50 log10]
6
5
4
3 PRV
2
1
0
-1
检测极限
3、物理方法 • 去除
-纳米膜过滤 -层析法（免疫亲和层析） -沉淀法（酒精、硫酸铵） • 加热灭活 -干热法（冻干终产品） -蒸汽处理（热的水蒸汽） -巴氏消毒法（60℃、10小时）
病毒灭活工艺
灭活工艺
产品类型
巴氏消毒法(60 ℃、10hr) 白蛋白、IgG、凝血因子 （Pasteurization）
1uM 亚甲基兰和1小时白光照射处理血浆灭活病毒情况
病毒种类 VSV SIV
Semliki forest virus HSV
West Nile virus Sindbis virus
BVDV HIV (细胞外) HIV(细胞内)
Dock HBV HAV
灭活（log 10） 5.0 ≥6.3 ≥7.0 ≥5.5 ≥6.5 ≥9.7 ≥5.0 ≥6.3 0 3.9 0
6.4
2.UVC光照射
• UVC光照射直接作用核酸 • 含单股核酸的病毒更敏感 • HAV和细小病毒更敏感 • 有效灭活非脂包膜病毒和耐热、耐酸病
毒（脊髓灰质炎病毒II型、 T4噬菌体和 牛痘）
0.1 或 0.2J/cm2 UVC的照射-白蛋白 （0.8 或1.6mM芸香苷）
0.05 或 0.1J/cm2 UVC的照射-IVIG （0.5 或1.0mM芸香苷）